鮑正清，方 冬，楊新宇，何 群，李學(xué)松，周利群，滿立波

(1.北京積水潭醫(yī)院泌尿外科，北京 100035；2.北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，北京大學(xué)泌尿外科研究所，國家泌尿、男性生殖系統(tǒng)腫瘤研究中心，北京 100034)

上尿路尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma，UTUC)發(fā)病率較低，在西方國家，其年發(fā)病率約為1～2/10萬，僅占所有尿路上皮癌的5%～10%[1-2]。根治性腎輸尿管全長(radical nephroureterectomy，RNU)聯(lián)合膀胱袖狀切除是其標(biāo)準(zhǔn)的治療方式[3]，然而，在手術(shù)治療時，60%的患者出現(xiàn)局部進(jìn)展，70%的患者為高級別腫瘤患者[4-5]。既往研究報(bào)道UTUC患者5年腫瘤特異性生存率(cancer-specific survival，CSS)為50%～80%。盡管腫瘤分期、分級、淋巴結(jié)狀態(tài)、淋巴血管浸潤(lymphovescular invasion，LVI)等預(yù)后指標(biāo)被認(rèn)為是預(yù)測UTUC進(jìn)展和復(fù)發(fā)的最重要因素，但UTUC的生物學(xué)基礎(chǔ)尚不完全清楚。細(xì)胞周期調(diào)控蛋白在腫瘤細(xì)胞分裂、腫瘤生長和進(jìn)展中起著重要作用[8]。細(xì)胞周期蛋白p14作為腫瘤抑制蛋白參與p53通路，已被發(fā)現(xiàn)在許多人類癌癥的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，包括膀胱癌[9-10]。雖然p14的生物學(xué)特性已被廣泛研究，但其在UTUC中的調(diào)控作用和臨床意義尚不清楚，而UTUC與膀胱癌有許多相似之處，但因其是不常見的尿路上皮癌，可能與膀胱尿路上皮癌不同[11]。本研究旨在探究p14蛋白在UTUC中的表達(dá)及其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 患者的選擇和評估回顧性收集了2006年1月至2013年12月間在北京大學(xué)第一醫(yī)院經(jīng)組織學(xué)確診并接受手術(shù)治療的657例連續(xù)性UTUC患者的資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：①缺失隨訪信息(58例)；②合并膀胱癌(94例)或其他惡性腫瘤(13例)；③接受非RNU治療(121例)；④最大腫瘤直徑≤15 mm(97例)。最終納入341例患者。對術(shù)前影像學(xué)或術(shù)中觀察發(fā)現(xiàn)腫大淋巴結(jié)的患者行常規(guī)淋巴結(jié)清掃術(shù)。根據(jù)國際腫瘤控制聯(lián)盟(Union for International Cancer Control，UICC)TNM分級指南(2002版)進(jìn)行分期評估，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO) 2004版分級系統(tǒng)進(jìn)行分級。采用改良的中國患者腎小球?yàn)V過率方程計(jì)算估計(jì)的腎小球?yàn)V過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR) [eGFR (mL·min-1·1.73 m-2)=175×血肌酐-1.234×年齡-0.179(女性×0.79)][12]。術(shù)前腎功能狀態(tài)判定標(biāo)準(zhǔn)：無慢性腎病 (eGFR≥60)、早期慢性腎病(60>eGFR≥15)和末期慢性腎病 (eGFR<15)[12]。

所有患者術(shù)后前3年每3個月行膀胱鏡檢查，隨后每年1次膀胱鏡檢查。同時行胸片、尿細(xì)胞學(xué)檢查、血清肌酐及腹部超聲/計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography,CT)/磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)檢查。最后1次隨訪時根據(jù)檢查結(jié)果確定腫瘤無病生存(disease-free survival，DFS)、CSS和膀胱內(nèi)無復(fù)發(fā)生存(intravesical recurrence free survival，IVRFS)。

1.2 免疫組化采用標(biāo)準(zhǔn)免疫組化方法檢測p14的表達(dá)。對多灶性腫瘤，選取最大的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行免疫組化分析?；谇捌趯?shí)驗(yàn)，切片用p14抗體 (ab3642， 1∶2 000，Abcam plc， Cambridge，UK)4 ℃孵育過夜，然后與山羊抗兔IgG/HRP聚合物(PV-9001，ZSGB-BIO，北京)室溫孵育20 min。

染色的組織切片由2位獨(dú)立的泌尿科病理醫(yī)師(楊新宇和何群)根據(jù)免疫組織化學(xué)評分系統(tǒng)(German Immunoreactive Score)進(jìn)行評分，通過多方一致的回顧調(diào)查和分析。總分12分，為免疫反應(yīng)細(xì)胞百分比得分(0分：0%～5%；1分：6%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：76%～100%)與染色強(qiáng)度得分(0分：陰性；1分：弱染色；2分：中度染色；3分：強(qiáng)染色)乘積，結(jié)果判定：陰性(-,0～1分)，弱陽性(+，2～4分)，中度陽性(++，6～8分)，強(qiáng)陽性(+++，9～12分)。將p14表達(dá)定義為+～+++。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所得數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 (IBM Corp，Armonk，NY，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05被認(rèn)定為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組間比較時，計(jì)數(shù)資料采用Pearson檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)，連續(xù)變量采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。單因素分析采用Log-rank檢驗(yàn)，多因素分析采用Cox比例風(fēng)險回歸模型。只有在單因素分析中確定為顯著的變量才納入多因素分析。

2 結(jié) 果

2.1 患者特征341例患者有190例男性和151例女性，手術(shù)時中位年齡為69(29～86)歲，術(shù)后中位隨訪為51(7～123)個月。該隊(duì)列患者包括208例腎盂腫瘤、93例低級別尿路上皮癌、248例高級別尿路上皮癌、124例非肌層浸潤性腫瘤(pTa或pT1)、217例肌層浸潤性腫瘤(pT2～4)、314例pN0腫瘤、3例pM1腫瘤和34例LVI腫瘤。合并鱗狀分化為45例，腺樣分化為18例，肉瘤樣分化為22例。此外，39例患者有馬兜鈴酸暴露史。

2.2 p14表達(dá)與UTUC患者臨床病理的關(guān)系147例 (43.1%)患者腫瘤組織p14表達(dá)陽性(圖1)。如表1所示p14表達(dá)陽性與腫瘤多灶性(P=0.010)、腎盂位置(P=0.013)、病理T分期較低(P=0.001)、腫瘤分級較低(P<0.001)、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)、乳頭狀腫瘤(P=0.001)、無鱗狀分化(P=0.017)有關(guān)。

表1 p14表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 [例(%)]

A：p14表達(dá)陽性(陽性染色以細(xì)胞核為主)；B：p14表達(dá)陰性。

2.3 p14表達(dá)的預(yù)后意義在隨訪期間，109例患者死亡，其中97例死于UTUC相關(guān)因素。82例(24%)患者術(shù)后出現(xiàn)膀胱內(nèi)復(fù)發(fā)，13例(3.8%)患者出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)，8例(2.35%)患者出現(xiàn)對側(cè)UTUC。Kaplan-Meier分析顯示p14表達(dá)陰性與較短的CSS (P=0.022)、DFS (P<0.001)和IVRFS (P=0.028)相關(guān)(圖 2)。

如表2所示，在Cox比例風(fēng)險回歸模型中，調(diào)整過患者性別、腫瘤分期、腫瘤分級、區(qū)域淋巴結(jié)狀態(tài)、LVI、腫瘤結(jié)構(gòu)、腺樣分化、肉瘤樣分化和馬兜鈴酸暴露史，p14表達(dá)陽性是CSS的獨(dú)立預(yù)測因素(HR=0.596，95%CI:0.381～0.934，P=0.024)。調(diào)整過患者性別、年齡、腫瘤分級、區(qū)域淋巴結(jié)狀態(tài)和LVI，p14表達(dá)陽性是DFS的獨(dú)立預(yù)測因素(HR=0.555，95%CI:0.395～0.778，P=0.001)。調(diào)整過患者性別、多灶性、輸尿管鏡檢和區(qū)域淋巴結(jié)狀態(tài)，p14表達(dá)陽性是IVRFS的獨(dú)立預(yù)測因素(HR=0.527，95%CI:0.317～0.876，P=0.014)。

表2 p14表達(dá)陽性與UTUC患者CSS、DFS和IVRFS的相關(guān)性分析

A：CSS；B：DFS；C：IVRFS。

3 討 論

細(xì)胞周期蛋白p14表達(dá)與UTUC患者的臨床病理特征和腫瘤預(yù)后相關(guān)的研究尚鮮見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，p14表達(dá)與多灶性(P=0.010)、腎盂位置(P=0.013)、低病理T分期(P=0.001)、低腫瘤分級(P<0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)、乳頭狀腫瘤(P=0.001)、鱗狀分化(P=0.017)等重要臨床病理特征相關(guān)，p14表達(dá)陽性是CSS的獨(dú)立預(yù)測因素(HR=0.596，95%CI:0.381～0.934，P=0.024)， DFS(HR=0.555，95%CI:0.395～0.778，P=0.001)和IVRFS (HR=0.527，95%CI：0.317～0.876，P=0.014)，這些可能幫助臨床醫(yī)生進(jìn)行UTUC患者危險分層以提供更好的個體化的輔助治療。

p14基因被認(rèn)為是一種多功能基因，參與了細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等多種生理過程[13-14]。當(dāng)組織增殖時，為了抑制組織增生p14表達(dá)增加[15]。而在腫瘤進(jìn)展過程中p14的表達(dá)水平是降低還是升高仍不清楚。有研究表明，p14在多種實(shí)體瘤中廣泛下調(diào)，包括胰腺癌、食管癌、乳腺癌和膀胱癌[16-17]。相反，也有研究表明p14在某些腫瘤中表達(dá)上調(diào)[18]。我們的研究表明p14的表達(dá)與病理T分期和腫瘤分級呈負(fù)相關(guān)。此外，p14表達(dá)陽性的患者具有更好的生存率和更低的膀胱內(nèi)復(fù)發(fā)風(fēng)險，這與在喉癌和人類頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的研究一致[19-20]。導(dǎo)致表達(dá)改變的可能機(jī)制是由于基因組丟失、啟動子高甲基化和表觀遺傳抑制[21-22]。然而，乳腺癌中p14表達(dá)的增加與疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險的增加和較差的生存結(jié)局相關(guān)[23]。既往關(guān)于膀胱癌的研究表明，p14 mRNA在正常尿路上皮和82%的淺表(Ta～T1)腫瘤中少量表達(dá)，而高水平的p14 mRNA主要表達(dá)在晚期和分級的腫瘤中[10]，p14+/p53-膀胱癌患者的生存期明顯短于其他p14/p53表達(dá)類型的患者。該矛盾的發(fā)現(xiàn)可能與p14的雙重功能有關(guān)，p14在某些腫瘤中起腫瘤抑制作用，但在其他腫瘤中具有致癌性，這也證明了UTUC是一種罕見的尿路上皮癌類型，可能與膀胱癌不同[11，25]。

本文是首個全國范圍內(nèi)的大樣本UTUC患者隊(duì)列中調(diào)查p14表達(dá)及其臨床意義的研究。通過進(jìn)行初步試驗(yàn)，我們優(yōu)化了免疫組化方案，從而確保了方案的可靠性和可重復(fù)性。本研究的結(jié)果將有助于研究p14在腫瘤進(jìn)程中的作用以及未來的靶向治療。但是該研究存在一些缺陷，首先該研究僅涉及p14單個指標(biāo)，若增加對p14相關(guān)聯(lián)蛋白的研究，如p53和鼠雙微體基因2(murine double minute 2，MDM2)等，則更能說明致癌過程為多因素共同作用。其次，本研究僅為單個中心數(shù)據(jù)的回顧性研究，可能存在選擇性和回憶偏倚，納入國內(nèi)多中心數(shù)據(jù)可使結(jié)果更具有說服力，且UTUC患者存在種族差異，因此需要進(jìn)一步來自非中國隊(duì)列的驗(yàn)證。另外，本研究的準(zhǔn)確性受到單一免疫組化方法的影響，其他技術(shù)(如逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)或基因測序等)可提高本研究的意義。最后，入組患者的腫瘤大小均不小于15 mm，以保證腫瘤組織樣本足以進(jìn)行免疫組化，這可能造成選擇偏倚。因此在今后的研究中，我們將增加研究指標(biāo)，納入多中心數(shù)據(jù)，采用多種檢測方法，并進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步闡明p14在UTUC發(fā)生發(fā)展中的作用。

綜上，UTUC中p14表達(dá)下調(diào)與腫瘤侵襲性生物學(xué)特征相關(guān)，p14表達(dá)陽性的UTUC患者往往具有更好的CSS、DFS和IVRFS。然而，我們的研究結(jié)果仍需要進(jìn)一步的驗(yàn)證并探討其相關(guān)的分子機(jī)制。