于艷芳 魏芳

2018年全球185個(gè)國(guó)家中，宮頸癌新發(fā)病例569 847例，死亡病例311 365例，其發(fā)病率和死亡率在全球女性惡性腫瘤中均居第四位，且發(fā)展中國(guó)家宮頸癌發(fā)病率高于發(fā)達(dá)國(guó)家[1]。95%的宮頸癌是由高危型人乳頭瘤病毒(High risk human papillomaviruses，HR-HPV)持續(xù)感染引起。不同的HPV分子感染持續(xù)時(shí)間和致癌潛能不同，過(guò)去對(duì)此差異的研究以HPV類(lèi)型為基礎(chǔ)，隨著基因組學(xué)的發(fā)展，逐漸認(rèn)識(shí)到同一類(lèi)型的HPV內(nèi)存在不同的變異譜系和亞系，且不同變異譜系和亞系的致癌潛能也有明顯的差異[2-4]。HR-HPV的免疫逃避機(jī)制導(dǎo)致其感染的持續(xù)性，HR-HPV通過(guò)癌蛋白E6和E7分別與p53和pRb結(jié)合發(fā)揮致癌的主要作用。此外，HR-HPV可以增加宿主細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致體細(xì)胞突變的積累，以及通過(guò)其介導(dǎo)的載脂蛋白B mRNA編輯催化多肽(APOBEC)突變共同發(fā)揮致癌作用[5-6]。

一、HPV結(jié)構(gòu)

HPV是一種雙鏈環(huán)狀DNA病毒，長(zhǎng)度約8 000堿基對(duì)，含有8或9個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFs)，包裹在無(wú)包膜衣殼蛋白內(nèi)。病毒基因可分為三個(gè)主要區(qū)域：(1)早期區(qū)域(E)。編碼病毒周期所必需的基因，并在細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起重要作用(E1、E2、E4、E5、E6和E7)；(2)晚期區(qū)域(L)。編碼病毒顆粒的主要外殼蛋白L1和次要外殼蛋白L2；(3)上游調(diào)控區(qū)(URR)。也稱(chēng)為長(zhǎng)控制區(qū)(LCR)，是含有復(fù)制起點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的非編碼區(qū)，通過(guò)控制病毒基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)DNA復(fù)制。盡管不同HPV分子ORF的大小和數(shù)量存在差異，但所有HPV都含有保守的核心基因參與復(fù)制(即E1和E2)和包裝(即L1和L2)，其余基因(即E4、E5、E6和E7)在驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期、免疫逃逸和病毒釋放方面發(fā)揮作用。

二、HPV各水平分類(lèi)

HPV是一個(gè)龐大的病毒家族，依據(jù)病毒基因遺傳差異其分類(lèi)水平逐層向下依次是：屬、物種、類(lèi)型、變異譜系和亞系[2-4]。HPV依據(jù)L1基因結(jié)構(gòu)和對(duì)人類(lèi)上皮組織的趨向性不同分為五個(gè)屬：α-、ν-、μ-、β-和γ-屬，不同屬HPV病毒L1基因的核苷酸序列同一性<60%，其中導(dǎo)致宮頸癌的主要是α-HPV[2]。屬內(nèi)引入術(shù)語(yǔ)“物種”，同一物種HPV病毒L1基因的核苷酸序列同一性≥70%，如α-HPV又分α-1、α-2、α-3……α-14等14個(gè)物種[3]。同一物種內(nèi)，HPV病毒L1基因的核苷酸序列差異≥10%即定義為一種HPV類(lèi)型，如α-7物種組內(nèi)有HPV18、HPV39、HPV45、HPV59、HPV68、HPV70、HPV85和HPV97，α-9物種組內(nèi)有HPV16、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52、HPV58和HPV67，目前已鑒定出200多種HPV類(lèi)型[3]。HPV類(lèi)型內(nèi)又存在不同變異體，即變異譜系和亞系，其內(nèi)部全部病毒基因組序列差異分別為1%～10%和0.5%～1%，以HPV16為例，迄今已鑒定出HPV16的4個(gè)變異譜系(A、B、C和D)和16個(gè)亞系，分別為：亞系A(chǔ)1-3(見(jiàn)于歐洲)、A4(亞洲)、B1-4(非洲)、C1-4(非洲)、D1(北美)、D2和D3(亞裔美國(guó)人)和D4[3-4]。

三、不同HPV分子致癌潛能不同

α-屬HPV中的一些HPV類(lèi)型易感染粘膜上皮，并可能導(dǎo)致良性無(wú)癥狀感染、生殖器疣或?qū)m頸癌等多種疾病[2]。約60個(gè)α-HPV類(lèi)型中，12個(gè)被WHO定義為I類(lèi)致癌物，分別是α-9物種組中的HPV16、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52和HPV58，α-7物種組中的HPV18、HPV39、HPV45和HPV59，α-5物種組中的HPV51和α-6物種組中的HPV56[2]。一些研究表明，HPV的不同變異體在感染持續(xù)性、進(jìn)展為宮頸癌前病變和癌癥方面具有不同風(fēng)險(xiǎn)。

HPV16是目前已知的最高危HPV類(lèi)型，與大約50%的宮頸癌相關(guān)，感染HPV16非A變異譜系(即B、C和D)的女性發(fā)展為宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)比感染HPV16-A變異譜系的女性增高1倍[4]。HPV16亞系A(chǔ)4、D2和D3在宮頸原位腺癌(AIS)和腺癌(ADC)中更常見(jiàn)，而A1、A2亞系見(jiàn)于大多數(shù)(75.4%)宮頸鱗癌中[4]。2016年，美國(guó)科研工作者使用高通量HPV全基因組測(cè)序分析了3 215名感染HPV16婦女的HPV16變異譜系和亞系，分析其與宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變III級(jí)(CINIII)的風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果顯示：A4亞系癌癥風(fēng)險(xiǎn)較高，特別是腺癌，譜系B具有較低的CINIII風(fēng)險(xiǎn)，D2、D3亞系與CINIII和癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)，D2具有最強(qiáng)的腺體病變風(fēng)險(xiǎn)[4]。表明HPV病毒較小的遺傳差異即能導(dǎo)致致癌潛能的變化。

HPV18存在3個(gè)變異譜系(A、B、C)和9個(gè)亞系(A1-5、B1-3、C)，HPV18 -A變異譜系(見(jiàn)于歐洲)導(dǎo)致CINIII的風(fēng)險(xiǎn)是B、C變異譜系(見(jiàn)于非洲)的2倍，亞系A(chǔ)1、A2導(dǎo)致腺癌的風(fēng)險(xiǎn)比亞系A(chǔ)3、A4高4倍[3]。

HPV31存在3個(gè)變異譜系(A、B、C)和7個(gè)亞系(A1-2、B1-2、C1-3)。目前關(guān)于HPV31變異體與感染持續(xù)性的關(guān)系尚有爭(zhēng)議，有報(bào)道認(rèn)為HPV 31-C變異譜系比A、B變異譜系感染持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，亦有報(bào)道認(rèn)為A和B譜系與持續(xù)感染和疾病進(jìn)展相關(guān)，譜系B與CINIII關(guān)系密切[3]。

HPV52存在4個(gè)變異譜系(A、B、C和D)和7個(gè)亞系(A1-2、B1-2、C1-2和D)。來(lái)自臺(tái)灣的一項(xiàng)大型研究表明，譜系C在導(dǎo)致HSIL及以上級(jí)別的病變中風(fēng)險(xiǎn)是譜系B的7.6倍[7]。加拿大的一項(xiàng)研究表明A1亞系在CIN II/III中更為常見(jiàn)[8]。

變異體的研究對(duì)于解決HPV發(fā)病機(jī)制的遺傳基礎(chǔ)、病毒-宿主相互作用、導(dǎo)致特定組織病理癌癥的特定核苷酸或核苷酸組合等的研究意義重大，需要更多的多中心研究及薈萃分析來(lái)解決HPV相關(guān)癌癥核苷酸水平和分子水平的發(fā)病機(jī)制。

四、HPV生命周期及其免疫逃避機(jī)制

大多數(shù)肛門(mén)生殖器HPV感染是通過(guò)性接觸獲得的。既往認(rèn)為HPV感染需要上皮創(chuàng)傷或微創(chuàng)傷以允許病毒進(jìn)入基底層，并提出傷口愈合反應(yīng)在受感染細(xì)胞增殖中的作用，隨著研究進(jìn)展，鑒于HPV類(lèi)型和感染途徑的多樣性，感染途徑不再一概而論，并認(rèn)為在傷口愈合期間發(fā)生的活躍細(xì)胞增殖是病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核所必需的[2]。HPV生命周期與受感染上皮細(xì)胞的分化程度密切相關(guān)，HR-HPV更易感染具有增殖能力的基底層細(xì)胞，其在一定程度上決定了HR-HPV感染的持續(xù)性，感染分兩個(gè)階段：潛伏感染和生產(chǎn)性感染[9]。在潛伏感染期間，病毒基因復(fù)制水平較低，每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生約50～100個(gè)病毒基因組，且病毒基因組存在于上皮細(xì)胞內(nèi)不向體液中釋放，故而逃避機(jī)體的免疫反應(yīng)，這種現(xiàn)象在HR-HPV中更常見(jiàn)[5]。有體外研究表明HPV16表達(dá)由E1和E2開(kāi)放閱讀框的亞區(qū)(稱(chēng)為E8E2)編碼的融合蛋白，限制病毒在未分化的角質(zhì)形成細(xì)胞中完成病毒生命周期的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[10]。生產(chǎn)性感染階段，E6和E7高度表達(dá)，E2蛋白將E1(一種病毒DNA解旋酶)募集到病毒復(fù)制起點(diǎn)的結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)病毒DNA復(fù)制，導(dǎo)致在分化成熟的角質(zhì)形成細(xì)胞中每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生數(shù)千個(gè)病毒基因組拷貝[9]。在上皮細(xì)胞分化成熟后，HPV基因組編碼合成L1和L2衣殼蛋白，組裝成新的HPV顆粒從上皮表面釋放，使感染擴(kuò)散[11]。

此外，HPV免疫逃避的機(jī)制還包括調(diào)節(jié)干擾素信號(hào)傳導(dǎo)、通過(guò)E6和E7癌蛋白抑制朗格漢斯細(xì)胞、抑制粘附分子如CDH1以及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑等[12]。一半多的女性在HPV感染后的6個(gè)月內(nèi)可自行清除病毒，超過(guò)90%的感染女性在幾年內(nèi)可以清除，不會(huì)引起癥狀，即使產(chǎn)生癥狀大多數(shù)患者會(huì)自發(fā)消退，小部分HPV感染持續(xù)存在發(fā)展為癌癥。僅有極少數(shù)的患者在HPV自然感染后產(chǎn)生HPV抗體，但經(jīng)此途徑產(chǎn)生的抗體在抵抗新一輪的HPV感染時(shí)其有效性遠(yuǎn)低于高水平血清反應(yīng)和接種HPV疫苗后產(chǎn)生的抵抗力[13]。

五、HPV致癌機(jī)制

1.致癌基因激活和抑癌基因失活：HR-HPV編碼的E6癌蛋白與宿主細(xì)胞編碼的E6AP形成的復(fù)合體，與腫瘤抑制基因p53結(jié)合，使p53失活、降解，喪失與促凋亡bcl-2陰性調(diào)節(jié)區(qū)域和抗凋亡的bax促進(jìn)子區(qū)域的結(jié)合能力，從而抑制凋亡，增加染色體不穩(wěn)定性，使細(xì)胞過(guò)度增殖導(dǎo)致腫瘤[11]。E7能與非磷酸化pRb優(yōu)先結(jié)合，使pRb-E2F發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用，經(jīng)過(guò)反饋環(huán)的增量調(diào)節(jié)引起p16INK4A過(guò)度表達(dá)，使控制細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)錄脫調(diào)節(jié)，引起細(xì)胞過(guò)度增殖[11]。此外，E6能激活端粒酶活性，E7能使細(xì)胞周期失調(diào)、細(xì)胞增殖、增加基因組不穩(wěn)定性并促進(jìn)染色體異常的積累，均可促進(jìn)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化[11]。

2.HPV整合與基因組不穩(wěn)定性：基因組不穩(wěn)定性的發(fā)展是HR-HPV致癌過(guò)程中惡性進(jìn)展的標(biāo)志。

HPV病毒基因與宿主基因的整合可能是輕度鱗狀細(xì)胞上皮內(nèi)瘤變向重度鱗狀細(xì)胞上皮內(nèi)瘤變進(jìn)展的早期事件，因此可能是癌癥進(jìn)展的生物標(biāo)志物[14]。宮頸癌中HPV整合程度因HPV類(lèi)型而異，與HPV16、18和45相比，HPV31和33的整合頻率較低，約74%的HPV16相關(guān)癌癥發(fā)生了基因整合，幾乎所有HPV18相關(guān)癌癥均發(fā)生了基因整合[6]。在HPV變異譜系水平上，研究發(fā)現(xiàn)不同變異譜系可能因E6活性不同，其整合潛力不同[6]?；蛘贤ǔ０l(fā)生于DNA損傷后無(wú)法修復(fù)的染色體脆性位點(diǎn)，DNA損傷通常由活性氧、活性氮和HPV蛋白E1、E6和E7等誘導(dǎo)[15]。宿主細(xì)胞DNA損傷后，HPV癌蛋白通過(guò)多種方式對(duì)抗細(xì)胞的DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response，DDR)反應(yīng)，使DNA斷點(diǎn)無(wú)法修復(fù)以利于病毒基因整合[16]。整合導(dǎo)致病毒基因E1、E2、E5和L2被破壞，E6和E7癌基因缺乏E2癌蛋白的抑制作用而過(guò)表達(dá)[17]。E6 / E7的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞周期的失調(diào)并促發(fā)幾條致癌途徑。

E6和E7通過(guò)干擾有絲分裂期間著絲粒的復(fù)制和誘導(dǎo)中心體數(shù)量異常，直接增加基因組不穩(wěn)定性，這可能導(dǎo)致大的染色體重排和拷貝數(shù)變異[18-19]。宮頸癌在癌癥基因組網(wǎng)絡(luò)圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)集中平均有88個(gè)基因拷貝數(shù)改變，包括26個(gè)擴(kuò)增和37個(gè)丟失，擴(kuò)增最常見(jiàn)于3q(50%的癌癥和25%的CINIII)，該區(qū)域含PIK3CA基因，丟失最常見(jiàn)于3p(40%的癌癥和10%的CINIII)[6]。宮頸鱗癌中報(bào)告的拷貝數(shù)變異多于宮頸腺癌[6]。研究表明，HPV相關(guān)的宮頸癌中，拷貝數(shù)變異通常發(fā)生在病毒整合位點(diǎn)[6]。

由E6和E7激活的致癌過(guò)程需要宿主基因突變的累積共同發(fā)揮作用，不同的HPV基因型致癌過(guò)程中所需的體細(xì)胞突變負(fù)荷和類(lèi)型可能存在差異，迄今，TCGA已經(jīng)鑒定了宮頸癌的14個(gè)顯著突變基因，分別是SHKBP1、ERBB3、CASP8、HLA-A、TGFBR2、PIK3CA、EP300、FBXW7、HLA-B、PTEN、NFE2L2、ARID1A、KRAS和MAPK1，其中，HLA-A、HLA-B、NFE2L2、MAPK1、CASP8、SHKBP1和TGFBR2的突變僅在宮頸鱗癌中發(fā)現(xiàn)[6]。

3.宮頸癌的表觀遺傳修飾和miRNA表達(dá)水平的變化：表觀遺傳修飾是宮頸癌的一個(gè)重要特征，HPV和宿主基因的甲基化通過(guò)影響病毒基因的復(fù)制、細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)等途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。HPV基因組中的LCR是E2結(jié)合位點(diǎn)，具有潛在甲基化的CpG位點(diǎn)，其甲基化導(dǎo)致E2功能的抑制，使游離狀態(tài)下的E6、E7過(guò)表達(dá)[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，HPV16 LCR的CpG甲基化隨著宮頸新生血管的增多而增加[21]。宿主細(xì)胞中的凋亡基因DcR1和DcR2在侵襲性癌癥中高度甲基化[22]。甲基化在侵襲性宮頸癌和CINIII中比在CINI～I(xiàn)I中更常見(jiàn)。此外，HPV和宿主基因的甲基化可能受HPV整合和基因型的影響。

miRNA是非轉(zhuǎn)錄RNA，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡和基因組不穩(wěn)定在宮頸癌變過(guò)程中發(fā)揮作用[23]。HPV癌蛋白及基因整合可以調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)水平，從而在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮作用，例如：E6癌蛋白降解p53，導(dǎo)致由p53調(diào)節(jié)的所有miRNA(miR-23b、miR-34a和miR-218等)的表達(dá)下調(diào)，E7通過(guò)E2F1失活誘導(dǎo)miR-15/16的過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致c-myc或c-myb的下調(diào)[24-25]。miRNA在正常宮頸組織和宮頸病變組織中的表達(dá)水平差異較顯著，故其可能作為宮頸癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，但需更多的研究才能在臨床應(yīng)用中進(jìn)行驗(yàn)證。

4.HPV介導(dǎo)的APOBEC突變：HR-HPV癌蛋白E6和E7的另一個(gè)目標(biāo)是載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3(APOBEC3)，有研究表明，由于宿主對(duì)HPV感染的免疫反應(yīng)引發(fā)的載脂蛋白B mRNA編輯催化多肽(APOBEC)突變是HPV陽(yáng)性腫瘤主要的突變來(lái)源[6,11]。APOBEC3是一種胞嘧啶脫氨酶蛋白，APOBEC3家族由七種不同的蛋白質(zhì)組成，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其成員APOBEC3A和APOBEC3B受E6和E7的調(diào)節(jié)在HPV陽(yáng)性癌癥中高表達(dá)[26-27]。機(jī)制之一是，HPV16 E6通過(guò)p53的降解上調(diào)TEAD1/4，導(dǎo)致APOBEC3B的轉(zhuǎn)錄增加[28]。第二種機(jī)制是HPV16 E7通過(guò)APOBEC3A上的Cullin-2結(jié)合基序與APOBEC3A結(jié)合，該復(fù)合物的形成阻止了APOBEC3A的降解，但APOBEC3A酶的活性不變[29]。APOBEC3A/B酶的作用機(jī)制為在TCW(T：胸腺嘧啶，C：胞嘧啶，W：腺嘌呤或胸腺嘧啶)基序中使胞嘧啶脫氨基突變?yōu)樾叵汆奏せ蝤B(niǎo)嘌呤(G)，即：TCW→TTW和TCW→TGW突變，統(tǒng)稱(chēng)為“TCW”突變[29-30]。APOBEC3A在病毒感染宿主細(xì)胞時(shí)通過(guò)結(jié)合并編輯病毒DNA限制病毒感染，但APOBEC3B在細(xì)胞核中表達(dá)，在DNA修復(fù)過(guò)程中，APOBEC3B介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨作用可能參與HPV致癌過(guò)程。TCGA報(bào)告了228例原發(fā)宮頸癌的廣泛分子特征，觀察到其中192例HPV相關(guān)宮頸癌中150例富含APOBEC突變[6]。

六、結(jié)語(yǔ)

綜上所述，HR-HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要原因，HPV病毒不同變異體的致癌潛能不同，對(duì)HPV變異體的研究有助于從核苷酸水平或分子水平了解HPV致宮頸癌變的機(jī)制。HR-HPV感染宿主細(xì)胞后通過(guò)其免疫逃避機(jī)制逃脫機(jī)體的免疫反應(yīng)，病毒基因組通過(guò)宿主細(xì)胞的DNA損傷點(diǎn)整合入宿主基因組，整合導(dǎo)致E2癌基因被破壞而E6、E7過(guò)表達(dá)，過(guò)表達(dá)的E6、E7癌蛋白通過(guò)激活致癌基因、抑制抑癌基因、干擾有絲分裂、調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)量以及增加宿主細(xì)胞體細(xì)胞的突變等途徑導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。研究表明，病毒基因的整合可能是LSIL向HSIL進(jìn)展的早期事件，且miRNA在正常宮頸組織和宮頸病變組織中的表達(dá)水平差異較顯著，故對(duì)其的進(jìn)一步研究可能為宮頸癌惡性程度的早期判斷及預(yù)后提供較為準(zhǔn)確的生物學(xué)指標(biāo)。雖有研究提出由HPV介導(dǎo)的APOBEC突變可能系HPV相關(guān)腫瘤的主要突變來(lái)源，但目前證據(jù)不足，需要進(jìn)一步的研究來(lái)確定兩者是否相關(guān)。