胡 雪， 江應(yīng)安

武漢大學(xué)人民醫(yī)院感染科，湖北 武漢 430060

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種真核細(xì)胞重要細(xì)胞器，是蛋白質(zhì)糖類和脂類的重要合成基地，與物質(zhì)運(yùn)輸和交換、解毒作用密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的紊亂，是細(xì)胞的一種重要的自我防御機(jī)制[1]。肝衰竭是多種因素引起肝臟合成、解毒及代謝功能嚴(yán)重障礙的臨床危急重癥。目前關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝衰竭的發(fā)生發(fā)展暫無(wú)系統(tǒng)性的認(rèn)識(shí)。因此，本文就內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的概念、信號(hào)通道及其與肝細(xì)胞代謝、炎癥、氧化應(yīng)激及在肝衰竭動(dòng)物模型和臨床中的最新研究結(jié)果作一概述。

1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的概述

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種真核細(xì)胞重要細(xì)胞器，負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成、折疊、運(yùn)輸，維持鈣穩(wěn)態(tài)和脂類的合成和加工。在正常情況下，異常折疊或未折疊的蛋白質(zhì)通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解過(guò)程被蛋白酶體降解。然而，在病理情況下，異常折疊或未折疊的蛋白往往在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)大量聚集，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，即形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[1]。正常細(xì)胞有維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的自我保護(hù)機(jī)制，即未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)。此種反應(yīng)包含三種機(jī)制：(1)減少進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)負(fù)荷，通過(guò)降低蛋白質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)位來(lái)實(shí)現(xiàn)；(2)增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理未折疊蛋白的能力，通過(guò)UPR靶基因的轉(zhuǎn)錄激活；(3)細(xì)胞死亡被促發(fā)，保護(hù)機(jī)體免受出現(xiàn)異常折疊蛋白質(zhì)細(xì)胞的傷害[2]。然而，發(fā)生嚴(yán)重的或持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，可觸發(fā)線粒體凋亡過(guò)程以消除受損細(xì)胞。

2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通道

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上有三種應(yīng)激傳感器：激活轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)、肌醇需求因子1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)。這三個(gè)應(yīng)激傳感器受伴侶分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78/BiP)調(diào)節(jié)，在未激活狀態(tài)下，此調(diào)節(jié)因子結(jié)合到三種應(yīng)激傳感器，從而抑制它們的信號(hào)激活。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促發(fā)時(shí)，GRP78與這三種應(yīng)激效應(yīng)器分離，解離后的應(yīng)激效應(yīng)器三個(gè)分子分別激活相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路，啟動(dòng)UPR[3]。ATF6是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅱ型跨膜蛋白，N末端的結(jié)構(gòu)域上含有bZIP轉(zhuǎn)錄因子。發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，ATF6移位至高爾基體，并被蛋白酶S1P和S2P裂解，從而釋放其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(ATF6f)。ATF6f可調(diào)控UPR相關(guān)基因的上調(diào)[4]。PERK是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅰ型跨膜蛋白。發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，PERK與GRP78解離后，通過(guò)自身磷酸化激活，激活的PERK調(diào)控下游的真核翻譯起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成暫時(shí)減少，使細(xì)胞有時(shí)間重新折疊或降解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊的蛋白質(zhì)[5]。IRE1是一種具有蛋白激酶和核糖核酸內(nèi)切酶活性的跨膜蛋白。當(dāng)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，IRE1 發(fā)生二聚化和自身磷酸化而被激活，激活的IRE1通過(guò)其核酸內(nèi)切酶活性剪切X 盒結(jié)合蛋白(X-box binding protein-1，XBP1)mRNA中的26堿基內(nèi)含子，剪切后的XBP1s移位到細(xì)胞核介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解反應(yīng)(ERAD)，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜膨脹，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6]。

3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝細(xì)胞代謝

肝細(xì)胞富含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜占總細(xì)胞膜的50%。肝細(xì)胞是重要的分泌細(xì)胞，能合成和分泌除免疫球蛋白的大多數(shù)血漿蛋白，且大多數(shù)分泌蛋白和定位質(zhì)膜的蛋白需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行正確折疊。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也是多種脂類合成的場(chǎng)所，包括膽固醇、神經(jīng)酰胺和磷脂。肝細(xì)胞的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還具有親脂性藥物和外源性解毒機(jī)制[7]。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在肝細(xì)胞的生理功能中起重要作用。雖然肝細(xì)胞含大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但肝細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的破壞很敏感。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)，小鼠肝特異性GRP78丟失可導(dǎo)致肝脂肪變性、自發(fā)肝損傷和肝細(xì)胞凋亡，而且小鼠對(duì)酒精、高脂肪飲食、藥物和毒素引起的各種肝臟疾病敏感[8]。類似的，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位子組分Sec61a1功能缺失可引起肝脂肪變性和肝腫大，并激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[9]。最近的幾項(xiàng)研究提高了關(guān)于單個(gè)UPR傳感器對(duì)肝臟生理功能的認(rèn)識(shí)。小鼠肝臟XBP1特異性敲除表現(xiàn)出嚴(yán)重的低膽固醇血癥和低甘油三酯血癥，原因是脂肪酸的新合成減少[10]。小鼠肝臟特異性敲除ATF6加重高糖飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變性和糖耐量異常[11]。這些研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子參與調(diào)控正常肝細(xì)胞代謝過(guò)程。

4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與炎癥

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可參與炎癥反應(yīng)過(guò)程，并且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥可相互調(diào)節(jié)，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以直接啟動(dòng)炎癥通路,而且炎性刺激如活性氧(ROS)和細(xì)胞因子也可以觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[12]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與幾種炎癥反應(yīng)途徑相關(guān)，包括NF-κB、AP-1、JNK等。NF-κB是炎癥反應(yīng)的主要調(diào)控分子，正常狀態(tài)下，NF-κB在胞質(zhì)中與IκB激酶(IKK)復(fù)合物的結(jié)合被抑制。當(dāng)炎癥刺激時(shí)，IKK復(fù)合物發(fā)生磷酸化而降解IκB蛋白，從而使NF-κB二聚體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。IRE1α通過(guò)結(jié)合腫瘤壞死因子(TNF)受體2相關(guān)的因子(TRAF2)，從而招募IKK復(fù)合物，引起NF-κB通路的激活[13]。siRNA下調(diào)ATF6可通過(guò)抑制NF-κB和調(diào)控Akt激活，從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[14]。磷酸化eIF2α可通過(guò)降低IκB蛋白的翻譯水平而激活NF-κB通路[15]。AP-1 是由不同家族的轉(zhuǎn)錄因子組成的二聚體，如JUN、FOS、ATF和MAF。AP-1可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞因子、趨化因子和其他促炎分子的水平來(lái)調(diào)節(jié)炎癥。研究報(bào)道RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可促進(jìn)AP-1激活[16]。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可激活MAPK通路調(diào)控炎癥反應(yīng)，主要包括JNK和p38通道。磷酸化的IRE1可通過(guò)募集TRAF2和ASK1直接激活JNK。在IRE1持續(xù)激活的條件下，低XBP1信號(hào)和JNK的持續(xù)激活能促進(jìn)組織炎癥、炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。相反，MAPKs也可以調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)。p38的激活可增強(qiáng)XBP1的入核，增強(qiáng)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路和炎癥信號(hào)通路之間的密切聯(lián)系[17]。除了通過(guò)調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控炎癥反應(yīng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)也通過(guò)XBP1s和ATF4分子直接促發(fā)炎癥反應(yīng)。這些轉(zhuǎn)錄因子刺激炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，如TNF、IL-6、CXCL2和CXCL3。ATF4也被證明有助于脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的促炎因子CCL2在內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜的表達(dá)，以及IL-6在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)[18]。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可促進(jìn)炎癥反應(yīng)過(guò)程。

5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是指細(xì)胞受到損傷時(shí)，抗氧化系統(tǒng)和氧化系統(tǒng)不平衡引起的細(xì)胞反應(yīng)，常常表現(xiàn)出來(lái)ROS大量聚集。在正常情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)折疊是一個(gè)多步驟的關(guān)鍵過(guò)程，二硫鍵的形成需要氧化折疊環(huán)境。在異常狀態(tài)下，機(jī)體識(shí)別一個(gè)有缺陷的二硫鍵，谷胱甘肽(GSH)減少二硫鍵的形成，導(dǎo)致還原性谷胱甘肽/氧化性谷胱甘肽(GSSH)的比值降低。增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊負(fù)荷，增加細(xì)胞ROS含量，引起ROS積累。折疊蛋白引入二硫鍵主要需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原素1(ERO1)。ERO1突變體的過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激和UPR。此外，UPR的激活可誘導(dǎo)ERO1的激活，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的增加和UPR的持續(xù)，而抗氧化劑的作用可減弱UPR，以及減少下游蛋白的分泌[19]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與氧化應(yīng)激關(guān)系密切，不僅內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，ROS也可加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。外源性H2O2或有機(jī)氧化劑，如甲萘醌或二酰胺，可導(dǎo)致eIF2α的磷酸化，誘導(dǎo)ATF4表達(dá)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。PERK/eIF2α的小分子和ATF4的下游靶點(diǎn)包括抗氧化相關(guān)基因，而且PERK的激活還導(dǎo)致抗氧化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2從抑制劑Keap1中解離，增加細(xì)胞內(nèi)GSH水平。因此，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中，介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的eIF2α通路參與晚期氧化應(yīng)激反應(yīng)，但它也被用于誘導(dǎo)抗氧化基因，以應(yīng)對(duì)外源性來(lái)源的氧化攻擊[20]。這些研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可促進(jìn)氧化應(yīng)激，而且氧化應(yīng)激也可加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

6 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝衰竭動(dòng)物模型的研究

肝衰竭是多種因素引起肝臟合成、解毒與代謝功能嚴(yán)重障礙的臨床危急重癥。關(guān)于肝衰竭的發(fā)病機(jī)制，目前多數(shù)學(xué)者支持“兩次打擊”學(xué)說(shuō)，一是由病毒直接或間接(免疫反應(yīng))所致原發(fā)性損傷，二是以內(nèi)毒素-細(xì)胞因子軸-肝損傷學(xué)說(shuō)為核心的繼發(fā)性損傷[21]。因此，有效地控制內(nèi)毒素血癥及內(nèi)毒素引起的肝細(xì)胞損傷是肝衰竭內(nèi)科綜合治療中的重點(diǎn)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可在各種肝臟損傷模型中觀察到，包括酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、缺血-再灌注損傷和膽汁淤積性肝病[22]。雖然目前關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肝衰竭過(guò)程中的動(dòng)物研究有限，但有不少研究支持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激加重肝衰竭的進(jìn)展。多種急性肝衰竭動(dòng)物模型證明有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)。N-乙酰氨基酚(APAP)誘導(dǎo)的藥物性急性肝衰竭小鼠中，肝臟磷酸化eIF2α和ATF6明顯增加[23]。LPS聯(lián)合D-氨基半乳糖(D-GalN)誘導(dǎo)的小鼠肝衰竭模型，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和CHOP明顯上調(diào)[24]。類似的，LPS聯(lián)合D-GalN誘導(dǎo)的大鼠肝衰竭模型，肝組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、p-eIF2α、ATF4和CHOP明顯升高，而且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸(4-PBA)可緩解肝組織損傷[25]。四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的小鼠肝衰竭研究發(fā)現(xiàn)，肝組織磷酸化eIF2α明顯增加，用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA可明顯抑制小鼠肝損傷[26]。有研究證明，CHOP基因敲除小鼠對(duì)APAP誘導(dǎo)的肝損傷有保護(hù)作用，能減少肝壞死，提高小鼠存活率[27]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑(TUDCA)可抑制APAP誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物CHOP、XBP1、p-eIF2α的上調(diào)，并且減輕肝組織的炎癥損傷，緩解血清轉(zhuǎn)氨酶上調(diào)[28]。由此可見(jiàn)，各種肝衰竭動(dòng)物模型中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子均明顯上調(diào)，而且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑可緩解肝損傷。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與調(diào)控肝衰竭過(guò)程中的病理?yè)p傷。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子可作為肝衰竭的新靶點(diǎn)。開發(fā)靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的藥物對(duì)肝衰竭治療提供新思路。

7 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝衰竭的臨床研究

肝衰竭進(jìn)展過(guò)程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的臨床研究較少。 基因分析顯示，在慢加急性肝衰竭(ACLF)患者中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或下游通路相關(guān)基因，包括BiP、ATF4、PERK等表達(dá)存在差異[29]。另一項(xiàng)研究顯示，與肝硬化患者相比，ACLF患者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因XBP1、細(xì)胞凋亡和炎癥相關(guān)基因(caspase-3、caspase-8、TNFα)>2倍上調(diào)[30]。有學(xué)者對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在乙型肝炎病毒相關(guān)ACLF中的作用進(jìn)行了研究，電鏡觀察ACLF肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)擴(kuò)張和破裂。在慢性乙型肝炎患者中，三條UPR通路均被激活；在ACLF中，ATF6通路的表達(dá)被激活，而PERK和IRE1的表達(dá)下調(diào)。此外，ACLF肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡分子CHOP、caspase-4、Bax表達(dá)明顯上調(diào)，而GRP78、GRP94表達(dá)逐漸降低[31]。這些研究顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子在ACLF中異常改變，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與ACLF的病理機(jī)制。然而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在ACLF中的作用還需要更多的臨床研究進(jìn)行證實(shí)。

8 展望

隨著近年關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝衰竭之間關(guān)系的研究深入，越來(lái)越多的研究證明兩者存在密切聯(lián)系。ERS是機(jī)體的一種自我保護(hù)性反應(yīng)，適應(yīng)性ERS是維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的自我保護(hù)機(jī)制，持續(xù)或嚴(yán)重的ERS可加重細(xì)胞損傷。ERS在肝細(xì)胞中的功能復(fù)雜，可調(diào)控炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等，這些反應(yīng)與肝衰竭的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。大量的肝衰竭動(dòng)物研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子表達(dá)上調(diào)，而且運(yùn)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑可改善肝衰竭動(dòng)物的肝損傷。因此目前動(dòng)物的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與調(diào)控肝衰竭的病理過(guò)程，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑有可能作為治療肝衰竭的新靶點(diǎn)。目前關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和肝衰竭臨床的研究較少。但僅限的臨床研究結(jié)果顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子在ACLF中異常表達(dá)。這些研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肝衰竭的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路分子較多，篩選出有價(jià)值的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子藥物可為治療肝衰竭提供新思路。