肖佳音，李慶忠

黑龍江省藥品檢驗研究中心，黑龍江 哈爾濱 150088

GB/T 14233.2-2005《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 第2 部分：生物試驗方法》［1］是我國現(xiàn)行的醫(yī)用輸液、輸血、注射器具的國家推薦標準，是我國醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢測的重要技術依據(jù)，為保障該類醫(yī)療器械的臨床使用安全起到了至關重要的作用。GB/T 14233.2-2005 是在GB/T 16886《醫(yī)療器械生物學評價》和《中國藥典》兩部分內(nèi)容的基礎上，結(jié)合醫(yī)用輸液、輸血、注射器具的特性制定的，筆者認為基本上合理，但仍兩處需進一步完善。

1 細菌內(nèi)毒素試驗

GB/T 14233.2-2005 中細菌內(nèi)毒素試驗要求按《中國藥典》［2］細菌內(nèi)毒素檢查法中的“凝膠法”規(guī)定進行。推薦輸液、輸血、注射器具細菌內(nèi)毒素限量每件不超過20 EU，與腦脊液接觸和胸內(nèi)應用醫(yī)療器械每件不超過2.15 EU。

凝膠法是通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應的原理進行限度檢測或半定量檢測內(nèi)毒素的方法，包括凝膠限度試驗和凝膠半定量實驗［3］。當檢測結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠限度試驗結(jié)果為準［4］。凝膠法系通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝膠反應的原理，通過觀察有無凝膠形成作為反應的終點，是一種限度試驗。使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度。按照《中國藥典》2020 版四部細菌內(nèi)毒素凝膠限度試驗檢查法規(guī)定，當試驗結(jié)果顯示陰性時，判定供試品中的細菌內(nèi)毒素含量小于規(guī)定的限值；而當試驗結(jié)果顯示陽性時，判定供試品中的細菌內(nèi)毒素含量大于或等于限值。也就是說，使用細菌內(nèi)毒素凝膠法，當出現(xiàn)陽性結(jié)果時，實際上是無法區(qū)分究竟是大于限值還是等于限值的。而GB/T 14233.2-2005 判定結(jié)果中描述的“不超過”包含小于和等于兩層含義，而“等于”凝膠限度試驗無法觀察到的。筆者認為應將限值修訂為“推薦輸液、輸血、注射器具細菌內(nèi)毒素限量每件應小于20 EU，與腦脊液接觸和胸內(nèi)應用醫(yī)療器械每件應小于2.15 EU”。

2 細胞毒性試驗

GB/T 14233.2-2005 中細胞毒性試驗主要依據(jù)GB/T 16886.5-2003《醫(yī)療器械生物學評價 第5 部分：體外細胞毒性試驗》［5］制定的，GB/T 16886.5 已于2018 年7 月1 日執(zhí)行新版本，即GB/T 16886.5-2017 替代原GB/T 16886.5-2003 版本。二者比較，在以下四方面有明顯變化。

2.1 培養(yǎng)基

GB/T 16886.5-2017 較上一版標準，在附錄CMTT 細胞毒性試驗中明確了培養(yǎng)基應使用依格爾最低限量基本培養(yǎng)基MEM（不含酚紅、谷氨酰胺、碳酸氫鈉）。MEM 是哺乳動物細胞的理想培養(yǎng)基，相對于GB/T 14233.2-2005 中推薦的RPMI1640 培養(yǎng)基更適用于貼壁細胞的培養(yǎng)，也美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）推薦的用于L929 的細胞培養(yǎng)基。

2.2 更換培養(yǎng)液后的時間

GB/T 14233.2-2005 中要求在更換培養(yǎng)液后的72 h 觀察細胞形態(tài)并測定細胞相對增殖率。GB/T 16886.5-2017 中要求在更換培養(yǎng)液后的24 h 測定。胡煜雯等［6］提出換液后培養(yǎng)時間越長，空白對照組細胞收到抑制甚至凋亡的可能性越大，導致假陰性結(jié)果的可能性越高。

2.3 布板

GB/T 14233.2-2005 中要求空白對照組、陰性對照組、陽性對照組和供試品組，每組各設6 孔。GB/T 16886.5-2017 中明確為檢查細胞接種誤差，不使用第1 列和第12 列，將空白加到96 孔板的第2 列和第11 列。左右兩列平均值大于等于0.2 且左右兩列空白平均值與全部空白平均值相差不大于15%，試驗符合接受標準。

2.4 終結(jié)果判定

GB/T 14233.2 中，在570 nm 和630 nm 波長下測定吸光度計算相對增殖率，按0～4 級分級判定。因培養(yǎng)基由MEM 代替RPMI1640，相應GB/T 16886.5把參考波長改為650 nm，若供試品細胞存活率降低小于空白對照組的70%，說明該供試品具有潛在的細胞毒性。

3 討論

醫(yī)療器械作為現(xiàn)代人們醫(yī)療的必須手段，其安全有效性的評價是保障我國醫(yī)療事業(yè)健康發(fā)展的基礎［7］。細菌內(nèi)毒素試驗和細胞毒性試驗是醫(yī)用輸液、輸血、注射器具類乃至全部醫(yī)療器械生物相容性評價的重要項目。細菌內(nèi)毒素檢查法中“應小于”的概念是基于凝膠法反應原理［8］提出的，而“不超過”這一概念中的“等于”是凝膠限度試驗無法觀察到的，極易引起歧義。關于細胞毒性試驗，有研究表明［9-10］，在不同的試驗條件下應用MTT 法，對同一待檢物進行檢測會得到不同的細胞毒性結(jié)果，因此標準化MTT 試驗方法對醫(yī)療器械細胞毒性試驗評價的客觀性和科學性具有十分重要的意義。

以上是筆者對GB/T 14233.2-2005 中細菌內(nèi)毒素試驗及細胞毒性試驗的幾點看法，希望能對推進標準修訂起到一定的促進作用。