馬博偉綜述，倪國穎，王天放，陳波蓓審校

0 引 言

近年來，免疫治療逐漸成為腫瘤治療的新手段，免疫檢查點(diǎn)抑制對多種惡性腫瘤顯示出明確的療效和巨大的潛能[1-3]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑如抗PD-1、抗CTLA-4抗體等對包括宮頸癌、HPV相關(guān)頭頸部腫瘤在內(nèi)的臨床試驗(yàn)中也顯示出明確療效[4-6]。但是，免疫檢查點(diǎn)抑制劑對相當(dāng)一部分腫瘤無效，仍需進(jìn)一步提高療效[7]。治療性疫苗通過誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTLs)特異性殺死腫瘤或病毒感染細(xì)胞，理論上不傷害正常細(xì)胞，已成為包括宮頸癌免疫治療在內(nèi)的腫瘤免疫治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[8]。動物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)結(jié)果也表明，治療性疫苗與免疫檢查點(diǎn)抑制治療聯(lián)合使用，可進(jìn)一步提高免疫檢查點(diǎn)的效率[8-9]。本文對人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)相關(guān)腫瘤治療性疫苗的研究現(xiàn)狀作一綜述，重點(diǎn)就Caerin多肽提高HPV相關(guān)腫瘤治療性疫苗效率進(jìn)行的探索。

1 HPV相關(guān)惡性腫瘤

HPV慢性持續(xù)感染可引起多種良性和惡性疾病。宮頸、外陰、肛門癌和部分頭頸部腫瘤均可由感染HPV引起。2012年HPV持續(xù)感染引起的癌癥占當(dāng)年一千四百萬新診斷癌癥患者的4.6%[10]。2018年的統(tǒng)計表明，HPV相關(guān)癌癥占所有二百二十萬與感染有關(guān)癌癥的29.1%，而幾乎100%的宮頸癌均由HPV感染引起[11]。

宮頸癌是常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率占女性惡性腫瘤第四位，其中高危HPV 16型或18型在宮頸癌中最常見，約50%的宮頸癌發(fā)生與感染HPV16有關(guān)， 20%的宮頸癌發(fā)生與HPV18有關(guān)[12]。HPV預(yù)防疫苗主要由HPV晚期L1衣殼蛋白組成，L1蛋白可在體外自主組裝成病毒樣顆粒(virus like particles，VLPs)，VLPs可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗L1中和抗體，從而預(yù)防HPV病毒感染[13]。盡管用于預(yù)防HPV 感染的疫苗早已于2006年開始應(yīng)用，但此類疫苗僅適用于從未感染的健康個體，對現(xiàn)癥HPV感染及其所致疾病無效[14]。雖然宮頸癌預(yù)防性疫苗已經(jīng)在世界范圍內(nèi)使用，宮頸癌仍是婦女，尤其是發(fā)展中國家婦女最常見的惡性腫瘤之一[12]。2018年全球?qū)m頸癌新診斷人數(shù)為570 000人，死亡 311 000人[15]。我國現(xiàn)有宮頸癌患者40萬人，死亡率達(dá)11.3%[16]。

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)是全球第六大最常見的癌癥，每年新診斷患者60萬，死亡人數(shù)超過30萬人[17]。根據(jù)HPV相關(guān)性，HNSCC患者可分為兩類不同的亞群，HPV陰性的HNSCC可能與環(huán)境致癌物、煙酒消費(fèi)有關(guān)；而HPV陽性的HNSCC主要由HPV16亞型引起。HPV陽性的HNSCC好發(fā)于口咽部、扁桃體或舌根鱗狀上皮內(nèi)，通常見于不吸煙的年輕患者。許多HNSCC表現(xiàn)為局部進(jìn)展性疾病，常伴有明顯的淋巴結(jié)受累[18]。局部晚期疾病采用手術(shù)、放療和化療相結(jié)合的方法，只有約50%的患者能治愈。HPV陽性腫瘤相對于陰性腫瘤具有更好的臨床治療效果[19-20]。我國南方HPV相關(guān)HNSCC患者約占所有HNSCC的26.4%，口咽癌HPV的陽性率達(dá)到了38.5%[21]。

2 HPV相關(guān)疾病的治療性疫苗研究現(xiàn)狀和存在問題

目前，國內(nèi)外HPV治療性疫苗仍處在試驗(yàn)探索和研發(fā)階段。HPV治療性疫苗的靶抗原明確，主要集中在HPV早期抗原E6和E7。HPV相關(guān)惡性腫瘤中E6，E7持續(xù)表達(dá)，是主要的致癌蛋白。已有多篇文獻(xiàn)發(fā)表有關(guān)HPV治療性疫苗的綜述[8,22]。疫苗主要包括DNA(基因疫苗)、mRNA疫苗、各種細(xì)菌或病毒載體搭載的疫苗、蛋白質(zhì)、細(xì)胞和肽類疫苗等[23]。

迄今，國際上已有多篇文獻(xiàn)報道了HPV相關(guān)治療性疫苗的臨床試驗(yàn)結(jié)果，但僅個別，如含弗氏不完全佐劑的長HPV16 E7多肽疫苗和一種核酸疫苗顯示對HPV感染癌前病變?nèi)鏑IN3或VIN3有療效[24-26]，但對宮頸癌療效不明確。現(xiàn)階段，HPV治療性疫苗主要問題是接種HPV治療性疫苗雖然可誘導(dǎo)患者產(chǎn)生CTLs，這些T 細(xì)胞也可浸潤到腫瘤組織，但是對患者的生存時間無改善。如何優(yōu)化HPV相關(guān)疾病治療性疫苗、提高其療效，已成為HPV相關(guān)疾病治療性疫苗研究領(lǐng)域亟待解決的命題。理想的HPV治療性疫苗應(yīng)該：①誘導(dǎo)產(chǎn)生高質(zhì)、足夠數(shù)量的效應(yīng)T細(xì)胞細(xì)胞；②這些T細(xì)胞可遷徙到腫瘤組織；③克服腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用，有效殺死腫瘤細(xì)胞[14, 24-27]。

3 免疫時阻斷白介素10可提高治療性疫苗療效

3.1 IL-10IL-10是一種由多種特異性和非特異性免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，IL-10家族細(xì)胞因子由IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-24、IL-26、IL-28A、IL-28B和IL-29組成[28]。具有多種生物學(xué)功能，可抑制機(jī)體對外源和自身抗原過度的免疫反應(yīng)，避免對機(jī)體自身免疫損傷，維持上皮層的完整性，促進(jìn)對致病性感染的固有免疫反應(yīng)，促進(jìn)損傷中的組織愈合過程，抑制促反射反應(yīng)，限制不必要的組織破壞[28]?？乖岢始?xì)胞如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，輔助T 細(xì)胞，如Th1、Th2和Th17細(xì)胞以及CD8+T細(xì)胞，在特定條件下均可分泌IL-10。IL-10的主要功能是通過與細(xì)胞膜上的IL-10受體(IL-10R)結(jié)合，降低炎癥反應(yīng)。IL-10通過作用于抗原遞呈細(xì)胞，抑制CD8+T和Th1、Th17等細(xì)胞反應(yīng)[29-31]。

3.2阻斷IL-10提高疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)乳頭瘤病毒(papillomavirus，PV)的主要衣殼蛋白L1致敏(primed)的小鼠，在接種攜帶HPV16E7 CTLs決定簇的PV嵌和型L1蛋白(L1E7)后，與未致敏小鼠相比，E7特異性的CTLs細(xì)胞分泌干擾素伽馬(IFN-γ)受到抑制。但在 L1E7免疫PV L1致敏小鼠時，同步用IL-10受體抗體阻斷IL-10信號傳遞，E7特異性CTLs不受到抑制[32-34]。

基于多肽的治療性疫苗易生產(chǎn)，便于保存而受到研究者的重視。長HPV16 E7多肽(Long E7 peptide)/IFA疫苗是經(jīng)過隨機(jī)對照雙盲臨床試驗(yàn)證實(shí)對宮頸癌癌前病變有明確療效的[28]。對比研究發(fā)現(xiàn)HPV16 E7長肽/脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)/抗IL-10受體抗體疫苗比HPV16 E7 長肽/IFA誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的E7特異性CTLs，并且促使更多的分泌干擾素γ的CD4+和CD8+T細(xì)胞浸潤腫瘤組織[35-36]。兩種免疫方法均可抑制HPV16 E6/E7轉(zhuǎn)化的TC-1小鼠腫瘤的生長，且抑制水平一致。免疫時阻斷IL-10還可提高誘導(dǎo)次要抗原決定簇CTLs的能力。另外，已在臨床上使用的佐劑MPLA，一種優(yōu)化的LPS類似物，皮下使用抗IL-10R抗體，也可提高疫苗誘導(dǎo)CTLs的能力[35-36]。

3.3含IL-10阻斷劑的治療性疫苗更好的抑制腫瘤生長無論免疫原是病毒樣顆粒、多肽、可溶性抗原或核苷酸，免疫時使用IL-10受體單克隆抗體阻斷IL-10可顯著增加疫苗誘導(dǎo)抗原特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)[37]。HPV16 E7長肽/脂多糖 (LPS)/IL-10 阻斷(抗IL-10R 抗體)疫苗和HPV16 E7長肽/IFA 免疫后，這兩種免疫方法與未經(jīng)免疫的荷瘤小鼠相比，其腫瘤組織中IFN-γ的水平相似，比未免疫對照組腫瘤高；但是IL-10水平三者相似，提示腫瘤組織中的IFN-γ對抑制腫瘤起重要作用，而免疫時阻斷IL-10，不影響腫瘤組織中IL-10 總體水平[35-36]。免疫時阻斷IL-10，比單純免疫可更好抑制TC-1腫瘤的生長[38-39]。這些結(jié)果表明IL-10信號傳導(dǎo)阻斷對癌癥治療疫苗是有益的。疫苗誘導(dǎo)的IL-10而不是源自腫瘤的IL-10決定了治療性疫苗的效力[38]。然而，當(dāng)含有不誘導(dǎo)IL-10的佐劑的疫苗，如TLR3激動劑(Poly(I:C))或抗CD40抗體時，由于這些佐劑刺激的樹突狀細(xì)胞(DC)不產(chǎn)生IL-10，因此抗IL-10R抗體將不會對腫瘤生長提供任何有益的作用[39-40]。 IL-10在免疫應(yīng)答的T細(xì)胞激活和啟動階段是有害的，通過抑制抗原遞呈和減少M(fèi)HC Ⅰ、Ⅱ和樹突狀細(xì)胞膜上的共刺激物表達(dá)來抑制樹突狀細(xì)胞。因此，阻斷樹突狀細(xì)胞疫苗上的IL-10信號會產(chǎn)生更強(qiáng)的抗腫瘤反應(yīng)[38]。

4 腫瘤微環(huán)境對效應(yīng)T細(xì)胞的抑制作用

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是腫瘤與機(jī)體免疫系統(tǒng)不斷斗爭并取得勝利的結(jié)果。腫瘤微環(huán)境的組成包括腫瘤局部浸潤的免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等。間質(zhì)細(xì)胞又包括腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓前體細(xì)胞和循環(huán)血小板等細(xì)胞[41-43]。腫瘤微環(huán)境中存在大量的免疫抑制細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，免疫抑制性的抗原提呈細(xì)胞等，可直接或通過分泌免疫抑制細(xì)胞因子，如IL-10，TGF-β對效應(yīng)T細(xì)胞，特別是CTLs的功能進(jìn)行抑制[44]。 腫瘤微環(huán)境中M2表型巨噬細(xì)胞的增多，M2表型的巨噬細(xì)胞具有分泌促腫瘤生長炎性因子，特別是IL-10和CCL-2升高，從而引起腫瘤細(xì)胞遷徙和轉(zhuǎn)移。 因此，提高治療型疫苗的效率需要使免疫微環(huán)境從免疫抑制變成免疫促進(jìn)狀態(tài)[42,45]。

5 Caerin多肽體內(nèi)外抑制腫瘤生長

分離自兩棲動物澳大利亞樹蛙皮膚分泌物的天然多肽Caerin 1.1具有廣譜癌細(xì)胞細(xì)胞毒性作用,包括對白血病、肺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、卵巢癌、腎癌、前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性作用等，Caerin 1.9具有廣譜的抗革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌的能力[46-48]。

Caerin 1.1 和 1.9兩者結(jié)合使用體外抑制HPV16E6/E7轉(zhuǎn)化的TC-1腫瘤細(xì)胞，宮頸癌Hela細(xì)胞生長有疊加作用，而相同劑量的Caerin 多肽對正常細(xì)胞無毒性[49-50]。Caerin1.9可進(jìn)入到TC-1和HeLa細(xì)胞內(nèi)，Caerin 1.9進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的速度和位于細(xì)胞內(nèi)的位置不同[50]。Caerin 1.1和Caerin 1.9誘導(dǎo)TC-1和人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡，可能通過TNFα介導(dǎo)的凋亡信號誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡[50]。Caerin多肽二級結(jié)構(gòu)α螺旋-中部鉸鏈-α螺旋，能夠影響細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞膜功能的破壞，導(dǎo)致有過量離子和小分子穿過細(xì)胞質(zhì)膜雙層，最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解而造成細(xì)胞死亡[51]。Caerin多肽可通過Tec激酶信號傳導(dǎo)和LXR/RXR通路引起急性炎癥[49]。的確，Caerin1.1和Caerin1.9使TC-1細(xì)胞分泌更多的IL-6[49]。放射性碘可被連接到caerin多肽上。放射性碘標(biāo)記的Caerin 1.9在體外抑制腫瘤生長的效率比未標(biāo)記的Caerin 1.9高100倍，與游離的放射性碘比較，殺傷腫瘤細(xì)胞的效率更高[52-53],同樣，放射性碘標(biāo)記的Caerin 1.1在體內(nèi)抑制腫瘤生長的效率比未標(biāo)記的Caerin 1.1更高，抑制腫瘤生長的效率更強(qiáng)[54]。Caerin 1.1和Caerin 1.9局部腫瘤注射可抑制小鼠TC-1腫瘤，小鼠B16黑色素瘤生長[49]。

6 Caerin多肽提高治療性疫苗療效

HPV16E7長肽(EX)/MPLA/抗IL-10抗體皮下免疫加上腫瘤局部注射Caerin多肽可顯著增加TC-1荷瘤小鼠的存活時間[55]。與PBS處理的對照組相比，僅用EX/MPLA/抗IL-10R抗體進(jìn)行免疫接種，或僅腫瘤局部注射caerin多肽進(jìn)行免疫接種，不增加TC-1荷瘤小鼠的生存時間[55]。 此外，如果使用HPV16E7長肽(EX)/MPLA/抗IL-10抗體皮下免疫加上腫瘤局部注射Caerin多肽， 聯(lián)合PD-1免疫檢查點(diǎn)抗體，可使40%的小鼠完全清除TC-1腫瘤，高于HPV16E7長肽(EX)/MPLA/抗IL-10抗體皮下免疫加上腫瘤局部注射對照多肽(20%)。

7 Caerin多肽改善免疫微環(huán)境的機(jī)制

Caerin多肽除直接的細(xì)胞毒外，還募集更多的T細(xì)胞和NK細(xì)胞到腫瘤部位[56]。Caerin多肽抑制小鼠TC-1腫瘤生長需要特異性免疫系統(tǒng)的存在，因?yàn)镃aerin1.1和Caerin1.9抑制TC-1腫瘤生長的作用在裸鼠消失[55]。Caerin多肽抑制腫瘤生長的機(jī)理可能是除了直接的細(xì)胞毒外，還促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌炎性因子，吸引免疫細(xì)胞到腫瘤組織，有可能改善了腫瘤微環(huán)境的對效應(yīng)細(xì)胞的免疫抑制作用。

未經(jīng)治療的TC-1腫瘤、HPV16E7長肽(EX)/MPLA/抗IL-10抗體皮下免疫，聯(lián)合PD-1免疫檢查點(diǎn)抗體，結(jié)合TC-1腫瘤局部注射Caerin多肽或?qū)φ斩嚯牡腡C-1腫瘤內(nèi)浸潤白細(xì)胞的數(shù)量和功能單細(xì)胞RNA測序(ScRNA sequencing)TC-1腫瘤組織內(nèi)可鑒定出19個細(xì)胞群。包括巨噬細(xì)胞，CD4+，CD8+，CD4+CD8+，CD4-CD8- T細(xì)胞，B細(xì)胞，NK細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞等。未治療組的巨噬細(xì)胞，占所有腫瘤組織內(nèi)白細(xì)胞的50%，Caerin治療組占47%，對照組42%。這些巨噬細(xì)胞可根據(jù)其基因表達(dá)的不同，分為六個群，從免疫抑制型M2，到免疫促進(jìn)型巨噬細(xì)胞，分別為M2 MΦ,MHCIIhiMΦ, MΦ/DCs,Ear2hiMΦ, MΦ/NKT and TAMs巨噬細(xì)胞。未治療組含大量Arg+的M2巨噬細(xì)胞，與未治療和對照多肽治療組相比，Caerin多肽治療組Arg+的巨噬細(xì)胞量顯著減少，MHCIIhiandEar2hi巨噬細(xì)胞明顯增多。此外，Caerin多肽局部腫瘤注射和對照多肽治療性疫苗免疫和PD-1抗體治療顯著促進(jìn)了CD8+T細(xì)胞腫瘤組織浸潤；而Caerin多肽治療組的CD8+T細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫激活狀態(tài)，與對照多肽治療組比較，Cd8a,Cd8b1,Tox,Ifng,Prf1和Rgs16的表達(dá)顯著增高，CD8+T細(xì)胞中記憶T細(xì)胞和效應(yīng)記憶T細(xì)胞明顯增多。Caerin治療的TC-1腫瘤組織中免疫刺激狀態(tài)的NK細(xì)胞也比對照多肽治療組明顯增多。B細(xì)胞在TC-1腫瘤模型中具有免疫抑制作用，與未治療組和對照多肽治療組相比，Caerin多肽治療組的B細(xì)胞幾乎消失，而B細(xì)胞在TC-1腫瘤模型中具有促進(jìn)腫瘤生長的能力[57]。蛋白組學(xué)分析結(jié)果表明，stat1信號傳導(dǎo)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和一氧化氮的產(chǎn)生。此外，蛋白質(zhì)組與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的計算整合與Caerin多肽治療后免疫抑制性B細(xì)胞功能的失活一致。

8 結(jié)語與展望

HPV引起的相關(guān)疾病嚴(yán)重危害人類健康，急需研發(fā)新的有效治療手段。免疫治療HPV相關(guān)疾病是研究的熱點(diǎn)和發(fā)展方向。免疫時使用抗IL-10受體抗體或IL-10抑制肽暫時阻斷IL-10，可提高治療性疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)，增加T細(xì)胞數(shù)量，延長生存時間。腫瘤微環(huán)境對治療性疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫細(xì)胞有抑制作用，使CTLs細(xì)胞不能充分發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。來自兩棲動物分泌物的合成Caerin多肽在體內(nèi)外具有廣譜的抗腫瘤效果。Caerin多肽性質(zhì)極其穩(wěn)定，能夠通過Tec激酶信號傳導(dǎo)和LXR/RXR通路引起急性炎癥和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，改善免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，重新激活免疫細(xì)胞靶向攻擊腫瘤，殺傷腫瘤細(xì)胞。對Caerin多肽改善腫瘤微環(huán)境的機(jī)理深入研究，研發(fā)控制釋放長效Caerin多肽有助于進(jìn)一步提高其提高治療性疫苗的效率。