齊越

通遼市食品藥品檢驗所食品室 內(nèi)蒙古通遼 028000

乳酸桿菌大量存在于各種乳制品中，常見的有保加利亞乳桿菌、嗜酸乳酸桿菌和乳酪乳桿菌等，這些乳酸桿菌可以被用來食品發(fā)酵和生物檢定，但是一些乳酸桿菌尤其是乳桿菌也可能成為物質(zhì)腐爛的主要細(xì)菌之一。在微生物種類檢定中，常用高度保守性的16S rDNA 序列進行檢定，本文針對含有酒花物質(zhì)的啤酒，利用實時熒光PCR 技術(shù)對啤酒中的乳酸桿菌進行檢測和控制，設(shè)計通用引物和特異性探針，驗證該技術(shù)方法在乳酸桿菌的檢定中具有高度特異性、靈敏度和快速簡便的特征。

1 試驗材料和試驗方法

1.1 原材料

本試驗選擇植物乳酸桿菌、干酪乳酸桿菌、保加利亞乳酸桿菌開展試驗，所有菌種均從實驗室分離得到[1]。

1.2 試驗設(shè)備和試劑

本試驗研究選擇實時熒光PCR 基因擴增設(shè)備、臺式高速離心機、恒溫振蕩設(shè)備和厭氧罐作為試驗設(shè)備，選擇MRS 等培養(yǎng)基，以及細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒等試劑。

1.3 試驗方法和試驗步驟

首先第一步，在培養(yǎng)基中進行細(xì)菌培養(yǎng)，然后從試劑中提取基因組DNA，要求在有氧和厭氧的條件下分別培養(yǎng)菌種，以37℃的溫度恒溫培養(yǎng)48 小時后提取細(xì)菌。第二步，設(shè)計實時熒光PCR通用引物和特異性探針，即針對16S rDNA 序列同源性通用比較和非同源性參考菌株的特異性檢測，在同源性較高的地方設(shè)計乳酸桿菌通用性引物和探針。第三步，將乳酸桿菌菌株稀釋到不同的梯度后，在不同的反應(yīng)溫度和時間下開展靈敏度檢測。具體檢測步驟包括：將乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株放置于相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間，然后檢測其靈敏度值，估計菌株的數(shù)量，然后按照不同梯度進行稀釋，取最后幾個梯度的菌株液涂平板計數(shù)，如此循環(huán)多次后取平均值確定最后的菌密度，將每一個梯度的菌株液體各取3 管開展實時熒光PCR 檢測，并將檢測的結(jié)果和平板計數(shù)結(jié)果相對照，以確定反應(yīng)菌株的靈敏度情況。最后第四步開展特異性檢測，即將乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、大腸桿菌、沙門氏菌、黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌、弗氏志賀菌分別放置在菌液中培養(yǎng)并提取細(xì)菌DNA，將以上幾種細(xì)菌的DNA 混合后再進行實時熒光PCR 檢測，可檢測非同源性參考菌株的特異性[2]。

2 試驗結(jié)果和分析

2.1 靈敏度檢測結(jié)果

將植物乳酸桿菌菌株按照一定的梯度進行稀釋以后，采用實時熒光PCR 進行檢測，根據(jù)平板計數(shù)可得到檢測的濃度是83CFU/mL。將干酪乳桿菌按照同樣的倍數(shù)和方法稀釋以后，再利用實時熒光PCR 進行檢測，根據(jù)平板計數(shù)的結(jié)果可得到最終檢測的濃度是100CFU/ml。針對保加利亞乳酸桿菌的靈敏度檢測，按照1-7的倍數(shù)進行稀釋后，再利用實時熒光PCR 檢測，根據(jù)平板計數(shù)結(jié)果檢測得到的濃度是40CFU/ml。

2.2 特異性試驗結(jié)果

從非同源性參考菌株的實時熒光PCR 特異性檢測結(jié)果可知，乳酸桿菌得到了擴增，所有非乳酸桿菌沒有檢測到熒光信號，說明實時熒光PCR 在檢測乳酸桿菌的方面具有較好的特異性[3]。

3 試驗結(jié)果討論

從上文對食品中乳酸桿菌的實時熒光PCR 檢測分析可知，利用厭氧培養(yǎng)法和平板計數(shù)是常見的檢測方法，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)出試驗所需的菌株以后，可直接肉眼觀察初步分析結(jié)果。乳酸桿菌的細(xì)胞呈多樣化多形態(tài)，有細(xì)長狀、彎曲狀和短桿狀等，其一般處于靜止?fàn)顟B(tài)，無芽孢。采用厭氧平板法檢測時間較長，往往需要一周甚至更久才能觀測到結(jié)果，這樣就無法及時反映微生物是否具有污染特性且污染的嚴(yán)重性。對于乳酸桿菌而言，其在形成的過程中對營養(yǎng)的要求比較高，培養(yǎng)特性特殊，無法使用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法進行培養(yǎng)，而且后期分離這些培養(yǎng)菌株也需要一定的時間。因此，需要采用更加快速高效且靈敏度更高的針對乳酸桿菌的培養(yǎng)、檢測檢驗方法。PCR 檢測法在一開始在應(yīng)用時，存在假陽性污染與定量分析和準(zhǔn)確度不高的問題，這些年來開始采用實時PCR 熒光定量檢測技術(shù)，該技術(shù)方法的使用不但可以進行乳酸桿菌的定量檢測還能進行定性分析，特異性和靈敏度較高，且定量檢測更加準(zhǔn)確、速度更快，定性分析也更加精準(zhǔn)，將其用在分子生物學(xué)檢定實驗中具有突出的優(yōu)勢。

本文針對食品中的乳酸桿菌，針對16S rDNA 序列設(shè)計了擴增乳酸桿菌通用引物和非同源性菌株特異性檢測試驗。在采用實時熒光PCR 檢測時，采用乳酸桿菌通用引物出現(xiàn)了特異性擴增，而非乳酸桿菌沒有出現(xiàn)特異性擴增。這說明所采用的乳酸桿菌引物和探針都具有較高的特異性，并且只特異性擴增了乳酸桿菌。

4 結(jié)語

綜上所述，隨著對食品質(zhì)量和食品安全的高度重視，提高食品質(zhì)量檢測的速度、效率和效果已經(jīng)勢在必行。在對食品乳酸桿菌檢測方面，常規(guī)檢測方法不僅效率不高而且檢測結(jié)果的精確性較低，檢測時間較長無法很準(zhǔn)確反映微生物的污染情況。為此，本試驗設(shè)計了采用實時熒光PCR 檢測食品中乳酸桿菌的方法，提高了檢測的質(zhì)量可靠性和準(zhǔn)確性，且能在較短的時間內(nèi)反映污染物的特性，實用性和時效性較強，將其應(yīng)用在生物分析鑒定中具有十分廣闊的應(yīng)用發(fā)展前景，為乳酸桿菌的試驗檢測技術(shù)和理論的發(fā)展奠定良好基礎(chǔ)。