龐浩然 - 解加慶 - 關(guān)其鋒 - 孟曉宇 - 孫汝千 - 周福陽 -

(西北農(nóng)林科技大學(xué)機(jī)械與電子工程學(xué)院，陜西 咸陽 712100)

亞硝酸鹽是食品中常見的有害物質(zhì)，廣泛分布在腌制肉制品和泡菜內(nèi)。蔬菜中硝酸鹽因?yàn)榧?xì)菌的生長也容易轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，成人一次攝入亞硝酸鹽含量>0.2 g即可引起中毒[1]，攝入量>3 g即有致死危險(xiǎn)，此外，長期過量攝入亞硝酸鹽還會(huì)大幅度增加致癌風(fēng)險(xiǎn)。目前，亞硝酸鹽的檢測方法有分光光度法、催化光度法、催化熒光法、離子色譜法、稱量滴定法、高壓離子色譜法等[2-3]，這些方法普遍存在檢測成本高、預(yù)處理時(shí)間長、檢測精度低、操作繁瑣或設(shè)備龐大等缺陷。

亞硝酸鹽可以使對(duì)氨基苯磺酸重氮化，產(chǎn)物遇到鹽酸萘乙二胺時(shí)可生成紫紅色偶氮染料。因此，可以配置相應(yīng)檢測試劑，對(duì)食品中亞硝酸鹽進(jìn)行定性檢測。由于反應(yīng)生成的紫紅色偶氮染料性質(zhì)穩(wěn)定，通過精確檢測反應(yīng)物顏色變化，也可以實(shí)現(xiàn)亞硝酸鹽濃度定量檢測?；谝陨显?，李新民等[4]制作了一種基于顏色檢測的亞硝酸鹽傳感器，檢測成本低，但檢測周期設(shè)定為1 h，檢測時(shí)間長。該傳感器將數(shù)據(jù)上傳到網(wǎng)絡(luò)服務(wù)端，更適用于工業(yè)檢測領(lǐng)域。Hou等[5]制備了一種基于紙基微流控芯片的亞硝酸鹽檢測儀，將拍攝的反應(yīng)結(jié)果通過WiFi傳輸至自主開發(fā)的手機(jī)軟件得出試驗(yàn)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了檢測結(jié)果的遠(yuǎn)程輸送，檢測試劑使用減少且提高了檢測精度。但其紙基微流控芯片需通過蠟印技術(shù)制備，且只能使用一次，檢測成本較高。Thinikan等[6]基于蜂蠟制備了一種綠色環(huán)保的紙基微流控芯片，用于硝酸鹽和亞硝酸鹽的檢測，亞硝酸鹽和硝酸鹽的檢出限分別為0.1，0.4 mg/L。但該紙基芯片制備前，需先將CTAB與熔化的蜂蠟進(jìn)行加熱、均質(zhì)化處理7 min，并冷卻至室溫。處理材料時(shí)間過長，不利于紙基微流控芯片的制備。肖良品等[7]制作了一種用于亞硝酸鹽快速檢測的三維紙質(zhì)微流控芯片，基于紙基芯片的檢測方法簡單便用、穩(wěn)定性好，但最低檢測濃度還有待進(jìn)一步降低。此外，檢測結(jié)果的獲取需先拍攝圖片再使用軟件分析，結(jié)果產(chǎn)生時(shí)間較長。綜上，微流控芯片對(duì)于快速精準(zhǔn)低成本的亞硝酸鹽檢測具有實(shí)踐意義，并且紙基微流控芯片具備檢測精度高、檢測試劑少等優(yōu)勢，但仍存在檢測成本高，檢測預(yù)處理時(shí)間長等問題。

為實(shí)現(xiàn)食品中亞硝酸鹽的高效靈敏快速檢測，試驗(yàn)擬開發(fā)一種便攜式、低成本、高精度的亞硝酸鹽檢測儀，采用高效混合微流控芯片進(jìn)行進(jìn)樣混合反應(yīng)，并利用自主搭建的光電檢測系統(tǒng)測量亞硝酸鹽濃度，為便攜式亞硝酸鹽濃度檢測提供依據(jù)。

1 微混合芯片的設(shè)計(jì)與仿真

1.1 顯色反應(yīng)原理

亞硝酸鹽含量的檢測是基于格里斯試劑比色法原理[8]，其檢測原理如圖1所示。

圖1 格里斯試劑比色法反應(yīng)原理Figure 1 Principle of grice reagent colorimetry

1.2 混合微流控芯片設(shè)計(jì)與仿真

微混合芯片由于通道尺度小，可以大幅度降低檢測樣品的消耗[9]，降低檢測成本。檢測過程中反應(yīng)溶液混合完全是保證檢測精度和檢測效率的重要前提，而微流控芯片入口處流體的流動(dòng)屬于層流，且雷諾數(shù)極低[10]。因此，為提高芯片的混合效率，通常設(shè)計(jì)具備縮擴(kuò)和彎折微通道結(jié)構(gòu)，將層流破壞為湍流，提高雷諾數(shù)?；谝陨戏治觯O(shè)計(jì)混合微流控芯片三維結(jié)構(gòu)(見圖2)。芯片集成了溶液通入、混合、檢測和流出功能，分為2個(gè)通道入口、1條混合通道、1個(gè)檢測用蓄液池和1個(gè)通道出口4部分。通道入口1通入亞硝酸鈉和對(duì)氨基苯磺酸的混合溶液，通道入口2通入鹽酸萘乙二胺溶液，在混合通道中進(jìn)行溶液混合，在蓄液池中完成顯色反應(yīng)，最終經(jīng)通道出口流出。為方便封接和實(shí)現(xiàn)微量混合，將微流控芯片總尺寸設(shè)計(jì)為長75 mm，寬25 mm，高2 mm，通道截面尺寸為高500 μm，寬900 μm。此外，在微混合芯片的通道側(cè)設(shè)計(jì)200 μm高的凸臺(tái)，以保證芯片封接密閉性。

1. 通道入口 2. 凸臺(tái) 3. 混合通道 4. 蓄液池 5. 膠合平面 6. 通道出口

為預(yù)測設(shè)計(jì)的芯片對(duì)檢測試劑混合效果的影響，在制備芯片前先采用多場耦合軟件COMSOL對(duì)反應(yīng)液體在芯片通道內(nèi)的混合過程進(jìn)行有限元分析，以便預(yù)測混合通道對(duì)反應(yīng)液的混合效果。仿真中引入蠕動(dòng)流和稀物質(zhì)傳遞耦合場分析，并采取靜態(tài)隱式計(jì)算方法。流體的質(zhì)量和動(dòng)量傳遞機(jī)制采取描述不可壓縮流體行為的Navier-Stokes方程進(jìn)行模擬，其表達(dá)式為:

(1)

(2)

式中：

ρ——密度矢量；

ui、uj——流體的速度矢量；

學(xué)界好論朱子晚年之論，卻不知象山也有晚年之論。晚年之象山一改中年之學(xué)風(fēng)，內(nèi)外兼修，再無偏頗之弊。須知晚年象山最大的兩件事，一是要注經(jīng)立說，二是要處理荊門軍政，此兩者皆側(cè)重外王事業(yè)，可見其當(dāng)時(shí)的心境與思想已有所轉(zhuǎn)變。實(shí)則晚年陸九淵之學(xué)術(shù)思想已與朱子無大異，若能哲人多壽，自能會(huì)同一致。但以陸九淵晚年之生平與文獻(xiàn)而言，已能見其會(huì)同之規(guī)模與梗要。

P——流體壓力，N；

τij——應(yīng)力張量，Pa。

質(zhì)量通量由擴(kuò)散和對(duì)流給出，其質(zhì)量平衡方程可表達(dá)為:

(3)

式中：

c——反應(yīng)液體濃度，mol/m3。

顯色反應(yīng)溶液中溶質(zhì)的擴(kuò)散率由擴(kuò)散系數(shù)D決定[11]：

(4)

式中：

K——玻耳茲曼常數(shù)；

T——絕對(duì)溫度，K；

μ——?jiǎng)討B(tài)黏度，Pa·s；

r——分子半徑，nm。

在所有參與顯色反應(yīng)的溶液中，鹽酸萘乙二胺、對(duì)氨基苯磺酸和亞硝酸根的分子量大小分別為259.20，173.19，46.00。其中，鹽酸萘乙二胺分子量最大，由擴(kuò)散系數(shù)D可得其擴(kuò)散率最低。因此，只要保證鹽酸萘乙二胺在微流道截面內(nèi)混合完全就可以確定所有參與反應(yīng)的溶液、溶質(zhì)在混合芯片通道內(nèi)得到充分混合。混合指數(shù)是指芯片微流道不同截面上混合物擴(kuò)散濃度最值的標(biāo)準(zhǔn)差，其計(jì)算式為[12]：

(5)

式中：

Ci——當(dāng)前統(tǒng)計(jì)截面的鹽酸萘乙二胺最值濃度，mol/L；

N——統(tǒng)計(jì)截面的選取濃度數(shù)量，mol/L；

由式(5)可知，截面濃度最值差距越小，混合指數(shù)越小，混合越均勻。對(duì)仿真得到的混合通道內(nèi)鹽酸萘乙二胺的混合指數(shù)進(jìn)行分析，在混合通道水平截面上建立坐標(biāo)系并選擇截面，截面沿通道方向間隔2 mm，截面選擇起點(diǎn)為混合通道起點(diǎn)，初始鹽酸萘乙二胺濃度為518.4 mol/L，液體注射速度為1.67×10-5mol/m3?；旌闲酒瑑?nèi)不同位置混合液濃度變化分布規(guī)律如圖3所示，微通道截面上混合指數(shù)隨微通道位置變化關(guān)系如圖4所示，在該流速下混合芯片可以實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)液體的高效混合。

2 微流控芯片的制備與封接

為提高芯片的制備效率，降低制備成本，采用光固化3D打印機(jī)制備混合微流控芯片[13]。該打印機(jī)由平臺(tái)、Z軸、材料槽、顯示屏幕和LCD液晶屏幕組成。固化部件在固化過程中附著在平臺(tái)上，Z軸控制平臺(tái)運(yùn)動(dòng)，光敏樹脂放置在材料槽內(nèi)，光源的入射位置可以通過LCD液晶屏幕控制。為保證芯片的透光度，采用透明光敏樹脂(中國深圳諾華智能科技有限公司)打印制備混合微流控芯片[14]。經(jīng)調(diào)試后，打印機(jī)的打印參數(shù)如表1所示[15]。

圖3 芯片微通道內(nèi)鹽酸萘乙二胺濃度分布云圖

圖4 微通道截面上混合指數(shù)隨微通道位置變化關(guān)系

對(duì)打印出的芯片進(jìn)行測試，將芯片沿通道截面切開，獲取截面形狀尺寸見圖5，其通道寬度為516.8 μm，通道高度為882.1 μm，尺寸誤差為1.29%，滿足使用要求[16]。

使用α-氰基丙烯酸乙酯和75 mm×25 mm的載玻片對(duì)打印出的微混合芯片進(jìn)行封接[17]。將α-氰基丙烯酸乙酯均勻涂抹在芯片表面的膠合平面，并將凸臺(tái)和載玻片相互擠壓。在壓力的作用下，凸臺(tái)結(jié)構(gòu)與載玻片緊密結(jié)合，膠合平面上的α-氰基丙烯酸乙酯呈均勻分布，并且在空氣中微量水蒸氣的催化下發(fā)生加聚反應(yīng)[18]，迅速固化而將被黏物粘牢。膠水和玻璃均具備優(yōu)良的透光性，可以保證封接后芯片的光學(xué)特性。

表1 光固化工藝參數(shù)

圖5 截面形狀尺寸Figure 5 Section shape and size

3 光電檢測系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與搭建

采用自行搭建的光電檢測系統(tǒng)對(duì)亞硝酸鹽濃度進(jìn)行定量檢測[19-22]。光電檢測系統(tǒng)包括LED恒定光源6、PVS精密電壓源3、PCS恒流源驅(qū)動(dòng)1和PDV探測器4(見圖6)。為保證檢測精度，系統(tǒng)外殼采取不透光的黑色樹脂制備，整體密封以保證檢測過程中無雜光影響。另外，LED恒定光源、混合微流控芯片蓄液池和PDV探測機(jī)探頭位置需穩(wěn)定處于同一條光路上。

LED恒定光源6由PCS恒定電流源1驅(qū)動(dòng)，由PVS精密電壓源3穩(wěn)定電壓，恒定光源通過微混合器2的蓄液池，經(jīng)光線通路5被PDV探測器4探頭接收，并輸出電壓值。亞硝酸鹽濃度對(duì)蓄液池中顯色反應(yīng)的顏色變化深淺有影響，進(jìn)而影響LED恒定光源輸出至PDV探測器的光照強(qiáng)度，最終影響PDV探測器輸出電壓，根據(jù)輸出電壓和檢測亞硝酸鹽濃度的線性關(guān)系，可以實(shí)現(xiàn)由誘導(dǎo)電壓對(duì)亞硝酸鹽的精準(zhǔn)檢測。

4 亞硝酸鹽濃度與誘導(dǎo)電壓的對(duì)應(yīng)關(guān)系

使用移液槍分別移取1 mL質(zhì)量濃度為1 g/L的亞硝酸鹽溶液，用等離子水分別稀釋至0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00 mg/L。分別取500 μL亞硝酸鈉溶液與500 μL質(zhì)量濃度為4 g/L的對(duì)氨基苯磺酸溶液混合，將混合溶液與1 000 μL質(zhì)量濃度為2 g/L的鹽酸萘乙二胺溶液分別從混合微流控芯片的兩個(gè)入口通入，待其在蓄液池中反應(yīng)3 min后，記錄PDV探測器的輸出電壓值。

1. PCS恒流源驅(qū)動(dòng) 2. 微混合器 3. PVS精密電壓源 4. PDV探測器 5. 光線通路 6. LED恒定光源 7. 藍(lán)牙模塊

將亞硝酸鹽濃度和對(duì)應(yīng)的電壓值進(jìn)行擬合，得回歸曲線表達(dá)式為y=4.532 2-0.143 9x，R2為0.996 7。

配置12份質(zhì)量濃度為1 mg/L的亞硝酸鹽溶液測量該光電檢測儀的檢出限，每次進(jìn)樣500 μL，所測結(jié)果分別為1.02，1.01，1.04，0.99，0.97，1.02，0.98，0.98，1.02，0.97，0.97，1.07，標(biāo)準(zhǔn)差為0.032 0，多次測量平均值為1.003 3 mg/L，檢出限為0.095 7 mg/L，可滿足日常便攜檢測要求[23-24]。

5 實(shí)際檢測試驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析

通過設(shè)計(jì)泡菜中亞硝酸鹽濃度的檢測試驗(yàn)，與分光光度法檢測結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證該亞硝酸鹽光電檢測方法的可行性。

分別配置質(zhì)量濃度為0.00，0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，1.00，1.50，2.00，2.50 mg/L的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL，使用分光光度計(jì)測量標(biāo)準(zhǔn)顯色液在538 nm處的吸光值，將亞硝酸鹽質(zhì)量濃度和對(duì)應(yīng)吸光值進(jìn)行擬合，得線性關(guān)系表達(dá)式為y=0.410 6x+0.001 4，R2=0.999 5。

吸取5 mL泡菜澄清提取液于比色管中，分別加入2 mL質(zhì)量濃度為4 g/L的對(duì)氨基苯磺酸溶液和質(zhì)量濃度為2 g/L的鹽酸萘乙二胺溶液，用蒸餾水定容至10 mL，混勻靜置10 min。測得吸光值為0.515，經(jīng)計(jì)算比色管中提取液的亞硝酸鹽濃度為0.213 mg/L，泡菜樣本中亞硝酸鹽濃度為2.13 mg/L[25-27]。

取500 μL泡菜澄清提取液與500 μL質(zhì)量濃度為4 g/L的對(duì)氨基苯磺酸溶液混合，將混合溶液與1 000 μL質(zhì)量濃度為2 g/L的鹽酸萘乙二胺分別從混合微流控芯片的兩個(gè)入口通入，待其在蓄液池中混合3 min后，記錄PDV探測器的輸出電壓值為4.467 V，根據(jù)亞硝酸鹽含量與誘導(dǎo)電壓關(guān)系曲線得泡菜澄清提取液中亞硝酸鹽質(zhì)量濃度為0.454 mg/L，泡菜中亞硝酸鹽質(zhì)量濃度為2.27 mg/L，與分光光度法檢測結(jié)果的差值為0.14 mg/L，誤差較小。因此，該搭載微混合芯片的光電檢測儀可用作食品中亞硝酸鹽濃度的定量快速檢測。

6 結(jié)論

研究提供了一種搭載微混合芯片的食品中亞硝酸鹽含量便攜式光電檢測方法，對(duì)食品中亞硝酸鹽殘留進(jìn)行高精度的快速檢測。通過光固化技術(shù)制備了滿足尺寸要求的高混合效率的微混合芯片，并搭建了相應(yīng)的光電檢測系統(tǒng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，基于微流控芯片的光電檢測系統(tǒng)的最低檢出限為0.095 7 mg/L，最快檢出時(shí)間為3 min，可滿足食品中亞硝酸鹽的檢測需求。研究中光電檢測系統(tǒng)的檢測電壓值區(qū)間范圍偏小，對(duì)檢測精度產(chǎn)生不利影響，后續(xù)可對(duì)光電檢測系統(tǒng)中的PDV探測器進(jìn)行改進(jìn)，以進(jìn)一步提高探測精度。