唐 杰，何 京綜述，張金艷審校

0 引 言

人體的不同部位含有不同種類(lèi)的微生物，這類(lèi)微生物被稱(chēng)為微生物群。人類(lèi)與其微生物群之間的關(guān)系是復(fù)雜的；微生物也是體內(nèi)平衡最重要的組成部分之一。微生物組-宿主內(nèi)環(huán)境平衡與肥胖、多種癌癥、早產(chǎn)、炎癥和過(guò)敏性疾病以及神經(jīng)發(fā)育障礙有關(guān)。一些癌癥和微生物，如胃淋巴瘤和幽門(mén)螺桿菌感染，已經(jīng)建立了直接而又強(qiáng)有力的因果關(guān)系。也就是說(shuō)，幽門(mén)螺桿菌感染可能會(huì)導(dǎo)致胃淋巴瘤，根除感染源則具有治療效果。癌癥和微生物群落之間的聯(lián)系較復(fù)雜，微生物群落的轉(zhuǎn)變可通過(guò)炎癥、微環(huán)境變化或破壞脫氧核糖核酸的毒素導(dǎo)致各種癌癥。理解導(dǎo)致失調(diào)的機(jī)制，我們將能夠闡明導(dǎo)致惡性腫瘤的途徑和研究新的治療方式。臨床診斷中，由于培養(yǎng)技術(shù)的局限性，通過(guò)二代測(cè)序(next generation sequencing,NGS)技術(shù)越來(lái)越多地研究不同身體部位的微生物群的組成，可能檢出一些與卵巢癌或?qū)m頸癌相關(guān)的非正常微生物菌群。相應(yīng)的，在患者標(biāo)本中檢測(cè)到了這些微生物群是否可以作為相關(guān)腫瘤的輔助生物學(xué)指標(biāo)。本文就微生物組成在女性惡性腫瘤中的作用研究進(jìn)展作一綜述。

1 微生物組成的檢測(cè)技術(shù)

1.1 早期微生物組成檢測(cè)技術(shù)早期檢測(cè)技術(shù)較局限，主要依賴顯微鏡和培養(yǎng)來(lái)鑒定[1]。顯微鏡技術(shù)是鑒定病毒以外的微生物，借助染色鑒別細(xì)菌形態(tài)、結(jié)構(gòu)和染色特性。培養(yǎng)技術(shù)是依據(jù)經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)造細(xì)菌賴以生存的環(huán)境，鑒別細(xì)菌的菌落顏色、大小等培養(yǎng)特性。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，可能被測(cè)序技術(shù)逐漸取代。

1.2NGS

1.2.1 NGS發(fā)展歷程1977年，F(xiàn)red Sanger在文章中描述了雙脫氧鏈終止子測(cè)序；1981年，Anderson等發(fā)現(xiàn)了人類(lèi)基因組的第一部分—線粒體DNA；1995年，F(xiàn)leischmann等發(fā)現(xiàn)了流感嗜血桿菌的首個(gè)完整的細(xì)菌基因組[2]。1996年，世界范圍的努力產(chǎn)生了第一個(gè)完整的真核基因組——釀酒酵母。很明顯，21世紀(jì)初人類(lèi)基因組的發(fā)表是基因組學(xué)興起的主要原因，標(biāo)志著測(cè)序時(shí)代的開(kāi)始，現(xiàn)代科學(xué)家才有可能直接研究遺傳分子。然而，大規(guī)模的DNA測(cè)序有許多缺點(diǎn)，包括昂貴的試劑成本和操作測(cè)序平臺(tái)所需的大量人力資源[3]。

2005年，454生命科學(xué)公司(現(xiàn)為羅氏公司的一部分)發(fā)布了焦磷酸測(cè)序技術(shù)，引發(fā)了一場(chǎng)革命。這種被稱(chēng)為NGS的高通量技術(shù)，運(yùn)行一次產(chǎn)生數(shù)千到數(shù)百萬(wàn)個(gè)短序列讀數(shù)。此后，許多NGS技術(shù)相繼出現(xiàn)，包括自2006年以來(lái)由索萊克斯/艾默娜測(cè)序儀使用的合成測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)目前占據(jù)了NGS市場(chǎng)的很大一部分。由于儀器和新技術(shù)的不斷出現(xiàn)和不斷改進(jìn)，二代測(cè)序領(lǐng)域非常活躍[3]。這些不僅對(duì)于獲得有關(guān)細(xì)菌基因組的基礎(chǔ)知識(shí)至關(guān)重要，而且對(duì)于開(kāi)發(fā)測(cè)序策略并為未來(lái)的微生物基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)奠定基礎(chǔ)至關(guān)重要。

NGS可分析從患者體內(nèi)分離的細(xì)菌菌株的抗生素耐藥性，檢測(cè)多態(tài)性與疾病表現(xiàn)或嚴(yán)重程度之間的聯(lián)系。NGS的另一個(gè)重要應(yīng)用是實(shí)時(shí)追蹤流行病，還可用作追蹤醫(yī)院環(huán)境中細(xì)菌轉(zhuǎn)移的臨床工具[2]。NGS技術(shù)包括多層樣品收集、制備和分析。測(cè)序數(shù)據(jù)的使用超越了基礎(chǔ)科學(xué)的核心，但也是轉(zhuǎn)化研究的基礎(chǔ)，可用作診斷工具，用于治療風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估或臨床干預(yù)。NGS的使用擴(kuò)展了診斷微生物學(xué)和流行病學(xué)的能力。使用核糖核酸測(cè)序技術(shù)可以詳細(xì)研究細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)雜的調(diào)節(jié)過(guò)程。

1.2.2常見(jiàn)的NGS技術(shù)①16S rDNA測(cè)序：檢測(cè)編碼細(xì)菌16s rRNA的DNA序列，定量評(píng)估各種微生物群落中物種的組成和比例。其中Illumina Miseq平臺(tái)性價(jià)比最高，檢測(cè)細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4高變區(qū)覆蓋率廣且質(zhì)量高。②全基因組shotgun測(cè)序：對(duì)整個(gè)或全基因組進(jìn)行測(cè)序。③IS-pro技術(shù)：基于每種細(xì)菌特異性的IS區(qū)域長(zhǎng)度來(lái)分析。④定量(實(shí)時(shí))PCR：能夠檢測(cè)定量變化[1]。

2 微生物群與癌癥

定植于人體的微生物統(tǒng)稱(chēng)為微生物群。人體為定植的微生物提供適宜且營(yíng)養(yǎng)豐富的微環(huán)境，微生物群則有益于促進(jìn)人體代謝和免疫調(diào)節(jié)。健康人由于遺傳、飲食、環(huán)境和其他很大程度上未知的因素，顯示出不同的微生物組分。

致癌作用是感染因子、宿主狀態(tài)(基因多態(tài)性和免疫功能狀態(tài))和環(huán)境因素(吸煙、化學(xué)物質(zhì)、電離輻射和免疫抑制劑)等多種因素共同作用的結(jié)果。癌癥的出現(xiàn)依賴著細(xì)胞代謝的改變和炎癥，宿主-微生物間的相互作用可能不是癌癥發(fā)生的直接條件，有可能是間接的。直接致癌物如HTLV-1和KSHV，表達(dá)病毒致癌基因引起癌變；間接致癌物如幽門(mén)螺旋桿菌，引起慢性炎癥導(dǎo)致細(xì)胞癌變，最終演變成胃癌[4]。這些疾病往往不是由于單一病原體的改變，是微生物相對(duì)豐度的改變。短期生物失調(diào)對(duì)癌癥的影響不大，但生物失調(diào)的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)以及可能與其他危險(xiǎn)因素的聯(lián)合作用，則發(fā)揮較大的臨床意義。感染的持續(xù)和反復(fù)導(dǎo)致的炎癥浸潤(rùn)和菌群失調(diào)，是重要的危險(xiǎn)因素，女性生殖系統(tǒng)腫瘤中微生物組成的潛在致癌作用是本篇綜述想要闡述的內(nèi)容。

3 上生殖道的微生物群

細(xì)菌定植在人體的大部分部位，其中也包括女性生殖道。盡管已經(jīng)確定了陰道微生物群的存在，但是很多人認(rèn)為上生殖道是無(wú)菌環(huán)境，并且一般認(rèn)為細(xì)菌的存在與不良的臨床表現(xiàn)有關(guān)。有宏基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)子宮,輸卵管,卵巢和胎盤(pán)存在著特定菌群。雖然微生物多樣性被認(rèn)為是許多身體部位健康的標(biāo)志，但高度多樣性的陰道微生物群通常被認(rèn)為是非典型的或生物失調(diào)的狀態(tài)，并與疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。

陰道微生物群的組成受許多因素的影響。種族是一個(gè)主要的內(nèi)在因素，亞洲女性乳酸桿菌占明顯優(yōu)勢(shì)。陰道微生物群主要由卷曲乳酸桿菌、乳酸桿菌、加氏乳酸桿菌或詹氏乳酸桿菌組成，并通過(guò)乳酸生產(chǎn)和免疫調(diào)節(jié)在內(nèi)的幾種其他機(jī)制降低陰道酸堿度來(lái)預(yù)防泌尿生殖系統(tǒng)疾病。Ravel等[5]描述了四種類(lèi)型的乳酸桿菌群落，第一、第二、第三和第五組，分別由卷曲乳酸桿菌(L.crispatus)、加氏乳酸桿菌(L.gasseri)、惰性乳酸桿菌(L.iners)和詹氏乳酸桿菌(L.jensenii)組成，與其他四類(lèi)群落相比，第四類(lèi)群落含有更高比例的嚴(yán)格厭氧微生物，與陰道酸堿度顯著降低有關(guān)，這有可能升高感染的風(fēng)險(xiǎn)，提示乳酸桿菌在維持機(jī)體免疫功能方面具有重要的保護(hù)作用。Nené等[6]又將Ravel的四個(gè)乳酸菌群落I、II、III和V組成一個(gè)微生物群落，稱(chēng)之為L(zhǎng)型群落。并將樣本分為宮頸陰道菌群組成至少為50%的L型人群和微生物群組成少于50%組成的L型人群，稱(chēng)為O型群落。O型群落的細(xì)菌多樣性更高，由典型的專(zhuān)性和兼性厭氧菌屬(如加德納菌屬或阿托波菌屬)組成，與需氧性陰道炎和細(xì)菌性陰道炎有關(guān)。細(xì)菌性陰道病的特征是健康微生物群的轉(zhuǎn)變，其中的主要細(xì)菌菌群乳酸桿菌被加德納氏菌屬(Gardnerellaspp)、阿托波菌屬(Atopobiumspp)、支原體和普氏菌屬(Prevotellspp)等其他菌種取代。細(xì)菌性陰道病是陰道微生物群的一種病理狀態(tài)，其特征是乳酸桿菌下降和厭氧菌升高，厭氧菌釋放揮發(fā)性胺，其中一些胺轉(zhuǎn)化為致癌物質(zhì)[7]。

Virtanen等[8]利用NGS檢測(cè)宮頸中的微生物群，對(duì)10名絕經(jīng)前的芬蘭婦女進(jìn)行了采樣，主要收集的是陰道穹隆，陰道壁和子宮頸的樣本。根據(jù)16S rRNA基因的Illumina MiSeq測(cè)序，比較樣品的DNA和蛋白質(zhì)產(chǎn)量，細(xì)菌載量，微生物群多樣性和物種組成。研究還記錄了受試者吸煙情況，避孕藥使用情況，末次月經(jīng)以及最近的抗生素使用情況等影響因素。實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)是對(duì)16sRNA基因的高變V1-V3區(qū)進(jìn)行測(cè)序產(chǎn)生的微生物區(qū)系。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到這10名婦女的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是乳酸桿菌屬、巨球菌屬、普氏菌屬和陰道阿托波菌屬。個(gè)體之間差異很大，10名婦女中有6名微生物群以乳酸桿菌為主，其余的婦女中以腸桿菌科、Lachnospiraceae(毛螺菌科) BVAB1、普氏菌屬或巨球菌屬為主。在以乳酸桿菌為主的6例患者中4例患者以惰性乳酸桿菌為主(CST Ⅲ型)和2例以卷曲乳酸桿菌為主(CST Ⅰ型)。

4 人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)與微生物群

HPV據(jù)研究有200多個(gè)HPV基因型，40多個(gè)基因型與生殖道粘膜有親和力，可通過(guò)性接觸傳播。人體會(huì)在幾年內(nèi)消除大多數(shù)HPV感染，未被免疫系統(tǒng)清除的HPV感染可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重健康后果。低風(fēng)險(xiǎn)HPV往往引起良性異常，即生殖器疣。高風(fēng)險(xiǎn)的HPV基因型是公認(rèn)的宮頸癌(cervical cancer,CC)、外陰癌、陰莖癌、肛門(mén)癌和口咽癌的致癌因素[9]。

人持續(xù)感染高危型HPV(high risk human papilloma virus, HR-HPV)是CC發(fā)展的主要誘因[10]。CC及其癌前病變，宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)的重要風(fēng)險(xiǎn)因素之一就是HPV感染，感染HPV對(duì)其發(fā)生過(guò)程來(lái)說(shuō)是必要的，但還不足以導(dǎo)致最終病理改變。免疫缺陷[11]、吸煙和口服避孕藥等因素,可能會(huì)影響病毒感染以及感染后的病理改變。除HPV感染外，微生物群落組成也可能在宮頸癌發(fā)生中起作用。最近，越來(lái)越多的證據(jù)表明，宮頸陰道微生物群可能是CC病因的重要輔助因子。陰道微生物平衡可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[12]。宮頸陰道微生物群通過(guò)升高酸堿度在宮頸癌中發(fā)揮潛在作用已有報(bào)道。陰道微生物群失調(diào)會(huì)導(dǎo)致多種婦科疾病，如CIN和宮頸癌。同時(shí)，宮頸癌會(huì)破壞正常的陰道和子宮頸黏膜，從而導(dǎo)致正常菌群與非正常菌群之間的比率發(fā)生變化[13]。

Onywera等[14]收集了87名南非黑人育齡婦女的宮頸樣本，用Illumina測(cè)序法對(duì)細(xì)菌16srRNA基因V3-V4高變區(qū)的微生物群進(jìn)行了鑒定。研究結(jié)果顯示，與低風(fēng)險(xiǎn)HPV感染或無(wú)HPV感染的婦女相比，高風(fēng)險(xiǎn)HPV感染的婦女氣球菌科、假單胞菌科和雙歧桿菌科，加德納菌、纖毛菌和阿托波菌的相對(duì)豐度明顯較高。Chen等[15]研究結(jié)果表明，妊娠和HPV感染伴隨著CST I(以卷曲乳桿菌為主)比例的增加。雙歧桿菌科、芽孢桿菌屬、巨球型菌屬、纖毛菌屬、普氏菌以及加德納菌，F(xiàn)astidiosipila和戴阿利斯特桿菌屬是受hrHPV感染的女性的生物標(biāo)志物。

總而言之，患者感染HPV后微生物群豐度增加，主要表現(xiàn)為乳酸桿菌比例降低，非乳酸桿菌比例增加。感染HPV增加的微生物是否可作為一個(gè)生物學(xué)指標(biāo)還需要更多臨床研究來(lái)證明。

5 宮頸癌微生物群

5.1 存在HPV感染的宮頸癌患者的微生物群OH等[16]使用16S rRNA基因的焦磷酸測(cè)序分析了70名CIN(宮頸上皮內(nèi)瘤變)患者和50名對(duì)照組患者的宮頸菌群，發(fā)現(xiàn)陰道阿托波菌、陰道加德納菌和乳酸桿菌作為宮頸微生物群的優(yōu)勢(shì)菌與CIN風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，提示細(xì)菌失調(diào)及其與致癌的HPV的結(jié)合可能是宮頸癌的危險(xiǎn)因素。人類(lèi)乳頭瘤病毒陽(yáng)性婦女(34例)的擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、軟壁菌門(mén)和變形菌門(mén)等的豐度高于人類(lèi)乳頭瘤病毒陰性婦女(14例)。Zhang等[17]使用基于16S rRNA基因的Illumina測(cè)序分析了126名CIN 1型和40名CIN 2+ (CIN 2型和CIN 3型)婦女的宮頸微生物群。發(fā)現(xiàn)CIN與脆弱擬桿菌、德氏乳酸桿菌和無(wú)乳鏈球菌間接相關(guān)。aniewski等[18]的研究證明與宮頸癌相關(guān)的微生物群組成主要有纖毛菌屬、奇異菌屬、假單胞菌屬、梭桿菌屬、厭氧菌屬和消化鏈球菌屬。

5.2艾滋病患者微生物群Klein等[19]收集了144名坦桑尼亞婦女的宮頸刷樣本，對(duì)細(xì)菌16sRNA基因進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在感染HPV背景下，艾滋病毒陽(yáng)性患者比艾滋病毒陰性患者微生物群豐度更高。HPV感染進(jìn)展取決于宿主免疫狀態(tài)，不論是艾滋病毒陽(yáng)性還是非乳酸桿菌豐度增高均可提示這兩種因素在存在HPV感染的前提下加劇了宮頸癌變，這可能允許某些子宮頸微生物群被用作診斷宮頸癌高危人群的標(biāo)志物，預(yù)防性補(bǔ)充益生菌或進(jìn)行抗生素治療可以促進(jìn)健康的微生物群定植，可能會(huì)減緩病變進(jìn)程；長(zhǎng)期關(guān)注微生物群的變化是否可前瞻性預(yù)測(cè)病變發(fā)展還需要大量進(jìn)一步臨床研究。

6 卵巢癌患者的微生物群

有證據(jù)表明陰道細(xì)菌可通過(guò)子宮頸上升至上生殖道，但這些部位的細(xì)菌定植似乎與陰道定植菌落不同。Pelzer等[20]證明女性上生殖道不是無(wú)菌的，對(duì)16個(gè)接受全子宮切除術(shù)的婦女的輸卵管進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果中涉及的主要菌種有葡萄菌屬、腸球菌屬、假單胞菌屬、乳酸桿菌屬、伯克霍爾德氏菌屬以及丙酸桿菌屬。Miles等[21]收集10個(gè)接受全子宮切除術(shù)和雙側(cè)切除術(shù)的婦女卵巢樣本，對(duì)16S rRNA基因的V1-V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序來(lái)檢測(cè)每個(gè)樣本的微生物組成。主要有厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)。Lin等[22]進(jìn)行的一項(xiàng)基于人口的研究表明患盆腔炎的婦女患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)增加。一些組織也報(bào)道了衣原體和生殖器支原體可能與卵巢上皮性腫瘤有關(guān)。Zhou等[23]采用16S rRNA高通量測(cè)序方法，分析了卵巢癌組織(25份樣品)和正常輸卵管遠(yuǎn)端組織(25份樣品)微生物群落的多樣性和組成。他們的高通量測(cè)序結(jié)果顯示卵巢癌組織的多樣性和豐富度指數(shù)與正常輸卵管遠(yuǎn)端組織相比明顯降低。在卵巢癌中，變形桿菌/厚壁菌門(mén)的比率顯著增加，這表明微生物組成的變化可能與卵巢癌的發(fā)展過(guò)程有關(guān)。Miao等[24]提出了用血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物和微生物特征來(lái)檢測(cè)卵巢癌，分析了30名患者樣本，指出有18種OTU與卵巢癌診斷高度相關(guān)，主要涉及普氏菌屬、擬桿菌屬、厚壁菌門(mén)、梭菌屬、毛螺菌科、疣微菌門(mén)。卵巢癌是由多種復(fù)雜因素引起的，但其與微生物和感染相關(guān)的病因尚不清楚。

7 結(jié)語(yǔ)與展望

宮頸癌、卵巢癌這兩種女性生殖道惡性腫瘤,發(fā)病率較高。早期臨床發(fā)現(xiàn)，早期治療對(duì)患者治療及預(yù)后有積極意義。了解兩種生殖道惡性腫瘤的高危因素，更能夠有利于早防早治。其中宮頸癌的高危因素主要是HR-HPV的感染，然而可能必要但不完全，后期的正常菌群紊亂帶來(lái)的負(fù)面影響加劇了這一過(guò)程，在HR-HPV感染的前提下檢出與宮頸癌相關(guān)的非正常微生物菌群(陰道加德納菌、陰道阿托波菌、假單胞菌屬、擬桿菌屬等)將可能作為一個(gè)宮頸癌的先兆危險(xiǎn)信號(hào)，來(lái)提醒臨床醫(yī)師以及患者。

臨床診斷中，由于培養(yǎng)技術(shù)的局限性，通過(guò)NGS技術(shù)越來(lái)越多地研究不同身體部位的微生物群的組成，檢出一些與卵巢癌或?qū)m頸癌相關(guān)的非正常微生物菌群。在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，希望通過(guò)NGS技術(shù)對(duì)宮頸癌及卵巢癌患者的宮頸拭子或是卵巢組織標(biāo)本進(jìn)行微生物菌群檢測(cè)，來(lái)獲取相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步印證上述觀點(diǎn)。