胡朝暾， 周愛芳， 戴柏倩， 于夢(mèng)婷

（懷化學(xué)院1.生物與食品工程學(xué)院；2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南懷化418008）

蜘蛛毒腺是一種高度特化且對(duì)蜘蛛生存至關(guān)重要的器官，能夠產(chǎn)生、分泌和儲(chǔ)存毒液.研究表明絕大多數(shù)的蜘蛛毒素是一類具有3—5對(duì)二硫鍵，主要作用于細(xì)胞膜上離子通道且具有特定藥理活性的多肽類毒素[1，2].由于蜘蛛毒素特定的作用部位和活性功能，其具有開發(fā)為治療某些疾病的新型藥物、殺蟲劑和神經(jīng)生物學(xué)工具試劑的潛能[3，4].因此，蜘蛛毒素引起了科學(xué)界、農(nóng)業(yè)和制藥行業(yè)的廣泛關(guān)注[5，6].

家福捕鳥蛛是一種近年來發(fā)現(xiàn)的蜘蛛新種，其棲息地主要分布在我國的廣西、云南等地.前期我們對(duì)家福捕鳥蛛毒素進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究.研究發(fā)現(xiàn)家福捕鳥蛛毒液成分復(fù)雜，已鑒定到幾百個(gè)毒素分子.而且研究發(fā)現(xiàn)家福捕鳥蛛粗毒對(duì)DRG細(xì)胞TTX-R鈉通道具有抑制作用，表明粗毒中存在對(duì)TTX-R通道具有抑制活性的毒素分子[7].通過RP-HPLC和膜片鉗活性測(cè)定，從其粗毒中分離鑒定到1個(gè)對(duì)TTX-R鈉電流具有明顯抑制作的毒素分子（JFTX-22），并進(jìn)行了JFTX-22的基本理化性質(zhì)分析、空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和同源序列比對(duì).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：家福捕鳥蛛采自廣西寧明縣桐棉鎮(zhèn)和愛店鎮(zhèn)的山區(qū)，SD大鼠購自湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物養(yǎng)殖中心.

1.1.2 試劑：Sigma公司的葡萄糖、D-glucose、NaOH、KCl、冰乙酸、氯化銫、MgCl2、EGTA、三氟乙酸、胰蛋白酶抑制劑、α-氰基-4-羥基-肉桂酸（CCA）、膠原酶、胰蛋白酶、河豚毒素（TTX）、HEPES、氫氧化銫，湖南化工研究院的色譜純乙腈購，其他試劑是國產(chǎn)分析純?cè)噭?

1.1.3 儀器：Waters Alliance 2695高效液相色譜儀為美國Waters公司產(chǎn)品，MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀為德國Bruker公司產(chǎn)品，EPC-10膜片鉗儀為德國HEKA公司產(chǎn)品，491型蛋白質(zhì)測(cè)序儀為美國Applied Biosystem公司產(chǎn)品，真空冷凍干燥機(jī)為寧波新芝公司產(chǎn)品，高速冷凍離心機(jī)為德國Eppendorf公司產(chǎn)品.

1.2 方法

1.2.1 JFTX-22的色譜分離和質(zhì)譜分析

將粗毒配制至濃度為10 mg/mL，4℃，8 000 rpm離心20 min后用0.22 μm過濾.配制好的毒液在Waters Alliance 2695高效液相色譜儀上進(jìn)行分離純化，上樣體積為100 μL.色譜柱為反相C18柱（phenomenex 100 A°，4.6 mm×250 mm，5 μm）.洗脫液A：水溶液（含0.1%TFA），B液：乙腈溶液（含0.1%TFA）.洗脫梯度：0 min—50 min，0%—50%洗脫B液，流速為1.0 mL/min，柱溫35℃，在215 nm下收集洗脫峰.將CCA基質(zhì)用50%乙腈溶液溶解至10 mg/ml，將1.0 μL CCA基質(zhì)液和0.5 μL樣品溶液混合，取0.5 μL混合液點(diǎn)樣，室溫下干燥后進(jìn)行質(zhì)譜分析.

1.2.2 大鼠DRG細(xì)胞的急性分離培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行大鼠DRG細(xì)胞急性分離培養(yǎng).

1.2.3 JFTX-22電壓門控鈉電流的全細(xì)胞膜片鉗記錄

參考文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行JFTX-22電壓門控鈉電流的全細(xì)胞膜片鉗記錄.

1.2.4 JFTX-22的氨基酸序列測(cè)定

氨基酸序列測(cè)定是利用Edman降解原理，在美國Applied Biosystem公司的491型蛋白質(zhì)測(cè)序儀上進(jìn)行.先將JFTX-22進(jìn)行碘乙酰胺烷基化修飾，將修飾后的JFTX-22作為測(cè)序樣品進(jìn)行測(cè)序.

1.2.5 JFTX-22的生物信息學(xué)分析

采用電腦在線ORF程序（http：//www.ncb.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）獲取開放閱讀框序列，用電腦在線Expasy服務(wù)器上的ProtParam程序分析蛋白的基本理化性質(zhì)（http：//au.expasy.org/tools/protparam.html）.利用電腦軟件SignalP 5.0預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽（http：//www.cbs.dtu.dk/services/signalp），SOPMA軟件預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html）.

2 結(jié)果與分析

2.1 JFTX-22的色譜分離和膜片鉗活性鑒定

將配制好的家福捕鳥蛛毒液按照上述方法進(jìn)行RP-HPLC分離.其毒液RP-HPLC色譜圖如圖1.從圖中可知，家福捕鳥蛛毒液的成分復(fù)雜，可以檢測(cè)到40多個(gè)色譜峰.經(jīng)全細(xì)胞膜片鉗活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)出峰時(shí)間為16.32 min的色譜峰對(duì)大鼠DRG細(xì)胞TTX-R鈉通道電流具有明顯的抑制作用.將該成分命名為JFTX-22.JFTX-22全細(xì)胞膜片鉗活性分析時(shí)，先往細(xì)胞外液中加入200 nM TTX，阻斷DRG細(xì)胞上的TTX-S電流.選取小的DRG細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn).膜片鉗活性測(cè)定時(shí)將膜電位控制在-80 mV，給予脈沖寬幅50 ms，以10 mV步幅去極化電壓刺激引出DRG細(xì)胞TTX-R電流，再將毒素分子JFTX-22溶液加入細(xì)胞外液中，開展JFTX-22對(duì)TTX-R鈉通道全細(xì)胞膜片鉗活性分析.結(jié)果表明JFTX-22對(duì)DRG細(xì)胞上TTX-R通道具有抑制作用.100 nM JFTX-22大約能夠抑制5.58%±0.72%（n=3）DRG細(xì)胞TTX-R電流，當(dāng)JFTX-22濃度增大到1 μM時(shí)抑制電流達(dá)到47.21%±3.2%（n=3）（圖2A）.

圖1 JFTX-22反相高效液相色譜圖

2.2 JFTX-22質(zhì)譜鑒定和序列測(cè)定

JFTX-22經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定為單一成分的毒素分子，分子量為2807.227 Da（圖2B）.通過Edman降解全序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)JFTX-22是一個(gè)由28個(gè)氨基酸殘基組成，包含有6個(gè)半胱氨酸的多肽，其全序列為RCLPSGKACAGVTQKIPCCGSCVRGKCS.半胱氨酸的結(jié)構(gòu)模式為X1CX6CX8CC X2CX4CX1.通過在線分析軟件發(fā)現(xiàn)JFTX-22的理論相對(duì)分子質(zhì)量為2813.40 Da，與質(zhì)譜鑒定的分子量相差6 Da，表明JFTX-22的分子內(nèi)6個(gè)半胱氨酸形成了3對(duì)二硫鍵.

圖2 JFTX-22對(duì)大鼠DRG細(xì)胞TTX-R鈉電流的影響（A）及其質(zhì)譜鑒定圖譜（B）

2.3 JFTX-22的生物信息學(xué)分析

2.3.1 JFTX-22 cDNA序列分析

根據(jù)JFTX-22 Edman測(cè)定序列和EST編碼的蛋白質(zhì)序列比對(duì)，找到編碼JFTX-22的cDNA序列.結(jié)果表明JFTX-22的全長(zhǎng)cDNA序列包含471堿基，其中ORF長(zhǎng)198 bp，ORF編碼65個(gè)氨基酸殘基.5′-端非翻譯區(qū)長(zhǎng)85bp，3′-端非翻譯區(qū)長(zhǎng)188 bp，具有polyA尾結(jié)構(gòu).信號(hào)肽檢測(cè)結(jié)果表明JFTX-22序列在前體肽N端含有20個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列，切割位點(diǎn)位于第20位“A”和第21位“E”之間（圖3）.起始密碼子為“ATG”，終止密碼子為“TGA”.前體肽具有典型的“QER”蛋白酶水解位點(diǎn)（35-37）.毒素前體肽合成后在N端信號(hào)肽引導(dǎo)下進(jìn)入毒囊后被蛋白酶在“QER”位點(diǎn)水解為成熟肽儲(chǔ)存于毒囊中.最終合成的成熟肽由28個(gè)氨基酸組成，成熟肽序列與Edman降解法測(cè)定的序列完全吻合（圖4）.

圖3 JFTX-22前體肽中信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖4 JFTX-22 cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

2.3.2 JFTX-22基本理化性質(zhì)分析

根據(jù)在線ProtParam程序預(yù)測(cè)JFTX-22分子式為C112H198N38O34S6，相對(duì)分子質(zhì)量為2 813.40 Da，理論等電點(diǎn)為9.18，不穩(wěn)定指數(shù)為33.35.根據(jù)文獻(xiàn)[10]蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)值在40以下為穩(wěn)定蛋白的標(biāo)準(zhǔn)，JFTX-22分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定.JFTX-22分子氨基酸殘基組成中Cys半胱氨酸含量最高，為21.4%.帶正電荷的殘基（Arg+Lys）數(shù)為5個(gè)，帶負(fù)電荷的殘基（Asp+Glu）數(shù)0個(gè)，JFTX-22多肽鏈分子帶正電荷，這與預(yù)測(cè)的理論等電點(diǎn)9.18吻合.

2.3.3 JFTX-22空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

采用在線SOPMA程序預(yù)測(cè)JFTX-22的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5.從圖中可知，JFTX-22的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)卷曲（randon coil）（Cc）為主，約占整個(gè)結(jié)構(gòu)的50%；其次是β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（Tt）和延伸鏈結(jié)構(gòu)（Ee），分別為28.57%和17.86%；α-螺旋（Hh）僅占3.57%.

圖5 JFTX-22二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

經(jīng)同源序列搜索發(fā)現(xiàn)，JFTX-22與數(shù)據(jù)庫中一種來自新加坡狼蛛的多肽毒素（Covalitoxin-I）的序列完全一致.Covalitoxin-I的空間結(jié)構(gòu)已被解析（RCSB數(shù)據(jù)庫編號(hào)為1V5A_A），但相關(guān)文章并未見發(fā)表，且功能未知.考慮到JFTX-22與Covalitoxin-I的氨基酸序列完全一致，因此，可以根據(jù)Covalitoxin-I的空間結(jié)構(gòu)來判斷JFTX-22的空間結(jié)構(gòu)特征.經(jīng)Swiss-PdbViewer軟件顯示，發(fā)現(xiàn)JFTX-22的空間結(jié)構(gòu)主要包含無規(guī)卷曲和三段反平行beta-折疊，分別位于Lys7-Cys9、Ser21-Val23和Gly25-Ser28肽段（圖6），與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本吻合.此外，JFTX-22序列中帶正電荷的氨基酸殘基在結(jié)構(gòu)中具有較為集中的分布特征，其中Arg1和Lys15分布于結(jié)構(gòu)的一側(cè)，而Lys7、Arg24和Lys26分布于另一側(cè)（圖6）.

圖6 JFTX-22的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3.4 JFTX-22同源序列比對(duì)

將JFTX-22序列用在線程序（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=Blast Search&LINK_LOC=blasthome）進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)JFTX-22跟一種來自新加坡狼蛛的毒素多肽（Covalitoxin-I）的序列完全一致，與另外三種蜘蛛毒素JZTX-51、U1-theraphotoxin-Pf3和HWTX-X的同源性分別為68%、68%和64%.利用Clustal X2程序?qū)FTX-22、JZTX-51、U1-theraphotoxin-Pf3和HWTX-X進(jìn)行同源性序列比對(duì)，結(jié)果如圖7.從圖可知，5個(gè)毒素分子中，6個(gè)Cys不但高度保守且位置完全相同，為第2、第9、第18、第19、第22和第27位.而且第4位和第17位的Pro、第6位和第20位的Gly、第16位的Ile以及第26位的Lys也完全相同.另外，第1位和第24位的Arg、第3位的Leu、第7位和第15位的Lys、第14位的Gln保守性也很高.因此，這5個(gè)毒素分子同源性很高，可能來源于共同的祖先.

圖7 JFTX-22同源性序列比對(duì)

3 討論

我們都知道，表達(dá)于DRG細(xì)胞上的TTX-R鈉電流主要有Nav1.8和Nav1.9兩種類型，其中以Nav1.8電流為主.Nav1.8和Nav1.9電流也是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn).大量研究結(jié)果表明Nav1.8在神經(jīng)病理性、多種傷害性刺激誘發(fā)的疼痛以及機(jī)體炎癥中起著重要的作用[11]，而Nav1.9與疼痛調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)緊密相關(guān)[12].由于JFTX-22對(duì)DRG細(xì)胞TTX-R鈉通道電流具有明顯的抑制作用，因此，JFTX-22是一個(gè)潛在的具有鎮(zhèn)痛活性的毒素分子.

下一步以JFTX-22與TTX-R通道為研究對(duì)象，在如下三方面開展深入研究.（1）JFTX-22與TTX-R通道相互作用的模式（JFTX-22與TTX-R通道電壓-電導(dǎo)關(guān)系的影響；JFTX-22與TTX-R通道濃度依賴性）.（2）JFTX-22與TTX-R通道相互作用的分子機(jī)制（JFTX-22活性關(guān)鍵位點(diǎn)的鑒定；JFTX-22作用于TTX-R通道突變體相互作用的分析）.（3）在前面兩方面實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上確認(rèn)JFTX-22具有潛在的鎮(zhèn)痛活性等，通過建立大鼠鎮(zhèn)痛模型，驗(yàn)證JFTX-22對(duì)鎮(zhèn)痛治療的效果及其潛在機(jī)制.