劉艷蘭 - 劉 爽 林本平 - 李燕云 - 易翠平 -

(1. 長沙理工大學化學與食品工程學院，湖南 長沙 410114；2. 湖南省雜糧健康食品工程技術研究中心，湖南 長沙 410100)

膳食纖維具有促進胃腸道健康、防治肥胖癥和降低心血管疾病發(fā)病率等益生功能[1]。根據其在水溶液中的溶解度可分為可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維[2]。水溶性膳食纖維具有增稠性、乳化性和益生元等功能特性，可以作為功能性食品配料應用于多種食品中[3]。水不溶性膳食纖維能夠吸收食物中的有害物質，弱化消化道中細菌排出的毒素，還可增加食物通過消化道的速率，幫助通便[4]。

米糠是一種重要的膳食纖維來源，通常采用物理、化學或酶水解的方法去除米糠的淀粉、蛋白質和油脂提取米糠膳食纖維，但這樣提取出的米糠膳食纖維的功能性質較差。目前已有學者[5-6]利用纖維素酶改善米糠膳食纖維的功能性質，但利用纖維素酶處理米糠膳食纖維同時制備可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維還未見相關報道，可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維的化學成分和表面結構與其理化性質的作用關系報道也較少。試驗擬探討纖維素酶水解米糠膳食纖維的工藝條件對可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維得率的影響，并分析纖維素酶水解前后膳食纖維的化學成分、表面結構、持油力和吸附膽酸鈉能力的差異，以期為米糠高附加值產品的開發(fā)提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

米糠：金健米業(yè)股份有限公司；

α-高溫淀粉酶(4 000 U/g)、堿性蛋白酶(200 U/mg)、淀粉葡萄糖苷酶(200 U/mg)和纖維素酶(400 U/mg)：上海瑞永生物有限公司；

其他化學試劑：分析純，國藥集團化學試劑(上海)有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫培養(yǎng)振蕩器：HNY-200D型，天津歐諾儀表有限公司；

紫外分光光度計：TU1810型，北京普析通用儀器有限責任公司；

冷凍干燥機：FD-1-50型，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 米糠膳食纖維的制備 1 000 g米糠經石油醚脫脂，在高速分散機中于4 000 r/min處理60 min后，經40目篩水洗過濾得到水洗后的米糠，于60 ℃烘干后放置于干燥器中。將200 g水洗后的絕干米糠在200 U/gα-高溫淀粉酶，95 ℃反應1 h后，將pH調至8.0～8.2；加入50 U/g的蛋白酶，50 ℃反應1 h，調pH至4.2～4.4；加入120 U/g淀粉葡萄糖苷酶，60 ℃反應1 h，沸水浴滅酶20 min，用4倍體積的95%乙醇沉淀，過濾，60 ℃烘箱中干燥24 h得到米糠膳食纖維。

1.3.2 纖維素酶水解米糠膳食纖維 將米糠膳食纖維加入到含有纖維素酶的pH 4.6的醋酸—醋酸鈉緩沖液中，改變纖維素酶用量、反應時間和料液比，探討水解條件對不溶性膳食纖維和可溶性膳食纖維得率的影響。反應結束后將樣品取出，沸水浴滅酶20 min，抽濾，濾渣分別用體積分數為78%和95%的乙醇(4倍體積濾渣)洗2次，丙酮(4倍體積濾渣)洗一次，60 ℃烘箱中干燥12 h得到不溶性膳食纖維；用95%乙醇沉淀濾液中的多糖，冰箱冷凍過夜后，冷凍干燥48 h得到可溶性膳食纖維。分別按式(1)和式(2)計算可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維得率。

(1)

(2)

式中：

IDF——米糠不溶性膳食纖維得率，%；

SDF——米糠可溶性膳食纖維得率，%；

m1——絕干濾渣的質量，g；

m2——絕干濾液沉淀物的質量，g；

m——絕干纖維素酶水解前米糠膳食纖維的質量，g。

1.3.3 米糠膳食纖維基本成分測定

(1) 淀粉含量：按GB 5009.9—2016執(zhí)行。

(2) 蛋白質含量：按GB 5009.5—2016執(zhí)行。

(3) 木質素含量：按GB/T 2677.8—1994執(zhí)行。

(4) 半纖維素含量：按GB/T 2677.9—1994執(zhí)行。

(5) 纖維素含量：參照文獻[7]略做修改，稱取1 g樣品放在錐形瓶中，加入硝酸—乙醇混合液，沸水浴中反應1 h后過濾，濾渣再在沸水浴中加熱1 h后過濾直至纖維變白。

1.3.4 膽酸鈉吸附能力測定

(1) 膽酸鈉標準曲線的繪制：分別準確稱量膽酸鈉0，10，20，40，60，80，100 mg置于50 mL容量瓶，用蒸餾水溶解并定容。移取各個不同濃度的膽酸鈉標準液1 mL 于15 mL具塞試管中，加入6 mL 45%的H2SO4，混勻后加入1 mL 0.3%糠醛，65 ℃恒溫水浴中反應30 min，冷卻至室溫后，于620 nm處測吸光度，以膽酸鈉量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。膽酸鈉吸附率的標準曲線方程：y=0.008 9x+0.058 5，R2=0.993 9。

(2) 樣品測定：采用糠醛比色法[8]。量取100 mL 0.15 mol/L 的NaCl溶液(含有0.2 g膽酸鈉)于250 mL錐形瓶中，加入0.5 g纖維樣品于錐形瓶中攪拌，在恒溫震蕩培養(yǎng)器中于37 ℃反應2 h，到達時間后離心20 min，準確移取1 mL于620 nm處測定其吸光度，并計算膽酸鈉含量，根據反應前后的含量差計算膽酸鈉吸附率。

1.3.5 持油力測定 依據許暉[3]的方法略做改進：準確稱取0.5 g膳食纖維樣品置于25 mL離心管，加入10 mL 玉米油，室溫放置30 min并不時攪動，4 000 r/min離心30 min，棄去上層油液，用濾紙吸干管壁上的水分和油脂，靜置5 min，稱重。按式(3)計算持油力。

(3)

式中：

OHC——持油力，g/g；

M1——絕干膳食纖維樣品的質量，g；

M2——沉淀膳食纖維樣品的質量，g。

1.3.6 掃描電鏡分析 在氮氣環(huán)境下，用離子濺射法在干燥后的纖維樣品表面蒸鍍一層10～20 nm的鉑金膜后通過掃描電子顯微鏡對纖維樣品進行觀測拍照。

1.3.7 單因素試驗

(1) 纖維素酶用量：固定料液比(m米糠纖維∶V水) 1∶15 (g/mL)，水解時間5 h，反應溫度60 ℃，考察纖維素酶用量(20，40，60，80，100，120 U/g)對可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維得率的影響。

(2) 水解時間：固定纖維素酶用量100 U/g，料液比(m米糠纖維∶V水) 1∶15 (g/mL)，反應溫度60 ℃，考察水解時間(3，4，5，6，7 h)對可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維得率的影響。

(3) 料液比：固定纖維素酶用量100 U/g，水解時間5 h，反應溫度60 ℃，考察料液比(m米糠纖維∶V水)[1∶8，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 (g/mL)]對可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維得率的影響。

1.3.8 統(tǒng)計分析 所有試驗平行測定3次，數據結果以平均值±標準方差表示，采用SPSS 17.0對數據進行方差分析和顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 纖維素酶用量對膳食纖維得率的影響

由圖1可以看出，當纖維素酶用量從20 U/g增加到100 U/g時，不溶性膳食纖維得率顯著減小(P<0.05)，可溶性膳食纖維得率顯著增加(P<0.05)。說明隨著纖維素酶用量的增加，米糠膳食纖維的水解程度逐漸提高。當纖維素酶添加量為100 U/g時，可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維得率分別為79.11%和6.56%；當纖維素酶添加量超過100 U/g后，可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維得率無顯著變化。纖維素酶對米糠膳食纖維的水解作用主要是使其細胞壁纖維素大分子上的1,4-β-糖苷鍵斷裂，使結晶區(qū)的纖維素降解生成無定形區(qū)的纖維素和可溶性的低聚糖從細胞壁中溶解出來[9]，得到可溶性膳食纖維。因此隨著纖維素酶用量的增加，其與細胞壁的反應性能增加，導致其水解后得到的不溶性膳食纖維得率減少，可溶性膳食纖維得率增多。由于纖維素酶與細胞壁的反應位點數目是一定的，增加纖維素酶用量也不會出現更多的反應位點與其吸附結合，因此過量的纖維素酶不會造成膳食纖維的細胞壁被進一步降解[10]。因此，纖維素酶用量應當控制在100 U/g。

2.2 酶解時間對膳食纖維得率的影響

由圖2可知，當纖維素酶用量為100 U/g時，米糠膳食纖維的水解程度隨反應時間的增加而增大，不溶性膳食纖維得率顯著下降(P<0.05)，可溶性膳食纖維得率顯著增加(P<0.05)。當反應5 h時，不溶性膳食纖維得率為79.66%，可溶性膳食纖維得率為6.40%。當反應時間超過5 h后，可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維得率無顯著變化。在纖維素酶水解反應中，隨著反應時間的延長，產物濃度不斷增加，反應底物濃度不斷降低，這兩個因素會抑制纖維素酶水解反應的持續(xù)高效進行，從而使米糠膳食纖維的水解程度基本保持不變。因此纖維素酶的水解時間應當控制在5 h。

同一曲線小寫字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)圖1 纖維素酶用量對米糠不溶性膳食纖維和可溶性膳食纖維得率的影響

同一曲線小寫字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)圖2 酶解時間對米糠不溶性膳食纖維和可溶性膳食纖維得率的影響

2.3 料液比對膳食纖維得率的影響

由圖3可以看出，與纖維素酶用量和反應時間相比，料液比對米糠不溶性膳食纖維和可溶性膳食纖維得率影響較小。當料液比(m米糠纖維∶V水)達到1∶15 (g/mL)后，繼續(xù)增加水用量，米糠不溶性膳食纖維和可溶性膳食纖維得率無顯著變化，可能是因為增加溶劑水，使酶的濃度降低，酶反應速率變慢，所以米糠膳食纖維的水解程度變化不大。試驗中，米糠膳食纖維與酶反應的料液比較大，可能是因為酶反應過程中，米糠膳食纖維粉末吸收了較多的水分引起潤漲，從而消耗了部分水。為了保證酶水解反應的順利進行，需要較大的料液比，但是過大的料液比會導致反應時間延長和能耗增加，所以料液比(m米糠纖維∶V水)宜選用1∶15 (g/mL)。

2.4 米糠膳食纖維化學成分

水洗米糠經過a-高溫淀粉酶、堿性蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶水解后制備得到米糠膳食纖維。按纖維素酶用量100 U/g，反應時間5 h，料液比(m米糠纖維∶V水)1∶15 (g/mL) 的制備工藝條件水解米糠膳食纖維得到米糠不溶性膳食纖維和可溶性膳食纖維，將米糠不溶性膳食纖維、可溶性膳食纖維和纖維素酶水解前的米糠膳食纖維進行化學成分、表面結構和功能性質的測定。表1表明水解前的米糠膳食纖維原料的纖維素、半纖維素和木質素含量為75.16%。Wen等[11]報道米糠膳食纖維的纖維素、半纖維素和木質素含量為56.4%～76.2%。與未經過纖維素酶水解的米糠膳食纖維原料相比，水解后米糠不溶性膳食纖維的纖維素、半纖維素、蛋白質和淀粉含量顯著下降(P<0.05)，木質素含量顯著上升(P<0.05)。纖維素酶是一種含有少量半纖維素酶的復合酶，半纖維素酶使米糠膳食纖維的半纖維素發(fā)生了降解反應，因此米糠膳食纖維的半纖維素含量在水解反應后下降。在膳食纖維細胞壁結構中，蛋白質和纖維素交織纏繞在一起[12]，蛋白質隨纖維素的降解溶出從細胞壁中溶解出來，所以纖維素酶水解后，米糠膳食纖維的蛋白質含量也下降。Ansharullah等[12]報道膳食纖維細胞壁中的纖維素和蛋白質的連接鍵可以被纖維素酶水解，使蛋白質從細胞壁中溶解出來，導致蛋白質含量下降。

同一曲線小寫字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)

表1 米糠膳食纖維的化學成分分析?

2.5 米糠膳食纖維表面結構

如圖4所示，未進行纖維素酶水解的米糠膳食纖維表面呈網絡狀的纖維結構，并且有孔洞。與未水解的米糠膳食纖維比較，經纖維素酶水解后的米糠不溶性膳食纖維表面出現較多且較深的孔洞結構，并且其比表面積也增加了。說明米糠膳食纖維經過纖維素酶水解后，由于纖維素的降解溶出導致了其表面結構的改性。米糠可溶性膳食纖維的表面致密光滑，無明顯的孔洞結構。有研究[13]表明，膳食纖維的表面結構對于膳食纖維的功能性質，特別是吸附性質起著非常重要的作用。因此可以預測不同表面結構的米糠膳食纖維的持油力和吸附膽酸鈉能力是不同的。

圖4 米糠膳食纖維的掃描電鏡圖Figure 4 The SEM photograph of rice bran dietaryfiber (×1 000)

2.6 持油力

通常來說，具有高持油力的膳食纖維有利于在食品加工過程中吸附食品的油脂從而降低食品的油脂含量。在人體的生理功能性質上，膳食纖維能夠通過吸收腸道內的油脂從而降低血清的膽固醇水平[14]。從圖5可以看出，纖維素酶水解前后的米糠不溶性膳食纖維的持油力較高，高于橙子膳食纖維的(1.81 g/g)和蘋果膳食纖維的(1.45 g/g)[15]。纖維素酶水解后的米糠不溶性膳食纖維的持油力顯著(P<0.05)高于未水解的。纖維素酶水解前的米糠膳食纖維和水解后的不溶性膳食纖維的持油力高，可能是因為其含有較高含量的木質素。Navarro-González等[14]報道西紅柿膳食纖維中較低的持油力是由其較低的木質素含量造成的。Sosulski等[16]也發(fā)現木質素含量高的膳食纖維種類持有較高的持油力。同時從圖5也可以看出，經纖維素酶水解后制得的可溶性膳食纖維持油力較低，只有(0.82±0.13) g/g。黃冬云[17]制得的米糠可溶性膳食纖維的持油力也較低，為(0.89±0.10) g/g。米糠可溶性膳食纖維的持油力低，是因為可溶性膳食纖維的化學成分主要是多糖，其木質素含量很少。另一方面，從米糠膳食纖維的微觀結構圖(圖4)可以看出，與未進行纖維素酶水解處理的米糠膳食纖維相比，纖維素酶水解后的不溶性膳食纖維的表面結構更加疏松，同時也出現了更多的孔洞和毛細管結構，并且其比表面積增加。米糠可溶性膳食纖維表面光滑致密，無明顯的孔洞結構，比表面積也是最小的。前人[11-13,18]研究表明：多孔且表面結構疏松的固體對于液體的吸附能力要高于表面結構致密且少孔洞的固體。因此，米糠不溶性膳食纖維的持油力顯著(P<0.05)高于可溶性膳食纖維的；纖維素酶水解后的米糠不溶性膳食纖維的持油力顯著(P<0.05)高于水解前的米糠膳食纖維。

小寫字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)圖5 米糠膳食纖維種類對持油力的影響Figure 5 The oil holding capacity of rice brandietary fiber

2.7 吸附膽酸鈉能力

圖6顯示，米糠膳食纖維原料、不溶性膳食纖維和可溶性膳食纖維都具有吸附膽酸鈉的能力，其中可溶性膳食纖維的膽酸鈉吸附率最低。錢海峰等[5]也研究發(fā)現可溶性膳食纖維比不溶性膳食纖維吸附膽酸鈉的能力低。米糠可溶性膳食纖維對膽酸鈉的吸附結合能力低，是因為米糠可溶性膳食纖維持油力低(圖5)，且米糠可溶性膳食纖維的化學成分主要是多糖，水溶解性較高；也有可能是因為米糠可溶性膳食纖維的表面結構光滑又致密(圖4)，限制了其對膽酸鈉的吸附能力。圖6的研究結果也表明纖維素酶改性后的米糠不溶性膳食纖維吸附膽酸鈉的能力要高于未改性的米糠膳食纖維。從米糠膳食纖維的表面結構圖(圖4)可以看出，與未進行纖維素酶水解處理的米糠膳食纖維相比，纖維素酶水解后的不溶性膳食纖維的表面結構更加疏松，同時也出現了更多的孔洞和毛細管結構，且其比表面積增加。米糠可溶性膳食纖維的表面結構光滑致密，無明顯的孔洞結構，比表面積也是最小的。前人[11-13]研究表明：多孔且表面結構疏松的物質其吸附能力要高于表面結構致密且少孔洞的物質。Caroline等[19]發(fā)現用果膠酶和纖維素酶混合處理后的羽扇豆籽膳食纖維結合膽酸鹽的能力要高于未處理產品，也說明了酶水解造成的膳食纖維細胞壁的降解可以提高膳食纖維結合膽酸鹽的能力。

小寫字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)圖6 米糠膳食纖維種類對膽酸鈉的吸附率Figure 6 The absorption rate of rice bran dietary fiberto sodium cholate

3 結論

與料液比相比，纖維素酶用量和反應時間可以顯著影響米糠可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維得率。纖維素酶水解后，米糠膳食纖維的纖維素、半纖維素、蛋白質和淀粉含量明顯下降，木質素含量明顯上升?？扇苄陨攀忱w維的表面結構致密光滑，無明顯的孔洞結構；水解前的膳食纖維和水解后的不溶性膳食纖維的表面均出現了網絡狀的疏松多孔結構，且水解后得到的不溶性膳食纖維表面出現更多且更深的孔洞結構，并且其比表面積也增加了。水解前的米糠膳食纖維和水解后的不溶性膳食纖維對膽酸鈉的吸附能力顯著高于可溶性膳食纖維。不溶性膳食纖維的持油力顯著高于可溶性膳食纖維；纖維素酶水解后的米糠不溶性膳食纖維的持油力顯著高于未水解前的米糠膳食纖維。不同種類米糠膳食纖維持油力和吸附膽酸鈉能力的差異是由其化學成分和表面結構的差異造成的。膳食纖維的功能性質和其化學結構的關系還有待于進一步的深入研究。