焦 揚,吳 帆，2

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽 550025；2.廣州市紅十字會醫(yī)院肝膽外科， 廣東 廣州 510220)

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居我國各類癌癥發(fā)病率的第4位，病死率居第2位[1]，對我國人民的生命健康造成了嚴(yán)重的威脅。因此，使用更快捷、簡便的檢測方法篩選出有效的肝癌診斷標(biāo)志物及治療靶點以指導(dǎo)肝癌的精準(zhǔn)治療是目前一項迫切的任務(wù)。DNA測序技術(shù)的出現(xiàn)為肝癌的診治帶來了新的途徑，尤其是第2代DNA測序技術(shù)因其通量大、靈敏度高、檢測速度快、成本低等優(yōu)點，成為了近年來極具吸引力的測序技術(shù)之一，已經(jīng)在肝癌研究中得以應(yīng)用并取得了巨大的進步。本文綜述了第2代DNA測序技術(shù)的發(fā)展及其在肝癌的基因突變、信號傳導(dǎo)通路等方面的應(yīng)用。

1 第1代DNA測序技術(shù)

DNA測序技術(shù)是指分析特定DNA片段的堿基序列(即腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的排列方式)的實驗技術(shù)。DNA測序技術(shù)的出現(xiàn)極大地推動了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究與發(fā)展，使得人類對基因的研究逐漸深入[2]。第1代DNA測序技術(shù)是SANGER等[3]于19世紀(jì)70年代在基因研究中發(fā)現(xiàn)的創(chuàng)新性技術(shù)，也被稱為“桑格測序技術(shù)”，該技術(shù)的原理是核苷酸在某一固定的堿基處開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鳥嘌呤結(jié)束的4組不同長度的核苷酸，然后在尿素變性的丙烯酰胺凝膠上電泳，從而獲得可見的DNA堿基序列。應(yīng)用桑格測序技術(shù)，人們首次完成了人類基因組的測序，但由于該技術(shù)是通過短鏈DNA片段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增實現(xiàn)的測序，因而成本高、工作量大，且只能對特定的樣本(如DNA片段)進行測序，這也決定了該技術(shù)無法直接應(yīng)用于癌癥患者的臨床診斷和治療。

2 第2代DNA測序技術(shù)

自桑格測序技術(shù)創(chuàng)建以來，盡管其仍然存在成本高且耗時長的固有缺點，但一直被作為分子生物學(xué)研究的金標(biāo)準(zhǔn)[4]。但隨著人們對基因研究的不斷深入以及科學(xué)技術(shù)的不斷革新，逐漸出現(xiàn)了第2代DNA測序技術(shù)。

2.1 第2代DNA測序技術(shù)的優(yōu)點近10 a來，第2代DNA測序技術(shù)逐漸成形，具有高通量、高靈敏度、低成本、耗時短等優(yōu)點[5]，其逐漸取代桑格測序技術(shù)成為目前基因研究中最常使用的方法之一。第1代DNA測序技術(shù)需要耗費數(shù)十億美元和數(shù)年時間才能完成人類基因組測序，第2代DNA測序技術(shù)則僅需耗費幾千美元并在短短幾天內(nèi)就能完成1個人的基因組測序，這為癌癥患者的及時診治帶來了曙光[6]。第2代DNA測序技術(shù)的成功在于其不需要提前了解序列，就可以同時對數(shù)百萬的基因片段進行大規(guī)模的測序，因此,使其耗費的成本和時間都顯著降低[7-8]。

在基礎(chǔ)研究方面，第2代DNA測序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于全基因組測序、全外顯子組測序、轉(zhuǎn)錄組測序、靶向區(qū)域測序、表觀遺傳測序等，使得基因相關(guān)的基礎(chǔ)研究得到了快速的發(fā)展，研究數(shù)據(jù)的分析也更加精確、可靠[9-11]。在臨床治療方面，第2代DNA測序技術(shù)可以用于各種疾病尤其是癌癥的分子診斷及預(yù)后評估，有助于癌癥的個性化治療和精準(zhǔn)醫(yī)療。第2代DNA測序技術(shù)已經(jīng)可以識別多種癌癥的突變基因，包括肝癌、膀胱癌、乳腺癌、甲狀腺癌、腎細胞癌、小細胞肺癌、前列腺癌、急性粒細胞白血病和慢性淋巴細胞白血病等，使精確、高效地識別癌癥的罕見特異性基因突變成為可能。正是第2代DNA測序技術(shù)的應(yīng)用和普及，才使癌癥基因組圖譜和國際癌癥基因組聯(lián)盟等大型研究項目得以進一步完善，從而為研究癌癥的類型及分類提供更加準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。

2.2 第2代DNA測序技術(shù)的方法目前，已經(jīng)有多家公司研發(fā)了各具特點的第2代DNA測序技術(shù)。Roche公司推出的測序技術(shù)是以焦磷酸測序法為基礎(chǔ)，依靠生物發(fā)光法對DNA序列進行檢測，在進行未知基因組測序方面具有較大優(yōu)勢，但在處理堿基序列時會因熒光信號的判斷錯誤導(dǎo)致核苷酸插入或缺失[12]。Illumina-Solexa公司利用其專利核心技術(shù)“DNA簇”和“可逆性末端終結(jié)”，實現(xiàn)自動化樣本制備及基因組中數(shù)百萬個堿基的大規(guī)模平行測序[13]。Ion Torrent公司推出了第1個不需要光學(xué)系統(tǒng)的測序儀，其所采用的技術(shù)為半導(dǎo)體測序，將化學(xué)信號通過半導(dǎo)體芯片直接轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，是適合擴增子測序的革命性技術(shù)[14]。SOLID公司使用連接法測序技術(shù)獲得基于“雙堿基編碼原理”的顏色編碼序列，對原始顏色序列進行數(shù)據(jù)分析后轉(zhuǎn)換成顏色編碼的標(biāo)準(zhǔn)序列，把顏色序列定位到標(biāo)準(zhǔn)序列上，同時校正測序錯誤，結(jié)合原始顏色序列的質(zhì)量信息發(fā)現(xiàn)潛在單核苷酸多態(tài)性位點[15]。QIGEN公司推出的Gene Reader系統(tǒng)包含了從最初的數(shù)據(jù)收集到最終的數(shù)據(jù)分析，建立了一個標(biāo)準(zhǔn)的第2代DNA測序技術(shù)工作流程，可以靶向DNA檢測并得到明確的臨床結(jié)果[16]。

第2代DNA測序技術(shù)除了上述幾種測序技術(shù)外，還有美國太平洋生物科學(xué)公司、英國牛津納米孔技術(shù)有限公司、Bionano Genomics公司等的測序技術(shù)[17-19]，這些測序技術(shù)在不同的方面展現(xiàn)出了各自的優(yōu)勢，是測序技術(shù)的一次重要改革，增加了測序的通量，縮短了時間，降低了成本。第2代DNA測序技術(shù)比桑格測序技術(shù)的涵蓋面更加寬廣，同時可以實現(xiàn)臨床實驗室要求的特異性、敏感性、重現(xiàn)性和分析準(zhǔn)確性。

2.3 第2代DNA測序技術(shù)的基本步驟無論使用何種平臺進行第2代DNA測序技術(shù)測序，都需要以下步驟[20]：(1)臨床病理診斷、提取樣本DNA/RNA；(2)選擇第2代DNA測序技術(shù)測序類型，包括全基因組測序、全外顯子組測序、靶向測序等；(3)基因文庫生成，指選擇DNA片段并通過適配器放大和濃縮樣品；(4)依賴平臺生成模版；(5)進行數(shù)據(jù)分析、序列質(zhì)量評價、比對參考序列、變異調(diào)用、變異注釋、致病變異的識別、解釋和分類。

3 第2代DNA測序技術(shù)在肝癌研究中的應(yīng)用

3.1 第2代DNA測序技術(shù)在肝癌基因突變研究中的應(yīng)用第2代DNA測序技術(shù)的出現(xiàn)及應(yīng)用，使對肝癌基因突變的研究取得了巨大的突破。使用第二代DNA測序技術(shù)檢測肝癌基因突變是通過分別提取正常肝臟組織、肝癌癌旁組織、肝癌原發(fā)灶組織、肝癌轉(zhuǎn)移灶組織及肝癌異體移植組織等的DNA進行基因組測序，使用Newbler、AMOScmp、Phred/Phrap/Consed/Polyphred和Velvet等軟件進行基因組組裝后與基因組平均讀取覆蓋度進行比較，過濾掉低質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，將高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)與參考基因組或數(shù)據(jù)庫進行比對，篩選出單堿基變異、插入缺失、拷貝數(shù)變異、結(jié)構(gòu)變異等，然后可利用Glimmer、GeneMarkS、Prodiga等蛋白質(zhì)編碼基因預(yù)測軟件進行基因預(yù)測，再利用特定的軟件或數(shù)據(jù)庫進行基因組注釋得到基因組序列，分析預(yù)測其對蛋白質(zhì)功能的影響。

KAN等[21]通過第2代DNA測序技術(shù)對88例肝癌患者進行基因組測序分析，不僅驗證了眾多已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的基因突變位點，同時還發(fā)現(xiàn)了BRCA2基因和IGF1R基因新突變位點，從而為肝癌發(fā)生機制的研究提供了新的思路。此外，LU等[22]通過第2代DNA測序技術(shù)研究p53基因突變在人肝癌細胞中的作用，也發(fā)現(xiàn)了一些既往認為與肝癌無關(guān)的癌基因的突變，包括RUNX1基因和 JAK3 基因，這對于肝癌基因圖譜的完善有很大的幫助。OBA等[23]利用第2代DNA測序技術(shù)開展的研究也表明，ARID2基因的缺失減弱了DNA損傷部位的核苷酸切除修復(fù)，提示ARID2基因可能參與DNA的修復(fù)。ARID2基因在肝炎相關(guān)肝癌組織中表達下調(diào)，其也被認為是肝炎相關(guān)肝癌細胞中基因突變的抑制因子，因而有望利用ARID2基因誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，從而對肝炎相關(guān)肝癌患者的治療帶來新的突破[23]。YIN等[24]通過第2代DNA測序技術(shù)對肝癌患者的體細胞線粒體DNA突變進行分析，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中D-環(huán)區(qū)突變的異質(zhì)性水平顯著升高，提示肝癌組織中D-環(huán)區(qū)突變可能是陽性選擇；同時也發(fā)現(xiàn)D-環(huán)區(qū)突變患者的線粒體DNA拷貝數(shù)明顯較低，癌癥復(fù)發(fā)的可能性更大；體外實驗進一步表明，D-環(huán)區(qū)突變的肝癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯高于無D-環(huán)區(qū)突變的肝癌細胞。

3.2 第2代DNA測序技術(shù)在肝癌信號傳導(dǎo)通路研究中的應(yīng)用通過第2代DNA測序技術(shù)對基因序列進行高通量篩選，并結(jié)合相應(yīng)的細胞功能實驗，不僅可以驗證和發(fā)現(xiàn)基因突變位點，而且還可以為基因的信號傳導(dǎo)通路研究提供方向。近年來已發(fā)現(xiàn)TERT啟動子、CTNNB1、AXIN1、LAMA2、ARID1A、WWP1等眾多基因在肝癌發(fā)生發(fā)展的過程中具有顯著的調(diào)控作用[25-30]。此外，第2代DNA測序技術(shù)同樣可以應(yīng)用于非編碼RNA的信號通路研究中。ZHUANG等[31]報道了一種新的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)-DRHC，lncRNA-DRHC 在肝癌細胞中呈低表達，且其低表達與肝癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，在體外實驗中也發(fā)現(xiàn)其可以抑制肝癌細胞系的增殖、遷移、侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；基于第2代DNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn) lncRNA-DRHC與MYBBP1A基因存在相互作用，并且lncRNA-DRHC可通過轉(zhuǎn)錄因子c-Myb調(diào)節(jié)有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路中的MEK/ERK信號通路，表明lncRNA-DRHC在肝癌的進展中起著關(guān)鍵作用，其有望成為一個新的肝癌治療靶點。ZHANG等[32]采用第2代DNA測序技術(shù)對肝癌患者腫瘤相關(guān)成纖維細胞和癌旁成纖維細胞的外顯子進行測序發(fā)現(xiàn)，肝癌患者腫瘤相關(guān)成纖維細胞提取液中外泌體內(nèi)的微RNA (microRNA,miR)-320a水平顯著降低，進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-320a可以通過與其下游靶點PBX3基因結(jié)合來抑制MAPK通路的激活，從而抑制腫瘤的進展，發(fā)揮抗腫瘤作用，因此，miR-320a可能是抑制肝癌進展的潛在治療靶點。CHAVALIT等[33]采用第二代DNA測序技術(shù)對聚乙二醇-干擾素α-2a治療后的慢性肝炎患者血清中的乙肝病毒編碼的miR-3(hepatitis B virus encoded microRNA-3，HBV-miR-3)進行分析，證實HBV-miR-3可通過抑制鎂離子依賴的蛋白磷酸酶1A的表達促進肝癌相關(guān)細胞的增殖，這是首次在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)乙肝病毒編碼的miRNA可以調(diào)節(jié)宿主基因的表達。

3.3 第2代DNA測序技術(shù)在肝癌其他方面研究中的應(yīng)用第2代DNA測序技術(shù)還可以用于篩選肝癌診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。徐紅梅等[34]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)獲取4例肝癌患者和3例健康對照者外周血單個核細胞中環(huán)狀RNA的差異表達譜，采用GO/KEGG富集分析差異表達顯著的環(huán)狀RNA及其潛在功能和信號通路，并對其中6種顯著差異的環(huán)狀RNA通過實時熒光定量PCR在72例肝癌患者和30例健康對照者外周血單核細胞樣本中再次進行驗證，最后結(jié)合受試者工作特征曲線發(fā)現(xiàn)circ0000798最有潛力成為肝癌無創(chuàng)性診斷分子標(biāo)志物。CHEN等[35]通過使用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，HK2基因和ENO1基因在肝癌組織中的表達明顯高于正常組織，并且HK2基因和ENO1基因在p53突變型肝癌組織中的表達也明顯高于p53野生型肝癌組織，提示HK2基因和ENO1基因與突變型p53肝癌的發(fā)生有關(guān)；同時根據(jù)HK2基因和ENO1基因在熱圖中是紅色像素，采用Kaplan-meier方法對這2種基因進行總體生存曲線分析，顯示其在預(yù)后較差的肝癌患者中呈高表達，提示HK2基因和ENO1基因是潛在的肝癌預(yù)后標(biāo)志物，同時驗證了利用世界范圍內(nèi)豐富的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)數(shù)據(jù)來識別肝癌新的潛在標(biāo)志物具有很好的效果。此外，第2代DNA測序技術(shù)也有助于肝癌治療藥物的研發(fā)。王惠國等[36]通過對HepG2和Huh7肝癌細胞給予不同濃度的青蒿素，培養(yǎng)不同時間，再利用第2代DNA測序技術(shù)對2種肝癌細胞系中的miRNA進行測序分析，并結(jié)合細胞活力實驗和細胞克隆實驗證實，青蒿素可抑制HepG2和Huh7肝癌細胞系的增殖，且青蒿素的這種效應(yīng)具有劑量依賴性和時間依賴性。此外，王惠國等[35]還通過靶基因富集分析第2代DNA測序技術(shù)得到的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，青蒿素是通過調(diào)控Rap1和MAPK信號通路抑制HepG2和Huh7肝癌細胞系的增殖，這為青蒿素在肝癌治療中的應(yīng)用提供了新的實驗依據(jù)。

4 總結(jié)與展望

第2代DNA測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用對于肝癌研究發(fā)揮了顯著的促進作用，為肝癌精準(zhǔn)醫(yī)療、個性化治療等醫(yī)療理念的實現(xiàn)提供了有力的支撐，并可為尋找新的肝癌治療靶點和診斷標(biāo)志物提供重要的實驗依據(jù)。近幾年來，成本更低、測序速度更快、PCR偏倚更小的第3、4代測序技術(shù)正在逐漸出現(xiàn)，但第3、4代測序技術(shù)目前仍處于發(fā)展測試階段，技術(shù)還不夠成熟，尚不能為肝癌研究帶來質(zhì)的改變，相信隨著技術(shù)的改進和完善其在未來也將成為肝癌研究的重要方法。