王鳳霞，魏 萌，司麗娜，楊松鶴，程露陽(yáng)，喬躍兵，馬秀艷

(1.承德醫(yī)學(xué)院,河北 承德 067000 2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000)

乳腺癌是女性最常診斷出的癌癥，在女性癌癥相關(guān)死亡原因中位居第二[1]。在乳腺癌的分子分型中，以雌激素受體陽(yáng)性(hormone receptor positive，HR+)者居多，約占 70%[2]。目前以手術(shù)切除和化療輔助為主要治療方式，但手術(shù)切除和化療輔助治療均會(huì)給患者產(chǎn)生嚴(yán)重的生理和心理創(chuàng)傷，尋求不同治療方式和藥物抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞的增殖及活力尤為重要[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)分泌治療手段可通過(guò)降低或競(jìng)爭(zhēng)性抑制腫瘤生長(zhǎng)依賴(lài)的激素(主要為雌激素)或其受體，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[4]。雖然內(nèi)分泌治療副作用較小，但會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，所以尋求新的藥物尤為重要。因此，本文旨在研究一種由下丘腦分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌肽-促性腺激素抑制激素(gonadotropin inhibitory hormone，GnIH)，通過(guò)與受體GPR147結(jié)合經(jīng)下丘腦-垂體-性腺軸抑制促黃體生成素(luteinizing hormone ，LH)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)的分泌和釋放，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)。所以，本研究應(yīng)用GnIH來(lái)探討其是否對(duì)雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌的凋亡造成影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng):人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7在含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿的80%～90%按1∶2～3進(jìn)行傳代，取細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2藥物及其配置:RPRF-3規(guī)格1g，購(gòu)于Tocris Bioscience，U.K。將1g藥物溶于0.5mL PBS中配成2mg/mL的母液，每15μL分裝于EP管-20℃避光保存。15μL藥物溶液溶于培養(yǎng)基用0.22μm的無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾，獲得10000ng/mL的GnIH藥物溶液，倍比稀釋配置成0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL的GnIH藥物溶液。RF9規(guī)格1mg，購(gòu)于MedChemExpress(Monmouth Junction,NJ,USA)。將1mg抑制劑溶于0.2072mL DMSO中配成10mM的母液，每8μL分裝于EP管-20℃避光保存。

1.3試劑:DMEM/RPML1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco)，Biological Industries(BI)公司特級(jí)胎牛血清(中美血源)，cell counting kit-8(CCK-8)購(gòu)于美國(guó)APExBIO，青霉素和鏈霉素、PBS、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于BD公司、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自索萊寶公司，ECL 發(fā)光液購(gòu)自大連美侖公司，兔單克隆抗體(Gapdh、Bcl-2、Bax、caspase-3、cytochrome C、Hsp90、P53、PI3K、AKT/p-AKT、mTOR)購(gòu)于Abcam公司，GPR147兔單克隆抗體購(gòu)于Bioss公司，羊抗兔二抗購(gòu)于Abclone公司。

1.4儀器:高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自北京大龍公司，化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海天能公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自BioTEK公司，電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠，熒光定量PCR儀購(gòu)于BIORAD公司(美國(guó))，雙控溫干式恒溫孵育器購(gòu)自杭州米歐儀器。

1.5CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增值率:收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，以8×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h，吸棄培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入含GnIH濃度為(0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL)的培養(yǎng)基，設(shè)調(diào)零組和PBS對(duì)照組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24后取出，每孔加入100μLCCK-8試劑，于37℃恒溫箱中避光孵育2h，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度(OD)值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(PBS對(duì)照組OD值-GnIH實(shí)驗(yàn)組OD值)/(PBS對(duì)照組OD值-調(diào)零組OD值)。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡:取細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化重懸繼續(xù)培養(yǎng)24h加藥，PBS對(duì)照組、GnIH實(shí)驗(yàn)組10000ng/mL培養(yǎng)24h。用不含乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)的胰酶消化，DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，計(jì)數(shù)1×105，PBS洗兩遍(1000r/min，5min)，棄上清液，加入1×Bidding Buffer懸浮，轉(zhuǎn)移至流式管中，分別加入5μLAnnexin V-FITC和5 μL PI，輕輕渦旋細(xì)胞，室溫25℃暗室孵育15min，每個(gè)流式管加入400μL 1×Bidding Buffer，1h內(nèi)完成上機(jī)檢測(cè)。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)mRNA表達(dá)水平:使用Takare試劑盒提取MCF-7細(xì)胞各組總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，經(jīng)PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，按照試劑盒操作方法檢測(cè)RNA表達(dá)水平，采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量，本實(shí)驗(yàn)以GAPDH為內(nèi)參。

1.8蛋白印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平:應(yīng)用Western Blot法對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。取MCF-7對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液，按GnIH給藥濃度(0ng/mL、10000ng/mL)接種于底面積為21cm3的培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后加藥，繼續(xù)培養(yǎng)24h，取出各組細(xì)胞培養(yǎng)皿，吸棄培養(yǎng)基，用4℃預(yù)冷的PBS清洗，加適當(dāng)體積的含PMSF的RIPA裂解液于-80℃冰箱過(guò)夜，冰上裂解30min，收集細(xì)胞懸液，置于4℃低溫高速離心機(jī)中以12000r/mim離心15min，取上清。根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取蛋白上清1/4的Loading Buffer與上清液充分混合，100℃干式孵育器煮10mim，使蛋白變性，冷卻至室溫-20℃保存。用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白樣本(20μg)，分離后電流設(shè)定200mA恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，取相應(yīng)特異性一抗孵育2h(Bcl2 1∶800、Bax 1∶800、Caspase-3 1∶5000、cytochrome C 1∶5000、Hsp90 1∶10000、Gapdh 1∶10000、P531∶1000、PI3K1∶500、AKT1∶10000、p-AKT1∶1000、m-TOR1∶1000和GPR1471∶1000)均為兔單克隆抗體，4℃過(guò)夜，復(fù)溫30min，TBST洗膜緩沖液洗3次，加入HRP熒光標(biāo)記的二抗(1∶8000)，室溫孵育1h，洗膜后加入ECL特超敏試劑，經(jīng)Tanon 6100凝膠成像儀掃描顯影。采用 Image J 軟件分析，通過(guò)比較目標(biāo)蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值來(lái)確定目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1GnIH對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響:與PBS對(duì)照組相比，經(jīng)GnIH(10000ng/mL)處理MCF-7細(xì)胞24h后，CCK-8檢測(cè)OD值明顯降低(P<0.05)，對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制率為9.272%。見(jiàn)表1。

表1 GnIH對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

2.2GnIH誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的流式檢測(cè)結(jié)果:經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖1，GnIH分別按空白對(duì)照組和10000ng/mL藥物濃度加入到MCF-7作用24h后，其空白對(duì)照組和10000ng/mL組的凋亡率分別為(7.76±1.57)%和(16.14±3.001)%。各組間凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.164，P=0.0351)。見(jiàn)圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞凋亡情況

2.3GnIH在mRNA水平上對(duì)凋亡相關(guān)基因的影響:在MCF-7中對(duì)照組和10000ng/mL實(shí)驗(yàn)組之間BaxmRNA表達(dá)水平上調(diào)(F=6.495，P<0.05)、Caspase-3mRNA表達(dá)水平上調(diào)(F=22.61，P<0.01)和TP53mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(F=10.31，P<0.05)。同樣Bcl-2mRNA和Hsp90mRNA組間比較，Bcl-2mRNA的表達(dá)水平在10000ng/mL時(shí)顯著下降(F=18.26，P<0.01)，Hsp90mRNA的表達(dá)水平與Bcl-2一致(F=12.1，P<0.01)。與對(duì)照組相比，PI3KmRNA與AKTmRNA的表達(dá)水平顯著下降(F=3.993，P<0.05；F=3.776，P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平

2.4凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平:與對(duì)照組相比較，GnIH10000ng/mL實(shí)驗(yàn)組Bax(P<0.01)、Caspase-3(P<0.01)、cytochrome C(P<0.01)、P53(P<0.05)蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2(P<0.01)蛋白表達(dá)水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

圖2 Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

(A 凋亡相關(guān)蛋白的印跡圖。B 凋亡相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量)

2.5PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白的表達(dá)：Western Blot結(jié)果顯示，經(jīng)10000ng/mL的GnIH作用MCF-7細(xì)胞24h后，與對(duì)照組比較PI3K、AKT/pAKT、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量依次降低；在10000ng/mL時(shí)與對(duì)照組比較PI3K、AKT/pAKT、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白的表達(dá)

2.6MCF-7細(xì)胞系GRP147受體表達(dá)情況：對(duì)照組與GnIH實(shí)驗(yàn)組10000ng/mL相比較，MCF-7細(xì)胞系上的GPR147蛋白表達(dá)在10000ng/mL是表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

圖4 MCF-7細(xì)胞系GRP147受體表達(dá)情況

2.7拮抗劑RF9干預(yù)后GnIH對(duì)相關(guān)蛋白的影響：抑制劑干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組GnIH10000ng/mL與對(duì)照組相比AKT/p-AKT蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，GnIH10000ng/mL+抑制劑RF910μmoL實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)組GnIH10000ng/mL比較，MCF-7細(xì)胞AKT/p-AKT蛋白表達(dá)量顯著增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5 拮抗劑RF9干預(yù)后GnIH/RFRP-3對(duì)相關(guān)蛋白的影響

3 討 論

乳腺癌屬于激素依賴(lài)性腫瘤,雌激素與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在占比較高的HR+ 乳腺癌中，對(duì)抗雌激素的內(nèi)分泌治療效果是顯著的[5]。研究表明，GnIH通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸抑制促卵泡激素FSH、黃體生成素LH釋放，抑制卵泡顆粒層細(xì)胞增生分化，抑制卵巢發(fā)育，降低雌激素合成與分泌。有研究發(fā)現(xiàn)[6]，促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)對(duì)細(xì)胞凋亡有影響，但作用機(jī)制尚不明確。

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPCR)是一類(lèi)七次跨膜的蛋白家族，與神經(jīng)遞質(zhì),激素等配體結(jié)合激活GPCR，使各種細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),從而在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能中起重要作用,這也和人類(lèi)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系。本研究使用的GnIH其受體為G蛋白偶聯(lián)受體147(G protein-coupled receptor147，GPR147)是GPCR家族成員，當(dāng)GnIH與其膜受體GPR147結(jié)合后，將GnIH從細(xì)胞外輸送到胞體內(nèi)，引起細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7膜上存在GPR147受體，并且隨著GnIH藥物濃度的升高，促進(jìn)了GPR147受體的表達(dá)，造成MCF-7細(xì)胞的凋亡率增加。此外，激活的GPR147抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程，并且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。PI3K通過(guò)激活絲氨酸/蘇氨酸酶AKT，AKT又通過(guò)大量的調(diào)節(jié)子最終造成絲氨酸/蘇氨酸酶MTOR的磷酸化。在腫瘤細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)途徑常處于被激活狀態(tài),從而維持其活躍的增殖能力。但是，本研究結(jié)果顯示GnIH在10000ng/mL時(shí)與對(duì)照組相比抑制了MCF-7細(xì)胞的PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白表達(dá)水平，表明當(dāng)GnIH達(dá)到10000ng/mL時(shí)較明顯抑制了PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，進(jìn)而抑制MCF-7的增殖。GPR147特異性拮抗劑RF9，可以抑制其受體活性，引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)[8,9]。本實(shí)驗(yàn)GnIH聯(lián)合RF9作用MCF-7細(xì)胞系，結(jié)果顯示抑制劑干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組GnIH1000ng/mL與對(duì)照組相比AKT/p-AKT蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，GnIH1000ng/mL+抑制劑RF910μmoL實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)組GnIH1000ng/mL比較，MCF-7細(xì)胞AKT/p-AKT蛋白表達(dá)量顯著增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示，GnIH可能通過(guò)影響GPR147的活性發(fā)揮抑制MCF-7細(xì)胞增殖的效應(yīng)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞受特定基因調(diào)控的主動(dòng)性的有序死亡，主要由內(nèi)源性線(xiàn)粒體途徑發(fā)揮作用[10]。線(xiàn)粒體作為細(xì)胞凋亡的控制中心，當(dāng)細(xì)胞受到外界藥物刺激時(shí)會(huì)損傷線(xiàn)粒體功能，引起B(yǎng)cl-2家族中Bcl-2/Bax這兩種蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化[11]。p53是與癌癥相關(guān)的最常見(jiàn)突變基因,在多種應(yīng)激誘發(fā)的凋亡中起關(guān)鍵作用，當(dāng)細(xì)胞接受到凋亡信號(hào)后p53蛋白行使轉(zhuǎn)錄因子的作用上調(diào)Bax/Bcl-2比值，線(xiàn)粒體膜電位變化并最終提高線(xiàn)粒體外膜通透性，同時(shí)會(huì)將細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyto C)釋放至細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)一步激活caspase-3增強(qiáng)細(xì)胞凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中可以看出，與對(duì)照組比較，GnIH1000ng/mL實(shí)驗(yàn)組P53、Bcl-2、Bax、Cytochrome c和Caspase-3蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化，GnIH10000ng/mL實(shí)驗(yàn)組P53、Bax、Cytochrome c和Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)。說(shuō)明低劑量的GnIH對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡作用較小，而藥物劑量達(dá)到10000ng/mL時(shí)細(xì)胞凋亡率較顯著。

熱休克蛋白(Heatshockprotein,HSP)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起重要作用的分子伴侶蛋白家族[12]。其中[13]，HSP90是熱休克蛋白家族中最活躍的分子伴侶之一，PI3K和AKT都是HSP90重要伴侶蛋白。HSP90在多數(shù)腫瘤中高表達(dá)，參與腫瘤的增殖、遷移和侵襲。結(jié)合Western Blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，促性腺激素抑制激素對(duì)雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌MCF-7細(xì)胞HSP90蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)GnIH可以抑制HSP90的表達(dá)，提示GnIH通過(guò)抑制HSP90的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)MCF-7的凋亡，推測(cè)GnIH作用腫瘤細(xì)胞可能與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

總之，GnIH可以抑制雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖。其作用機(jī)制可能通過(guò)GPR147受體抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路和激活線(xiàn)粒體凋亡途徑引起凋亡因子Bax和caspase凋亡家族上調(diào)有關(guān)。另外，由于GnIH抑制熱休克蛋白HSP90的表達(dá)可推測(cè)，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而促進(jìn)凋亡。然而，本研究?jī)H為體外實(shí)驗(yàn)未涉及到體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，并且對(duì)具體機(jī)制及其信號(hào)通路尚有欠缺，亟待后續(xù)進(jìn)一步深入研究。