徐潔，王麗媛，于洋，唐小鐵

(1.武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，武漢 430080；2.武漢科技大學(xué)附屬普仁醫(yī)院腎內(nèi)科，武漢 430080)

臨床上，急性腎損傷具有發(fā)病率高、病死率高的特點(diǎn)，給患者和社會(huì)帶來極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是全球性的嚴(yán)重的醫(yī)療保健問題[1]。流行病學(xué)研究表明，急性腎損傷是終末期腎臟病的主要危險(xiǎn)因素，常發(fā)展為慢性腎臟病[2]。腎臟缺血再灌注損傷是指缺血的腎臟在完全或部分恢復(fù)血流灌注后出現(xiàn)損傷加重及腎功能惡化(即腎組織細(xì)胞缺血缺氧、腎小管細(xì)胞損傷)而引起的腎臟損傷[3]。腎臟缺血再灌注損傷常見于心血管手術(shù)、創(chuàng)傷、休克和腎移植的患者，是臨床上急性腎損傷最常見的病因[4]，其發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，是引起腎衰竭和影響預(yù)后的重要原因，但目前尚缺乏有效的治療策略[5]。導(dǎo)致腎臟缺血再灌注損傷的機(jī)制主要包括能量代謝障礙、鈣超載、線粒體損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及自噬等[6]。自噬廣泛存在于真核生物內(nèi)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng)中具有重要作用[7]。許多疾病的發(fā)生、發(fā)展均涉及自噬，如感染、腫瘤、代謝性疾病[8]。目前自噬是各領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其中，腎小管上皮細(xì)胞的自噬是目前關(guān)注的焦點(diǎn)。在急性腎損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中，自噬相關(guān)信號(hào)通路上的關(guān)鍵部位可能為急性腎損傷的治療提供新的策略[9]，但自噬在腎臟缺血再灌注損傷中的作用尚存在爭(zhēng)議，現(xiàn)就自噬在腎臟缺血再灌注損傷中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 自噬的基本概念和發(fā)生過程

1.1自噬的基本概念 1962年，Ashford和Porter[10]在研究人肝細(xì)胞時(shí)，在電子顯微鏡下觀察到了自噬；隨后Tsukada和Ohsumi[11]在研究酵母時(shí)發(fā)現(xiàn)了自噬相關(guān)的分子機(jī)制；1969年在藥物誘導(dǎo)的腎損傷小鼠近曲小管中首次發(fā)現(xiàn)了包含受損細(xì)胞器的自噬體[12]。隨著研究的深入，自噬在急性腎損傷中的研究取得重大進(jìn)展。自噬通過參與受損細(xì)胞器以及蛋白質(zhì)的清除和再循環(huán)實(shí)現(xiàn)胞質(zhì)成分更新，以保持細(xì)胞內(nèi)平衡，并參與細(xì)胞生長(zhǎng)、生存的調(diào)節(jié)，是機(jī)體進(jìn)化過程中保守的代謝機(jī)制，對(duì)組織細(xì)胞具有保護(hù)作用。自噬時(shí)溶酶體水解酶降解細(xì)胞內(nèi)受損的大分子、蛋白質(zhì)聚集物和功能失調(diào)的細(xì)胞器，降解后的成分被回收，用于合成細(xì)胞生命活動(dòng)所需的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器和能量等[13-14]。在生理?xiàng)l件下，自噬的順利進(jìn)行有助于維持細(xì)胞內(nèi)外穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)[15]，在人體各項(xiàng)生命活動(dòng)的順利進(jìn)行中均發(fā)揮重要作用。膿毒血癥、腎急性缺血以及藥物和重金屬誘導(dǎo)的腎毒性是引起急性腎損傷的常見原因，為了應(yīng)對(duì)這些壓力，自噬途徑被激活[16]。通常情況下發(fā)生的自噬對(duì)組織細(xì)胞具有保護(hù)作用，但過強(qiáng)的刺激導(dǎo)致自噬過度也可能加重組織細(xì)胞損傷，甚至引起細(xì)胞死亡，稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡[17]。

根據(jù)細(xì)胞內(nèi)容物運(yùn)輸至溶酶體的方式，哺乳動(dòng)物內(nèi)的自噬包括巨自噬、微自噬和伴侶介導(dǎo)的自噬。巨自噬就是通常所說的“自噬”，是主要且廣泛研究的降解或消除受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的自噬途徑，底物蛋白被雙層膜的結(jié)構(gòu)包裹后形成自噬體，并運(yùn)輸至溶酶體內(nèi)進(jìn)行消化水解[18]。微自噬及伴侶介導(dǎo)的自噬研究較少。

1.2自噬的發(fā)生過程 自噬的發(fā)生過程非常復(fù)雜，主要分為3個(gè)階段，即自噬體形成、自噬體與溶酶體融合以及自噬溶酶體降解。自噬體的形成涉及多個(gè)自噬相關(guān)蛋白(autophagy related protein，Atg)復(fù)合體的協(xié)同作用，主要包括UNC-51樣激酶(uncoordinated 51-like kinase，ULK)1/2復(fù)合體、Beclin-1/Ⅲ類磷脂酰肌醇-3激酶復(fù)合體、Atg12-Atg5-Atg16 L1復(fù)合體以及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅱ，LC3Ⅱ)的修飾等。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)及AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)共同參與ULK1/ULK2復(fù)合體的調(diào)節(jié)，以激活自噬[19]；隨后，Beclin-1/Ⅲ類磷脂酰肌醇-3激酶復(fù)合物啟動(dòng)細(xì)胞膜泡成核，同時(shí)結(jié)合Atg21和Atg24到膜上，形成自噬體的前體裝配結(jié)構(gòu)[20]。隔膜的延伸、閉合、形成自噬體涉及2條泛素化途徑：Atg12-Atg10中間體形成后促進(jìn)Atg12和Atg5轉(zhuǎn)移，形成共價(jià)連接的Atg12-Atg5與Atg16L1結(jié)合形成Atg12-Atg5-Atg16L1復(fù)合體[21]；隨后，Atg12-Atg5-Atg16L1復(fù)合體被招募至吞噬泡膜上，通過與磷脂酰乙醇胺共價(jià)結(jié)合生成脂化LC3[22]；LC3被Atg4分解為L(zhǎng)C3Ⅰ后被E1樣酶Atg7激活，轉(zhuǎn)運(yùn)至Atg3，與磷脂酰乙醇結(jié)合成為L(zhǎng)C3-磷脂酰乙醇(即LC3Ⅱ)，LC3Ⅱ是自噬體外膜和內(nèi)膜的重要組成部分，而Atg12-Atg5-Atg16L1復(fù)合體只存在于自噬體的外膜[23]。

成熟的自噬體和溶酶體結(jié)合形成的自噬溶酶體可將其內(nèi)底物進(jìn)行降解，自噬生物學(xué)功能的順利進(jìn)行依賴上述過程的順利完成。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)可觀察到少量自噬體，自噬活性提高，觀察到的自噬體增多；另外，自噬體與溶酶體結(jié)合障礙或者自噬溶酶體降解障礙引起自噬體無法清除，檢測(cè)到的自噬水平也可增高[24]。

2 自噬在腎缺血再灌注損傷中的雙重作用

自噬在腎缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均觀察到在腎缺血再灌注損傷過程中自噬被激活[25-26]，但表達(dá)上調(diào)的自噬究竟對(duì)腎臟起保護(hù)作用還是加劇腎臟損傷目前仍存在爭(zhēng)議。一方面，自噬可降解異常細(xì)胞內(nèi)異常的蛋白及細(xì)胞器，防止有害物質(zhì)的積累，對(duì)細(xì)胞的生存起到保護(hù)作用；另一方面，過高水平的自噬可損傷細(xì)胞器，使其轉(zhuǎn)化為自噬細(xì)胞死亡。因此，自噬在腎缺血再灌注損傷中是把雙刃劍。

2.1自噬對(duì)腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用 目前已有超過40種自噬相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)，為驗(yàn)證自噬在腎缺血再灌注損傷中的作用，特異性剔除自噬相關(guān)基因Atg5后，電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)存在大量損傷的線粒體、自噬底物p62等，腎臟對(duì)缺血性損傷更敏感，腎功能損傷更嚴(yán)重[27]。另外，在自噬相關(guān)基因Atg7剔除的小鼠體內(nèi)也出現(xiàn)了相似的結(jié)果[28]，這些實(shí)驗(yàn)均證實(shí)自噬缺乏可加重腎缺血再灌注損傷后的腎功能惡化。Bian等[29]的研究也表明，腎缺血后自噬不足可加重缺血再灌注損傷。在腎移植誘導(dǎo)的大鼠腎缺血再灌注損傷模型中，高壓氧治療可通過激活自噬減輕炎癥損傷，從而發(fā)揮保護(hù)作用[30]。而在缺血預(yù)處理模型中，通過血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶1/叉頭框蛋白O亞族3a/缺氧誘導(dǎo)因子-1α通路可激活自噬流，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[31]。這些研究均提示腎缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的自噬可能在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中起到腎保護(hù)作用。但自噬保護(hù)腎缺血再灌注損傷的關(guān)鍵調(diào)控通路目前尚不清楚。腎缺血再灌注損傷是引起急性腎損傷的主要原因，自噬的激活可為腎組織細(xì)胞的存活提供保護(hù)機(jī)制，并為急性腎損傷的臨床治療提供潛在策略，但關(guān)鍵通路還有待進(jìn)一步研究。

2.2自噬對(duì)腎缺血再灌注損傷的損傷作用 自噬的發(fā)生可能加重腎臟損傷，自噬通量異常或自噬長(zhǎng)時(shí)間激活可能會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，引起細(xì)胞死亡[32-33]。Suzuki等[34]的研究提示，自噬在腎缺血再灌注損傷中可以加重腎組織損傷，而抑制自噬可顯著減少過氧化氫刺激的腎小管上皮細(xì)胞乳酸脫氫酶的產(chǎn)生，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。大鼠腎缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的自噬被抑制后，腎組織細(xì)胞色素C和氧自由基的釋放顯著減少，腎功能顯著改善[35]。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10可通過mTOR途徑抑制過度自噬，并抑制由泛素結(jié)合蛋白核自噬受體SQSTM1(sequestosome 1)/p62介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減輕腎缺血再灌注損傷[36]。由此推測(cè)，自噬可能在缺血再灌注過程中對(duì)腎小管造成損傷。腎缺血再灌注損傷是動(dòng)態(tài)變化的過程，自噬也隨之變化，造成上述研究差異的原因部分可能與實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭胁捎玫膭?dòng)物、細(xì)胞種類不同以及不同研究中缺血再灌注持續(xù)時(shí)間、觀察時(shí)間點(diǎn)各不相同有關(guān)[37]。因此，未來對(duì)腎缺血再灌注損傷中自噬作用及機(jī)制的研究應(yīng)基于對(duì)這個(gè)變化過程的全面了解，這樣有助于更好地理解自噬在腎缺血再灌注損傷中的作用。

3 自噬在腎缺血再灌注損傷中可能的調(diào)控機(jī)制

3.1AMPK-mTOR通路 AMPK和mTOR是兩種營養(yǎng)能量敏感激酶，AMPK受AMP/ATP比值、缺氧、氧化應(yīng)激等因素調(diào)控[38]。在腎缺血再灌注損傷中，AMPK-mTOR表達(dá)活躍，mTOR可以抑制自噬的發(fā)生，是自噬的負(fù)性調(diào)控因子，在自噬過程中發(fā)揮核心作用，而AMPK可以通過抑制mTOR來增強(qiáng)自噬[39]。在腎缺血再灌注損傷中，AMPK可間接通過抑制mTOR復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)的活性增強(qiáng)自噬或者直接通過磷酸化及活化ULK1/2調(diào)節(jié)自噬[40]。在體外缺血再灌注腎小管細(xì)胞損傷模型中，AMPK誘導(dǎo)的自噬對(duì)腎臟具有保護(hù)作用[41]。同樣，在腎小管細(xì)胞構(gòu)建的缺氧/復(fù)氧模型中，用吡格列酮預(yù)處理可通過AMPK-mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)自噬作用，從而保護(hù)機(jī)體免受缺血再灌注損傷[42]。肝再生增強(qiáng)因子也可通過AMPK/mTOR途徑負(fù)向調(diào)節(jié)腎缺血再灌注損傷中的自噬，自噬抑制細(xì)胞凋亡，并在氧化應(yīng)激條件下發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[43]。因此，AMPK調(diào)節(jié)的mTOR途徑是腎缺血再灌注損傷過程中誘導(dǎo)自噬的一個(gè)重要信號(hào)通路。

3.2磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)-mTOR通路 PI3K-Akt-mTOR通路可調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、蛋白質(zhì)合成以及葡萄糖代謝等[44]。mTOR蛋白在PI3K-Akt信號(hào)通路的下游，調(diào)控PI3K-Akt可通過mTOR影響自噬的發(fā)生、發(fā)展。在腎臟近端腎小管HK-2細(xì)胞中，蛋白酶激活受體2的過表達(dá)可通過激活PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路抑制自噬，并誘導(dǎo)自噬相關(guān)炎癥反應(yīng)；同時(shí)，通過蛋白酶激活受體2的RNA干擾轉(zhuǎn)染剔除蛋白酶激活受體2可抑制PI3K-Akt-mTOR通路，極大地增加自噬并減輕自噬相關(guān)炎癥反應(yīng)[45]。研究證實(shí)，雷帕霉素及其衍生物可通過抑制PI3K-Akt-mTOR通路激活自噬[46]。但研究中所涉及的自噬激動(dòng)劑和抑制劑大多為非特異性，具體對(duì)哪一種自噬起作用目前尚不清楚，且這些藥物在增強(qiáng)或減弱自噬過程中可能對(duì)其他生理過程造成影響。最近的研究認(rèn)為，mTOR抑制劑雷帕霉素不能預(yù)防腎缺血再灌注損傷或順鉑誘導(dǎo)的腎毒性引起的急性腎損傷，因此不可作為自噬相關(guān)腎保護(hù)機(jī)制的理想模擬物[47]。未來需尋找更具特異性的自噬激動(dòng)劑和抑制劑進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

3.3氧化應(yīng)激相關(guān)作用機(jī)制 正常情況下，生物體維持低水平的氧化應(yīng)激，而病理狀態(tài)下氧化還原穩(wěn)態(tài)的失調(diào)及中性粒細(xì)胞的募集致活性氧類(reactive oxygen species，ROS)和活性氮過度生成，進(jìn)一步導(dǎo)致氧化應(yīng)激及相關(guān)細(xì)胞成分的氧化損傷，而代謝率高的腎近端小管細(xì)胞遭受了最嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡(即引起繼發(fā)性損傷)，在腎缺血再灌注損傷中抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)可減輕腎臟損傷[48]。在腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制中，氧化應(yīng)激與自噬流的激活相關(guān)，mTOR是自噬通路的關(guān)鍵信號(hào)分子，其活性受PI3K、Akt、AMPK等多條通路調(diào)節(jié)，當(dāng)ROS過度產(chǎn)生時(shí)，自噬可通過PI3K-Akt-mTOR通路啟動(dòng)[49]；同時(shí)，ROS所誘導(dǎo)的自噬也受到AMPK/mTOR通路的調(diào)控[50]。研究證實(shí)，ROS還可通過影響AMPK-mTORC1-ULK1通路以及Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1/核因子E2相關(guān)因子2系統(tǒng)調(diào)節(jié)自噬[51]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1參與細(xì)胞存活、新陳代謝、基因沉默等多種過程，在體內(nèi)腎缺血再灌注損傷模型中發(fā)現(xiàn)，沉默信息調(diào)節(jié)因子1可通過上調(diào)自噬抑制氧化應(yīng)激，從而降低細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[52]。另外，針對(duì)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氮與自噬相關(guān)的研究較少，有研究表明，活性氮調(diào)節(jié)的自噬可能加重缺血再灌注損傷[53]?？赡苁怯捎跈C(jī)體在遭受缺血再灌注損傷時(shí)產(chǎn)生過量的ROS，引起脂質(zhì)的氧化反應(yīng)，使細(xì)胞內(nèi)線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等受到損傷，而引發(fā)自噬增強(qiáng)，自噬通過降解受損細(xì)胞器及胞內(nèi)異常的蛋白質(zhì)等代謝產(chǎn)物維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，調(diào)控氧化應(yīng)激、減輕腎臟損傷，發(fā)揮保護(hù)作用。

3.4p53途徑 腫瘤抑制基因p53在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和自噬中發(fā)揮重要作用，生理狀態(tài)下，p53作為四聚體發(fā)揮作用，并且低表達(dá)于細(xì)胞中，當(dāng)各種原因使機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，p53轉(zhuǎn)錄活性升高，表達(dá)顯著升高，p53根據(jù)其亞細(xì)胞定位，對(duì)自噬的調(diào)控具有雙重作用，核p53可激活自噬，而胞質(zhì)p53可能具有抗自噬功能[54]。研究證實(shí)，p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis-stimulating protein two of p53，ASPP2)的下調(diào)可以通過激活自噬，改善腎缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的急性腎損傷[55]。p53的轉(zhuǎn)錄活性還通過下調(diào)人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因誘導(dǎo)激酶1(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten gene-induced kinase 1，PINK1)的轉(zhuǎn)錄而抑制自噬，而PINK1編碼參與線粒體吞噬的關(guān)鍵蛋白[56]。另外，胞質(zhì)p53對(duì)細(xì)胞自噬的抑制作用還可能受到微RNA(microRNA，miRNA/miR)的調(diào)控，如miR-125b、miR-214等[57]。由于p53涉及體內(nèi)多條代謝途徑，p53對(duì)自噬的作用目前仍存在爭(zhēng)議，還有待進(jìn)一步研究。

3.5miRNA相關(guān)途徑 miRNA是由19～22個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，由于其在血液、尿液及其他體液中的穩(wěn)定性，成為各種疾病的新型生物標(biāo)志物，也是腎缺血再灌注損傷的研究熱點(diǎn)之一。在腎缺血再灌注損傷大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，腎缺血再灌注損傷后血漿中的miR-192水平增加4倍，腎臟中的miR-192水平降低約40%，腎臟中miR-192表達(dá)在再灌注后7 d保持在低水平[58]。而小鼠模型中，尿miR-10a和miR-30d濃度與急性腎損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[59]。這些研究表明，miRNA與腎缺血再灌注損傷密切相關(guān)。另外，在體內(nèi)及體外腎缺血再灌注損傷研究中均發(fā)現(xiàn)miRNA參與了自噬的調(diào)控[9]。Liu等[60]在通過缺血再灌注建立的急性腎損傷小鼠體內(nèi)模型中發(fā)現(xiàn)，小鼠腎缺血再灌注損傷后，miR-34a表達(dá)上調(diào)，且miR-34a可以直接與Atg4B的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，通過Atg4B靶向調(diào)節(jié)自噬活性，從而加重腎缺血再灌注損傷。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)，在腎缺血再灌注損傷期間，miR-21水平升高，且miR-21抑制劑預(yù)處理可增強(qiáng)LC3Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)，減輕腎損傷，而miR-21是通過Rab11a靶向抑制腎缺血再灌注損傷中的自噬的[61]。而體外缺氧條件下，在腎臟近端腎小管HK-2細(xì)胞中檢測(cè)到LC3Ⅱ和Atg16L1表達(dá)增加、miR-20a-5p表達(dá)降低，并發(fā)現(xiàn)miR-20a-5p通過Atg16L1靶向介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的自噬[62]。由此可見，miRNA可以作為信號(hào)分子參與腎缺血再灌注損傷的病理生理過程，未來miRNA可能成為急性腎損傷潛在的治療靶點(diǎn)。

4 小 結(jié)

自噬與腎臟缺血再灌注損傷密切相關(guān)，闡明腎臟缺血再灌注損傷與自噬相互作用的分子機(jī)制以及在自噬途徑中的特定靶點(diǎn)，有助于為預(yù)防及治療腎臟缺血再灌注損傷的藥物研發(fā)尋找新的靶點(diǎn)。但目前仍有許多問題亟待解決，如自噬在腎臟缺血再灌注損傷中的研究多局限于細(xì)胞及動(dòng)物模型，目前的研究結(jié)果在人的腎臟中是否可以得到相似的結(jié)論尚缺乏臨床實(shí)踐。研究者傾向于自噬在急性腎損傷中具有保護(hù)作用，但不能簡(jiǎn)單地理解為提高自噬就有利于急性腎損傷，其作用機(jī)制涉及多條信號(hào)通路及作用途徑。另外，自噬在腎臟缺血再灌注損傷中的研究成果如何向臨床轉(zhuǎn)化還需要研究者們繼續(xù)探索。