陳文強(qiáng)，汪小福，陳笑蕓，彭 城，徐俊鋒，蔡 健

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021；2.阜陽(yáng)師范大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236037）

鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）又稱黑節(jié)草，為蘭科石斛屬多年生附生型草本植物，為我國(guó)傳統(tǒng)珍貴中藥材之一，具有滋陰除熱、生津養(yǎng)胃等功效[1]，主要分布于我國(guó)南方地區(qū)如浙江、云南、貴州及安徽等地。鐵皮石斛含有豐富的多糖、生物素、氨基酸和微量元素，其有效成分具有增強(qiáng)免疫力、抗衰老、抗氧化、降血糖等生物作用[2]。鐵皮石斛的自然生長(zhǎng)條件較為苛刻，通常位于1 600 m以上海拔的背陽(yáng)山坡，喜潮喜濕、耐寒能力差[3]，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，繁殖率低[4]。近代快速繁殖離體培養(yǎng)技術(shù)緩解了鐵皮石斛野生資源短缺的壓力[5]，但由于其優(yōu)良的保健價(jià)值及人們對(duì)健康生活的追求，使得國(guó)內(nèi)外對(duì)鐵皮石斛的需求量也逐年增加。在巨大的利益驅(qū)動(dòng)下，市場(chǎng)上出現(xiàn)了利用性狀相似的金釵或紫皮石斛等充當(dāng)鐵皮石斛。而石斛種類繁多，形態(tài)相似，特別是加工為成品如鐵皮楓斗后更加難以區(qū)分，造成了目前鐵皮石斛市場(chǎng)上“以假亂真”、“以次充好”等混亂現(xiàn)象。嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的正當(dāng)權(quán)益及消費(fèi)者對(duì)鐵皮石斛的信用，阻礙了鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)性的發(fā)展，迫切需要對(duì)鐵皮石斛建立精準(zhǔn)的鑒別方法，以滿足其質(zhì)量控制和市場(chǎng)監(jiān)管的需要。

目前鑒定鐵皮石斛的方法主要包括傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定、理化分析鑒定和DNA分子鑒定方法。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)通過觀察鐵皮石斛表面及顯微切片進(jìn)行分析[6]，需要有較高的鑒別經(jīng)驗(yàn)，對(duì)材料的新鮮度與完整性要求較高，并且缺少明確鑒定鐵皮石斛的專屬性狀特征。理化性質(zhì)鑒別通過一系列物理、化學(xué)分析方法，例如高效液相色譜技術(shù)[7]、固相萃取技術(shù)[8]以及紅外光譜[9]或者紫外光譜法[10]等對(duì)鐵皮石斛中所含成分進(jìn)行分析，獲取其中具有鑒別價(jià)值的理化性質(zhì)。其缺點(diǎn)是儀器費(fèi)用高、材料前處理不易控制且微量分離鑒定效果不明顯。

DNA分子鑒別常用的有DNA分子標(biāo)記技術(shù)和DNA條形碼技術(shù)等[11]。DNA條形碼技術(shù)是利用基因組中一段標(biāo)準(zhǔn)的、相對(duì)較短的DNA片段進(jìn)行物種鑒定的分子鑒定新方法。目前，DNA條形碼技術(shù)在發(fā)現(xiàn)新物種和辨別混亂或錯(cuò)誤物種方面應(yīng)用頗多，線粒體基因細(xì)胞色素C氧化酶COI基因片段作為動(dòng)物分類鑒定的通用DNA條形碼[12]，COI對(duì)真菌和藻類也有較高的分辨率，但植物的線粒體基因進(jìn)化速率慢，因而COI不適合植物的物種鑒定。在植物方面，2009年，國(guó)際生命條形碼聯(lián)盟（Consortium for the Barcode of Life，CBOL）推薦使用葉綠體基因片段rbcL和matK作為植物通用的DNA條形碼[11]。近年來，更多的葉綠體基因及核基因片段被用作植物的DNA條形碼。

許多學(xué)者開展了利用DNA條形碼對(duì)鐵皮石斛鑒定的研究。如付濤等[13]基于葉綠體DNA條形碼鑒定鐵皮石斛種質(zhì)資源，認(rèn)為rbcL和matK可作為鑒定鐵皮石斛的候選序列；丁小余等[14]對(duì)ITS全序列構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)利用ITS序列可以成功鑒別石斛類的待檢品種；邵世光等[15]對(duì)石斛中trnH-psbA序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)trnH-psbA在不同石斛種間均存在差異，可用作石斛分子的鑒定；楊培[16]利用psbK-psbI對(duì)34 份石斛屬樣品進(jìn)行檢測(cè)，成功鑒定出未知待檢樣品的品種。

目前研究多是利用一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)DNA條形碼對(duì)石斛進(jìn)行鑒定或分類，有待全面和深入研究。本研究選擇目前常用的9 種植物DNA條形碼（ITS2、nad1、matK、ycbL、psbK-psbI、trnL-trnF、trnG-trnS、rbcL和trnH-psbA），分別從擴(kuò)增性、遺傳分化距離、序列特征分析等方面，全面系統(tǒng)地解析不同植物DNA條形碼對(duì)鐵皮石斛的鑒定能力，以期為鐵皮石斛鑒定選擇合適的DNA條形碼提供分子依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究采集到浙江省、安徽省、云南省以及廣西壯族自治區(qū)4 個(gè)地區(qū)25 份鐵皮石斛鮮樣和10 種不同種石斛屬鮮樣，共計(jì)35 份樣品，并由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院于國(guó)光副研究員鑒定為相應(yīng)的石斛材料。材料信息詳見表1。

表1 鐵皮石斛及其近緣屬材料信息Table 1 Information about leaf and stem samples of D.officinale and its related species

75%乙醇、瓊脂糖、TAE緩沖液50×、DNA Marker DL2000 生工生物工程（上海）股份有限公司；液氮、植物總DNA提取試劑盒 杭州新景生物有限公司；Prime STAR?HS Premix 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

Nanodrop 2000核酸蛋白分析儀 美國(guó)Thermo公司；96 孔超速梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國(guó)Biometra公司；凝膠電泳儀 美國(guó)GE公司；全自動(dòng)凝膠成像儀 上海嘉鵬科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

將選取的石斛組織（鮮葉、莖）用75%乙醇溶液擦拭，保存至-80 ℃?zhèn)溆?。稱取100 mg石斛樣品，用液氮研磨，然后通過植物總DNA提取試劑盒方法提取石斛總DNA。使用Nanodrop 2000核酸蛋白分析儀檢測(cè)所提DNA濃度及純度，通過1%凝膠電泳判定DNA質(zhì)量。稀釋至均一濃度后放入-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序

查閱文獻(xiàn)并結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)選定9 種常用植物DNA條形碼及其引物序列（表2），對(duì)所有DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用25 μL PCR擴(kuò)增體系，包括12.5 μL Prime STAR?HS Premix、上下游引物1 μL（10 mmol/L）、DNA模板2 μL（約40 ng）、ddH2O 8.5 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)后，將得到的單一、明亮條帶，經(jīng)膠回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

表2 DNA條形碼引物信息及來源Table 2 Primer sequences and reaction conditions used for amplification of DNA barcodes

1.3.3 生物信息學(xué)分析

利用Chromas3.0軟件對(duì)序列峰圖進(jìn)行查看，并判斷測(cè)序結(jié)果是否理想。對(duì)于測(cè)序成功獲得的序列，采用ClustalW軟件，將測(cè)序兩端無用序列刪除，采用NCBI（National Center for Biotechnology Information）平臺(tái)的BLAST工具與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。利用MEGA6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，分析測(cè)得核酸序列的長(zhǎng)度、核苷酸組成、進(jìn)行序列比對(duì)、變異位點(diǎn)分析。擴(kuò)增率為實(shí)驗(yàn)引物與所有待實(shí)驗(yàn)石斛材料總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，成功擴(kuò)增材料與總研究材料之比。變異率為序列中所含變異位點(diǎn)與序列總堿基含量之比。種內(nèi)遺傳距離的計(jì)算和系統(tǒng)發(fā)育鄰接（Neighbor-Joining，NJ）進(jìn)化樹的構(gòu)建利用的是K2P（Kimura 2-parameter）模型，Bootstrap的次數(shù)設(shè)為1 000 次，并自動(dòng)刪除小于50%的數(shù)值，確定每個(gè)分支的支持率不小于50%，可判斷正確鑒定到種。利用SPSS 20.0中的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對(duì)單片段DNA條形碼序列種間與種內(nèi)遺傳距離進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出鐵皮石斛資源鑒定的DNA條形碼。

本研究序列分析軟件主要為Chromas3.0和ClustalW；遺傳距離計(jì)算與NJ進(jìn)化樹構(gòu)建則使用MEGA6.0；統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS20.0；繪圖所使用軟件為Microsoft Office的Excel和PowerPoint。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列測(cè)定與比對(duì)

9 條DNA條形碼序列在35 份石斛屬植物共得315 條序列。將所得序列均通過NCBI進(jìn)行BLAST相似性檢驗(yàn)。將比對(duì)的結(jié)果進(jìn)行分類總結(jié)，測(cè)序所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的11 種石斛屬序列的同源性為100%（相應(yīng)的序列號(hào)見表3），對(duì)比結(jié)果也說明本實(shí)驗(yàn)的測(cè)序結(jié)果可靠準(zhǔn)確。

表3 測(cè)序與GenBank對(duì)比DNA條形碼序列信息Table 3 Sequencing of DNA barcodes and comparison with GenBank sequences

2.2 不同條形碼特征分析

不同植物DNA條形碼序列的具體特征信息見表4。結(jié)果顯示，不同DNA條形碼的序列全長(zhǎng)介于456～809 bp之間，trnG-trnS片段序列最長(zhǎng)，平均為775 bp，ITS2基因序列最短，平均為457 bp。9 種DNA條形碼序列GC含量介于24.1%～57.9%，其中ITS2基因GC含量最高，平均為53.8%，trnG-trnS片段序列GC含量最低，平均為24.5%?？疾旄鱀NA條形碼的引物在不同材料中的擴(kuò)增率，其中matK序列擴(kuò)增率為91.4%，大包鞘石斛和束花石斛沒有得到擴(kuò)增，可能是這2 個(gè)材料中的matK序列有變異或進(jìn)化。其余8 條DNA條形碼擴(kuò)增率均為100%；9 條DNA條形碼的測(cè)序成功率均為100%。變異率反映序列的變異程度，其中ITS2、trnL-trnF和trnG-trnS的變異率較高，均超過20%，說明這些序列進(jìn)化速率較快。

表4 不同DNA條形碼基本特征信息Table 4 Basic characteristics of DNA barcode sequences

2.3 DNA條形碼遺傳距離分析

DNA條形碼應(yīng)具有足夠小的種內(nèi)變異與明顯的種間變異，在遺傳距離上即要求種內(nèi)差異最大值小于種間差異最小值。對(duì)11 種石斛屬的9 條DNA條形碼序列進(jìn)行種內(nèi)與種間遺傳距離計(jì)算（表5）。結(jié)果顯示，在鐵皮石斛種內(nèi)，nad1、matK、psbK-psbI、trnG-trnS的序列沒有變異，其在鐵皮石斛種內(nèi)遺傳距離為0。種內(nèi)遺傳距離大小順序?yàn)閞bcL＞ITS2＞trnH-psbA＞trnL-trnF＞ycf1b。石斛屬種間遺傳距離統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，ITS2的種間遺傳距離最大，平均為0.074 4，nad1的種間遺傳距離最小，平均為0.004 5。種間遺傳距離大小順序?yàn)镮TS2＞trnG-trnS＞trnL-trnF＞psbK-psbI＞ycf1b＞rbcL＞matK＞trnH-psbA＞nad1。其中，rbcL與trnH-psbA種內(nèi)最大遺傳距離大于種間最小遺傳距離，不符合DNA條形碼對(duì)遺傳距離的要求，其余條形碼種內(nèi)最大遺傳距離小于種間最小遺傳距離。

表5 種內(nèi)、種間遺傳距離Table 5 Genetic distances within and between species

進(jìn)一步利用種內(nèi)與種間K2P遺傳距離得到“barcoding gap”分布圖（圖1），ITS2、nad1、matK、ycf1b、psbK-psbI、trnL-trnF、trnG-trnS基因及片段序列存在“barcoding gap”，有小部分重疊。ycf1b、matK、nad1與psbK-psbI序列遺傳距離分布頻率在圖中整體分布呈正態(tài)分布向種內(nèi)方向傾斜；ITS2、trnL-trnF及trnG-trnS序列種內(nèi)變異差異和樣本分布的比例明顯較小，而品種間的樣本分布和變異差異明顯較大，有利于鐵皮石斛資源的鑒定。而rbcL與trnH-psbA序列不存在“barcoding gap”且品種間和品種內(nèi)變異重合，不適合用于鐵皮石斛資源的鑒定。

圖1 不同DNA條形碼種內(nèi)和種間K2P距離分布圖Fig.1 Distribution of interspecific and intraspecific K2P distances of different DNA barcodes

2.4 不同序列變異的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)

根據(jù)遺傳變異分化的不同，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)7 條候選DNA條形碼序列遺傳距離進(jìn)行種間Wilcoxon秩和檢驗(yàn)（表6），分析兩兩序列種間的變異情況作為篩選候補(bǔ)DNA條形碼的一個(gè)指標(biāo)。根據(jù)P＜0.05為顯著性差異的原則，ITS2序列的檢驗(yàn)值最大，其余序列種間距離變異差異大小順序?yàn)镮TS2＞trnL-trnF＞trnG-trnS＞psbK-psbI＞ycf1b＞matK＞nad1，與種間變異分析結(jié)果一致。

表6 不同序列變異的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)Table 6 Wilcoxon rank sum test of different sequence variations

2.5 DNA條形碼鑒定分析

DNA條形碼分辨率是判斷選擇的條形碼是否合適的標(biāo)準(zhǔn)之一。通過NJ進(jìn)化樹個(gè)體聚成一支且支持率不小于50%可認(rèn)為鑒定成功。9 條DNA條形碼對(duì)本實(shí)驗(yàn)中石斛屬材料的NJ聚類分析如圖2所示。ITS2、ycf1b、psbK-psbI以及trnL-trnF序列可將鐵皮石斛資源以近似50%的支持率，單獨(dú)聚為一支；其余3 種未能得到較好的區(qū)別，nad1序列將重唇石斛、鼓槌石斛、鉤狀石斛等7 種與鐵皮石斛聚為一支，matK序列將銅皮石斛、腫節(jié)石斛、重唇石斛等5 種與鐵皮石斛聚為一支；trnG-trnS序列將金釵石斛、喇叭唇石斛、重唇石斛等6 種與鐵皮石斛聚為一支。7 條DNA條形碼對(duì)鐵皮石斛的分辨率見表7。其中，nad1序列分辨率最低，為36.3%，ITS2與trnL-trnF序列分辨率最高，為90.1%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推薦使用ITS2和trnL-trnF序列作為鐵皮石斛資源鑒定的DNA條形碼。

表7 石斛屬種間分辨率Table 7 Interspecific identification rates of Dendrobium

圖2 基于多條DNA條形碼構(gòu)建的NJ樹Fig.2 NJ trees constructed based on multiple DNA barcodes

進(jìn)一步，將ITS2和trnL-trnF2個(gè)片段組合，進(jìn)行NJ進(jìn)化樹的構(gòu)建（圖3）。通過NJ樹個(gè)體聚成一支且支持率≥50%可認(rèn)為鑒定成功。圖3中每個(gè)分支的支持率均超過50%，11 種石斛都能成功鑒定。推薦使用ITS2+trnL-trnF組合序列作為鐵皮石斛資源鑒定的DNA條形碼。

圖3 基于ITS2＋trnL-trnF組合DNA條形碼構(gòu)建的NJ樹Fig.3 NJ tree constructed based on ITS2 combined with trnL-trnF

3 討 論

DNA條形碼技術(shù)由于其受環(huán)境條件或材料品質(zhì)等影響較小，所需樣品量少、鑒定準(zhǔn)確性高、方便快速等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到鐵皮石斛的鑒定[21]。目前，應(yīng)用到植物鑒定和分類的DNA條形碼有很多，主要為葉綠體的基因片段，葉綠體基因的間隔區(qū)，還有來源核基因片段。本研究選擇了目前比較常用的植物DNA條形碼，其中葉綠體基因片段為rbcL、ycf1b、matK，葉綠體基因的間隔區(qū)trnH-psbA、psbK-psbI、trnL-trnF、trnG-trnS，ITS2為核基因片段，nad1則為線粒體基因。主要從通用性和分辨率等方面探討它們對(duì)鐵皮石斛鑒定的適合程度。

在通用性方面，主要比較了9 種DNA條形碼的擴(kuò)增性和測(cè)序成功率。整體而言，通用性都比較強(qiáng)，其中matK擴(kuò)增率91.4%，相較與其他條形碼，其通用性稍差。之前就有報(bào)道，matK基因雖然是葉綠體基因組編碼蛋白中進(jìn)化最快的基因，但其引物通用性一直飽受爭(zhēng)議[22]。DNA條形碼的擴(kuò)增性直接影響其應(yīng)用范圍和效果。如果一個(gè)DNA條形碼其擴(kuò)增性不強(qiáng)，通用性比較低，即使它的分辨率很高，也很難得到推廣和應(yīng)用[23]。為了提高條形碼的通用性，一般選擇擴(kuò)增效率高的引物，及更短的片段，即微型DNA條形碼，這種微型DNA條形碼更適合DNA受到降解或DNA難以提取樣品的鑒定[24]。

本研究對(duì)DNA條形碼序列測(cè)序、校正，計(jì)算遺傳分化距離，并利用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)和建立NJ樹等分析方法，評(píng)價(jià)它們對(duì)鐵皮石斛及其他石斛的分辨能力。雖然rbcL和trnH-psbA在植物類鑒別與分類中經(jīng)常使用[25]，但在本實(shí)驗(yàn)中，它們?cè)阼F皮石斛種內(nèi)的最大遺傳距離卻大于其他石斛種間的最小遺傳距離，不適合用于鐵皮石斛與其近緣石斛之間的鑒定。另外7 條DNA條形碼滿足種內(nèi)最大遺傳距離小于種間最小遺傳距離的要求，初步判定可作為鑒定鐵皮石斛的候選條形碼。其中，nad1基因序列所含的變異位點(diǎn)少，進(jìn)化速度慢，對(duì)本實(shí)驗(yàn)中石斛材料的分辨率為36.3%。丁鴿等[17]利用nad1序列研究金釵石斛和其混合品親緣關(guān)系時(shí)，也發(fā)現(xiàn)該序列變異程度不高。進(jìn)一步體現(xiàn)了植物線粒體基因進(jìn)化速度慢的事實(shí)，在選擇此類基因作為DNA條形碼時(shí)更需要篩選和驗(yàn)證。trnG-trnS片段序列在石斛屬中變異程度相對(duì)較大，但存在很多堿基的插入/缺失，過多的插入以及缺失不利于序列比對(duì)，導(dǎo)致鑒定準(zhǔn)確率和效率低[20]。Ycf1b與psbK-psbI序列對(duì)于金釵石斛和鉤狀石斛的鑒定效果不理想，但這兩種石斛是市場(chǎng)上與鐵皮石斛混淆最為嚴(yán)重的親緣種[26]。ITS2和trnL-trnF序列對(duì)本研究中的石斛材料的分辨率最高，都達(dá)到了90.1%，但都還無法做到100%的分辨。這與丁小余等[14]利用ITS2進(jìn)行石斛類鑒定成功率不同，可能由于所選取的材料數(shù)量與種類不同，鑒定結(jié)果計(jì)算也大不相同。李海霞[27]同樣基于ITS2序列分析了多種石斛屬種間鑒別，得出有部分石斛由于序列分析混亂，也無法做到利用ITS2均可成功鑒定。有關(guān)trnl-trnF序列片段進(jìn)行石斛類鑒定的研究較少，邢文瑞[28]利用trnL-trnF序列片段構(gòu)建NJ進(jìn)化樹，得到石斛屬種間鑒定效果良好，但也無法滿足單一DNA條形碼鑒定。因此在利用DNA條形碼對(duì)植物材料進(jìn)行鑒定或分類時(shí)，推薦多條DNA條形碼組合使用，從而提高分辨率。本實(shí)驗(yàn)推薦ITS2+trnL-trnF序列作為鐵皮石斛及其近緣種鑒定的條形碼組合。ITS2序列片段位于核糖體DNA變異較大的基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，同時(shí)具有較高的拷貝數(shù)與較快的進(jìn)化速率[29]。trnL-trnF基因片段位于葉綠體基因非編碼區(qū)的大單拷貝區(qū)，約為600～1 400 bp，因?yàn)檫M(jìn)化速率較快，適合作為DNA條形碼[30]。一方面這兩個(gè)條形碼的分辨率高，另一方面，ITS2為核基因組條形碼，trnL-trnF為葉綠體條形碼，這兩個(gè)不同來源的基因片段可能在不同的類群中存在不同的分辨率，兩者的結(jié)合，則有效提高分辨率。ITS2+trnL-trnF的組合能對(duì)本實(shí)驗(yàn)中所選的11 種石斛屬材料進(jìn)行鑒定，然而我國(guó)石斛種類有70 多種，ITS2+trnL-trnF的組合是否適合更多石斛材料的鑒別，還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究比較分析了9 種常用植物DNA條形碼對(duì)11 種石斛屬材料的鑒別能力，9 種條形碼的擴(kuò)增性及通用性良好，不同條形碼對(duì)所測(cè)試石斛屬材料的鑒別能力有差異，其中ITS2序列和trnL-trnF片段序列的鑒定能力最高，分辨率均達(dá)到90.1%。將ITS2序列和trnL-trnF序列相結(jié)合，對(duì)所用石斛屬材料達(dá)到了100%鑒定，推薦推薦使用ITS2+trnL-trnF組合作為鐵皮石斛資源鑒定的DNA條形碼。