李志芳 - 佐兆杭 - 王 穎,2,3,4 ,2,3,4 張 裕 王 迪

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2. 國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；3. 糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江 大慶 163319；4. 黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 大慶 163319)

蕓豆又名四季豆[1]，在中國種植廣泛，已成為栽培面積僅次于黃豆的豆類農(nóng)作物[2]。蕓豆中含有多種活性物質(zhì)，如其特有的α-淀粉酶抑制劑可有效改善胰島素抵抗并增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力[3-5]；蕓豆抗性淀粉可增加飽腹感為身體供能，減慢血糖上升速度，同時具有預(yù)防腸癌的作用[6-7]。大豆作為主糧之一，除能提供基本的營養(yǎng)元素外，還含有大豆異黃酮、潛在活性肽、多酚等多種功能性物質(zhì)[8-10]，綜合價值較為全面。

豆類植物含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)及多種功能性成分，經(jīng)發(fā)酵后的植物原液含有豐富的次級代謝物、維生素、礦物質(zhì)以及多種功效酶類、抗氧化物質(zhì)、有機(jī)酸、香氣成分等[11-12]，能夠滿足消費(fèi)者一次攝入補(bǔ)充多種營養(yǎng)的品質(zhì)需求。目前市場上的發(fā)酵產(chǎn)品主要以果蔬類、小麥、大豆、米胚芽等植物原料為主，在原料的選擇上存在單一性，以雜豆復(fù)配主糧形式制備的復(fù)合植物發(fā)酵液尚未有成形的研究成果，從膳食多樣性的角度來說，復(fù)配形式的組合發(fā)酵是一種新的思路。試驗(yàn)擬將蕓豆、大豆按比例進(jìn)行共同發(fā)酵，主要研究復(fù)合植物發(fā)酵液在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物及抗氧化活性的變化規(guī)律，初步探究復(fù)合發(fā)酵的優(yōu)勢所在，以期為豆基植物類發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紫花蕓豆：黑龍江墾區(qū)；

大豆、白砂糖：市售；

安琪牌活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)菌庫；

嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；

耐高溫α-淀粉酶(20 000 U/mL)、糖化酶(10 000 U/mL)：上海源葉生物科技有限公司；

ABTS自由基測試試劑盒：南京建成生物工程研究所；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、福林酚(10%)、無水乙醇、碳酸鈉、葡萄糖、氯化鐵、3,5-二硝基水楊酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁等：分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

料理機(jī)：JYL-Y912型，九陽股份有限公司；

pH計(jì)：S220型，瑞典波通儀器公司；

臺式高速離心機(jī)：TG16-WS型，常州金勝儀器制造有限公司；

超凈工作臺：BCV-6S1型，浙江賽德儀器設(shè)備有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DRP-9082型，上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司；

紫外分光光度計(jì)：V-5100B型，上海元析儀器有限公司；

高溫壓力蒸汽滅菌器：YXQ-30SII型，濟(jì)南捷島分析儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程及操作要點(diǎn)

蕓豆、大豆去皮清洗→打漿→液化→糖化→離心→滅菌→接種→發(fā)酵→后發(fā)酵

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酵母菌、乳酸菌

(1) 菌種活化：取體積分?jǐn)?shù)為10%的液態(tài)保藏的植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌菌液于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；活性干酵母于10倍體積蒸餾水中溶解，30～35 ℃水浴活化30 min。

(2) 清汁的發(fā)酵：蕓豆、大豆清洗后去皮，按料液比(m蕓豆和大豆∶V蒸餾水)1∶3 (g/mL)打漿?？刂泼附鈼l件：α-淀粉酶添加量200 μL/100 mL、pH 6.0、酶解溫度97 ℃、時間20 min；糖化酶加酶量200 μL/100 mL、pH 4.5、溫度60 ℃、時間30 min。漿液于10 000 r/min離心15 min。調(diào)清汁pH至5.0、裝瓶量30 mL、糖添加量8%，滅菌。冷卻后接種酵母菌，32 ℃恒溫振蕩24 h進(jìn)行預(yù)發(fā)酵，按V植物乳桿菌∶V嗜酸乳桿菌為1∶1(共同發(fā)酵)接種植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌，恒溫發(fā)酵24 h。4 ℃后發(fā)酵并保藏備用。

1.2.2 pH值測定 使用精密pH計(jì)。

1.2.3 總酸含量測定 參照GB/T 12456—2008。

1.2.4 還原糖含量測定 采用3, 5-二硝基水楊酸比色法。

1.2.5 可溶性固形物含量測定 使用手持折光儀。

1.2.6 總酚含量測定 采用Folin-Ciocalteus法[13]。

1.2.7 黃酮含量測定 采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[14]。

1.2.8 發(fā)酵過程中還原力測定 參照文獻(xiàn)[15]。

1.2.9 發(fā)酵過程中ABTS自由基清除率測定 使用ABTS自由基試劑盒。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)操作，所有數(shù)據(jù)用x±s表示。采用Origin 8.0等軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值和總酸含量變化

由圖1可知，發(fā)酵液pH隨發(fā)酵時間的延長而不斷降低，總酸含量則有所上升。發(fā)酵8～32 h，pH由3.83降至3.58，下降較明顯，說明該階段菌種產(chǎn)酸速率較快，至發(fā)酵結(jié)束pH穩(wěn)定在3.55左右，總酸含量可達(dá)0.43 mg/mL。復(fù)合發(fā)酵過程中pH值和總酸的變化趨勢與李璐等[16]的研究結(jié)果一致，可能是因?yàn)榻湍妇诎l(fā)酵初始階段大量增殖，在氧氣充足的情況下可通過糖酵解和三羧酸循環(huán)途徑將發(fā)酵液中的糖類物質(zhì)氧化成CO2和水，而當(dāng)氧氣缺乏時，酵母菌會利用葡萄糖大量合成乙醇及CO2，CO2溶于水產(chǎn)生弱酸性的碳酸使發(fā)酵液pH下降。此外，微生物消耗原料中的碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)并在相關(guān)酶的作用下可發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、檸檬酸等有機(jī)酸，尤其當(dāng)乳酸菌大量增殖成為優(yōu)勢菌種時可水解蛋白質(zhì)形成游離氨基酸，能夠進(jìn)一步增加產(chǎn)酸量同時降低環(huán)境pH。發(fā)酵后期，由于代謝產(chǎn)物、pH值等因素抑制，菌種發(fā)酵逐步進(jìn)入穩(wěn)定期，此時pH值及總酸含量趨于穩(wěn)定。

圖1 發(fā)酵過程中pH值、總酸含量變化Figure 1 Changes in pH value and total acid contentduring fermentation

2.2 可溶性固形物含量變化

由圖2可知，發(fā)酵過程中可溶性固形物含量隨發(fā)酵時間的延長持續(xù)下降并趨于穩(wěn)定，經(jīng)48 h發(fā)酵后，發(fā)酵液中可溶性固形物含量由10.01%降低至5.73%?？扇苄蕴强蔀槲⑸锷L繁殖提供穩(wěn)定的碳源，由于清汁在液化及糖化階段積累了豐富的可溶性糖使發(fā)酵初始階段營養(yǎng)物質(zhì)充足，微生物生長建立了優(yōu)勢菌群，生長繁殖快，因此可溶性固形物的利用速率快，前期可溶性固形物下降趨勢較為明顯[17-18]。發(fā)酵后期微生物生長狀態(tài)趨于穩(wěn)定，對可溶性糖的利用也隨之趨于平緩。這與邢金金等[19]探究不同菌種發(fā)酵對酵蜜桃酵素可溶性固形物含量的變化趨勢一致。

2.3 還原糖含量變化

經(jīng)繪制葡萄糖標(biāo)曲為y=2.422 1x-0.147 4，R2=0.996 1，換算得還原糖含量如圖3所示。由圖3可知，還原糖含量在發(fā)酵過程中呈先下降后保持波動平衡的狀態(tài)。發(fā)酵初始階段，酵母菌大量消化葡萄糖、果糖等還原糖用于自身生長繁殖，使基質(zhì)中的還原糖含量迅速下降。接種乳酸菌后，發(fā)酵液中的葡萄糖、果糖等游離糖有利于其自身的增殖代謝，乳酸菌會分泌β-半乳糖苷酶等水解酶分解生成乳糖、葡萄糖和半乳糖，加上菌種發(fā)酵產(chǎn)生的淀粉酶能夠?qū)⒌矸鬯獬蛇€原糖[20]，兩者共同作用使發(fā)酵液中還原糖含量有所上升，但也存在糖酵解過程使葡萄糖分解轉(zhuǎn)化為乳酸致使還原糖含量下降[21]，因此后期發(fā)酵處于上下波動狀態(tài)，還原糖含量維持在8.25 mg/mL附近。

圖2 可溶性固形物含量的變化Figure 2 Changes in soluble solids content

2.4 總酚含量變化

經(jīng)繪制沒食子酸(0～250 μg/mL)標(biāo)曲回歸方程為y=0.004 8x-0.015 7(R2=0.997 3)。由圖4可知，總酚含量在發(fā)酵過程中先迅速上升，后穩(wěn)定在430 mg/mL左右，與楊小幸等[22]研究蘋果酵素天然發(fā)酵過程中總酚含量變化趨勢相符。分析變化原因可能是：首先從原料角度分析，多酚含量與種皮顏色有一定的關(guān)聯(lián)，王何柱等[23]研究表明：7種蕓豆的總酚含量為0.91～4.96 mg/g，深色蕓豆的總酚含量明顯高于淺色蕓豆；其次體系內(nèi)酚類物質(zhì)的釋放與微生物作用相關(guān)，乳酸菌在發(fā)酵過程中，內(nèi)源酶系作用會使豆類植物細(xì)胞中的結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)游離出來[24]，使其含量上升；此外發(fā)酵環(huán)境中的高糖濃度會升高體系滲透壓，有利于酚類物質(zhì)的溶出。發(fā)酵后期酚類含量略微下降，可能是部分生存能力較強(qiáng)的微生物逐漸適應(yīng)總酚濃度較高的發(fā)酵液環(huán)境，利用酚類物質(zhì)合成其他次級代謝產(chǎn)物從而導(dǎo)致總酚類物質(zhì)含量略微下降[25-26]。

圖3 還原糖含量變化Figure 3 Changes inreducing sugar content

圖4 總酚含量變化Figure 4 Changes in total phenol content

2.5 黃酮類物質(zhì)含量變化

由圖5可知，發(fā)酵過程中黃酮類物質(zhì)呈先持續(xù)升高后趨于穩(wěn)定的趨勢，在發(fā)酵16～32 h增長最為迅速，分析可能存在的原因有：① 微生物發(fā)酵過程中，與不溶性纖維結(jié)合的黃酮類化合物被釋放出來，使黃酮類物質(zhì)含量有所上升。同時乳酸菌產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶可以將黃酮苷轉(zhuǎn)化為黃酮苷元，導(dǎo)致黃酮苷元含量增加，此狀態(tài)下的異黃酮更容易被吸收利用。有研究[27-28]表明，發(fā)酵后的豆制品中苷元形式的異黃酮含量顯著增加，而糖苷型異黃酮則明顯下降，說明發(fā)酵作用有利于增強(qiáng)大豆異黃酮的可吸收性及功能利用率。② 酵母菌在厭氧條件下生成乙醇，有利于黃酮類物質(zhì)的溶解。③ 酵母菌及乳酸菌代謝產(chǎn)生的酶系作用能夠?qū)⒉糠痔荚次镔|(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢园l(fā)生顯色反應(yīng)的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)[29]，使發(fā)酵液黃酮含量顯著上升。

圖5 黃酮類物質(zhì)含量變化Figure 5 Changes in flavonoids content

2.6 還原力變化

由圖6可知，還原力隨發(fā)酵時間的延長不斷上升，至發(fā)酵結(jié)束還原力可達(dá)0.608，相較于未接種益生菌時，其還原力提升了2倍左右，與范昊安等[30]在研究蘋果梨酵素發(fā)酵過程中的還原力變化趨勢相一致。這可能是除酵母菌的細(xì)胞壁多糖具有一定的抗氧化能力外，乳酸菌的自身代謝產(chǎn)物及其菌體表面同樣有抗氧化物質(zhì)存在[31]，并且這兩種菌均可通過產(chǎn)生NADH氧化酶、超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-Px等過氧化酶類物質(zhì)清除體內(nèi)活性氧[32]。

2.7 ABTS自由基清除能力變化

由圖7可知，發(fā)酵16～32 h時ABTS自由基清除能力顯著提高，至發(fā)酵結(jié)束時ABTS清除能力可達(dá)3.404 mmol/L，相比發(fā)酵前提升了85.6%。這可能是隨發(fā)酵時間的延長，代謝產(chǎn)生的小分子酚酸類物質(zhì)增多，而酚羥基具有供氫體活性，在氧化過程中可以作為主要的還原部位與自由基反應(yīng)，使其自身形成的自由基得以穩(wěn)定，從而阻斷自由基鏈的反應(yīng)，以此來增強(qiáng)體系抗氧化物能力。

圖6 發(fā)酵過程中還原力的變化Figure 6 Changes in reducing power duringfermentation

圖7 發(fā)酵過程中ABTS自由基清除能力的變化Figure 7 Changes of ABTS free radical scavengingability during fermentation

3 結(jié)論

試驗(yàn)探究了蕓豆、大豆復(fù)合發(fā)酵液發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物及抗氧化活性的變化情況，結(jié)果表明，各理化指標(biāo)隨發(fā)酵時間的延長存在一定的規(guī)律性：pH值呈持續(xù)下降的趨勢，總酸含量變化趨勢與之相反；發(fā)酵過程中還原糖含量先小幅度上升后處于動態(tài)穩(wěn)定，發(fā)酵48 h時可溶性固形物穩(wěn)定至5.73%；總酚和黃酮類物質(zhì)含量總體呈上升趨勢，至發(fā)酵結(jié)束趨于穩(wěn)定；發(fā)酵過程中還原力及ABTS自由基清除能力逐步增強(qiáng)并于發(fā)酵結(jié)束時達(dá)到最大值。以上規(guī)律可清晰地反映復(fù)合發(fā)酵過程中相關(guān)理化指標(biāo)變化趨勢及功能性物質(zhì)的累積情況，說明酵母菌及乳酸菌的協(xié)同發(fā)酵作用有利于蕓豆及大豆中活性物質(zhì)的釋放，并可有效提升發(fā)酵液的抗氧化能力。由于時間及條件的限制，對復(fù)合發(fā)酵液其他功能的挖掘還存在一定的局限。復(fù)合發(fā)酵液的菌群調(diào)節(jié)作用能夠抑制腸道致病菌的定植并重塑腸道微生物物種構(gòu)成，可在一定程度上防止脂肪及糖代謝異常誘發(fā)的2型糖尿病，其降糖機(jī)理的深度探究對擴(kuò)大產(chǎn)品受益人群具有一定的價值，而更多的功能性開發(fā)還需要不斷的深入研究。