鄧玉瑩，邵炳豪，位雪，王慧慧，王春梅

北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488

土鱉蟲(chóng)又名土元，為鱉蠊科昆蟲(chóng)地鱉Eupolyphaga sinensisWalker 或冀地鱉Steleophaga plancyi（Boleny）的雌蟲(chóng)干燥體，有小毒，可用于跌打損傷、筋傷骨折、血瘀經(jīng)閉等[1]?，F(xiàn)代研究表明，土元具有溶解血栓、拮抗凝血、促進(jìn)骨折愈合等多種藥理活性[2-5]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，土元對(duì)成骨細(xì)胞模型MC3T3-E1 細(xì)胞具有顯著的促增殖作用，且可促進(jìn)骨折大鼠的恢復(fù)[6]。本實(shí)驗(yàn)使用土元提取物，優(yōu)化了土元凝膠貼膏基質(zhì)，為其開(kāi)發(fā)成為一種治療外傷骨折等疾病的外用制劑奠定了基礎(chǔ)。凝膠貼膏指原料藥物與適宜的親水性基質(zhì)混勻后涂布于背襯材料上，制成的貼膏劑，具有使用方便、載藥量大、藥物透皮吸收效率高等顯著優(yōu)點(diǎn)，且具有局部給藥、降低藥峰濃度、可隨時(shí)停藥等特點(diǎn)，更適合毒性藥物的使用[7]。凝膠貼膏基質(zhì)主要由骨架材料、交聯(lián)劑、交聯(lián)調(diào)節(jié)劑、保濕劑、填充劑等組成，骨架材料可交聯(lián)形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提供一定的膠強(qiáng)度和黏性；交聯(lián)調(diào)節(jié)劑可避免交聯(lián)過(guò)快導(dǎo)致的涂布困難；保濕劑在保留水分的同時(shí)，可增加凝膠貼膏柔韌度；填充劑既可吸附藥物，也可提供基質(zhì)強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)以初黏力、剝離強(qiáng)度、持黏力為指標(biāo)，單因素試驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)化凝膠貼膏基質(zhì)，以確定最佳的土元貼膏空白基質(zhì)處方，而后通過(guò)正交試驗(yàn)法確定含藥凝膠貼膏處方，本研究所得的凝膠貼膏基質(zhì)更適用于黏度較低的中藥提取物。

1 材料

PB303-S 型電子天平（北京Sartorius 儀器有限公司）；CNS-11888 型膠帶初黏力測(cè)定儀（濟(jì)南賽成電子科技有限公司）；CZY-25 型持黏性測(cè)試儀、BLD-200N 型電子剝離試驗(yàn)機(jī)（濟(jì)南蘭光機(jī)電技術(shù)有限公司）。

聚丙烯酸鈉（NP-700，北京希比希貿(mào)易有限公司）；甘羥鋁（北京希比希貿(mào)易有限公司；分析純）；氫氧化鋁、檸檬酸、酒石酸、甘油（北京化工廠，批號(hào)分別為20141010、20140814、20170606、20200630）；高嶺土（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Z25J10Y91491）；純凈水（娃哈哈集團(tuán)有限公司）；無(wú)紡布；壓花膜。

2 方法

2.1 空白凝膠貼膏的制備方法

A 相：稱取處方量的酒石酸，加純凈水?dāng)嚢柚镣耆芙?。B 相：稱取處方量甘羥鋁、NP-700、高嶺土至蒸發(fā)皿中混合，加入甘油攪拌均勻。將A 相邊攪拌邊加入B 相中，以約60 r·min-1手動(dòng)攪拌均勻，后置于無(wú)紡布上加蓋壓花膜進(jìn)行涂布，室溫放置成型。

2.2 指標(biāo)的測(cè)定和評(píng)價(jià)方案

2.2.1 測(cè)定方法

2.2.1.1 初黏力 按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版黏附力測(cè)定第一法規(guī)定采用斜坡滾球測(cè)定。

2.2.1.2 剝離強(qiáng)度 取供試凝膠貼膏貼于潔凈的不銹鋼板上，用2 kg 的壓輥以自身質(zhì)量來(lái)回?cái)D壓3 次，放置10 min 后，置于電子剝離試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行剝離實(shí)驗(yàn)，測(cè)力計(jì)以300 mm·min-1的速度將其從不銹鋼板上拉離并做180°折返，記錄測(cè)力儀顯示的讀數(shù)。平行測(cè)試3次，取平均值。

2.2.1.3 持黏力 將供試凝膠貼膏（6 cm×3 cm）粘貼于2 塊不銹鋼板中央相接處，用2 kg 的壓輥以自身質(zhì)量來(lái)回?cái)D壓3 次，懸掛于持黏性測(cè)試儀上，垂直放置，懸掛200 g砝碼，計(jì)時(shí)，記錄鋼板落下的時(shí)間（s），平行測(cè)試2次，取平均值。

2.2.2 評(píng)價(jià)方案

為了能全面評(píng)價(jià)貼膏的性能，本實(shí)驗(yàn)采用綜合評(píng)價(jià)方案。將2.1項(xiàng)下的每個(gè)指標(biāo)均標(biāo)準(zhǔn)化為0～1的“歸一值（OD值）[8]”。對(duì)取值越大越好的因素（初黏力、持黏力及剝離強(qiáng)度＜0.333 kN·m-1者），按公式（1）計(jì)算歸一值（dmax），對(duì)剝離強(qiáng)度＞0.333 kN·m-1者，按公式（2）計(jì)算歸一值（dmin）。在單因素試驗(yàn)與載藥量考察中，綜合評(píng)分計(jì)算方法為將得到的“歸一值”求平均值，按公式（3）計(jì)算，在Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)中綜合評(píng)分方法為計(jì)算三者幾何平均得到總“歸一值”，按公式（4）計(jì)算。

式中，dmax為取值越大越好的因素歸一值；dmin為取值越小越好的因素歸一值；Y為本指標(biāo)測(cè)定值；OD為總歸一值。

剝離強(qiáng)度越小，揭下凝膠貼膏時(shí)痛感越小，但剝離強(qiáng)度同時(shí)反映了基質(zhì)黏度，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)8 篇已發(fā)表的凝膠貼膏基質(zhì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)的配方進(jìn)行了重復(fù)[9-16]，檢測(cè)其初黏力和剝離強(qiáng)度，并確定適宜的剝離強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 8篇文獻(xiàn)中初黏力及剝離強(qiáng)度測(cè)定值

由表1 可知，凝膠貼膏初黏力和剝離強(qiáng)度間存在一定的正相關(guān)，回歸系數(shù)R2=0.763 9，說(shuō)明在評(píng)價(jià)凝膠貼膏基質(zhì)時(shí)不是剝離強(qiáng)度越小越好，8 篇文獻(xiàn)中剝離強(qiáng)度平均值為0.333 kN·m-1，故認(rèn)為以剝離強(qiáng)度為0.333 kN·m-1時(shí)評(píng)分最高。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 交聯(lián)時(shí)間考察 交聯(lián)型凝膠貼膏基質(zhì)強(qiáng)度的來(lái)源是交聯(lián)劑和骨架材料的交聯(lián)作用，凝膠貼膏基質(zhì)強(qiáng)度會(huì)隨著交聯(lián)時(shí)間增加而改變，故本實(shí)驗(yàn)首先考察凝膠貼膏交聯(lián)時(shí)間。按照2.1 項(xiàng)下方法平行制備7 張空白凝膠貼膏，分別放置1～7 d 后，按2.2.1項(xiàng)下方法測(cè)試指標(biāo)，按2.2.2項(xiàng)下方法評(píng)價(jià)貼膏。

2.3.2 優(yōu)選交聯(lián)劑種類 本實(shí)驗(yàn)考察氫氧化鋁、甘羥鋁不同用量對(duì)凝膠貼膏基質(zhì)性狀的影響。取酒石酸0.4 g，純凈水20 g，攪拌均勻作為A 相，另取聚丙烯酸鈉10 g，分別加入氫氧化鋁或甘羥鋁0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g，混合均勻后加入甘油20 g，攪拌均勻作為B相；制備凝膠貼膏評(píng)價(jià)。

2.3.3 優(yōu)選交聯(lián)調(diào)節(jié)劑種類 本實(shí)驗(yàn)考察酒石酸、檸檬酸不同用量對(duì)凝膠貼膏基質(zhì)性狀的影響。分別取酒石酸或檸檬酸0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g，純凈水20 g，攪拌均勻作為A相，另取聚丙烯酸鈉10 g、加入甘羥鋁0.3 g，混合均勻后加入甘油20 g，攪拌均勻作為B相；制備凝膠貼膏評(píng)價(jià)。

2.3.4 優(yōu)選保濕劑用量 本實(shí)驗(yàn)選擇甘油作為保濕劑，取酒石酸0.3 g，純凈水20 g，攪拌均勻作為A相，另取聚丙烯酸鈉10 g、加入甘羥鋁0.3 g，混合均勻后分別加入甘油18、27、36、45、54 g，攪拌均勻作為B相；制備凝膠貼膏評(píng)價(jià)。

2.3.5 優(yōu)選純凈水用量 取酒石酸0.3 g，純凈水12、24、36、48、60 g，攪拌均勻作為A 相，另取聚丙烯酸鈉10 g、加入甘羥鋁0.3 g，混合均勻后加入甘油36 g，攪拌均勻作為B 相；制備凝膠貼膏評(píng)價(jià)。

2.3.6 優(yōu)選填充劑用量 本實(shí)驗(yàn)選擇高嶺土作為填充劑。取酒石酸0.3 g，純凈水24 g，攪拌均勻作為A 相，另取聚丙烯酸鈉10 g、甘羥鋁0.3 g，分別加入高嶺土0、4、8、12、16 g，混合均勻后加入甘油36 g，攪拌均勻作為B相；制備凝膠貼膏評(píng)價(jià)。

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)

2.4.1 考察因素與水平 以2.3 項(xiàng)下的單因素試驗(yàn)結(jié)論為基礎(chǔ)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選取對(duì)貼膏影響較大的酒石酸用量（A）、甘羥鋁用量（B）、甘油用量（C）和高嶺土用量（D），采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)，考察因素與水平見(jiàn)表2。

表2 土元凝膠貼膏Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平

2.4.2 數(shù)據(jù)結(jié)果與處理 利用Design-Expert V8.0.6 軟件安排試驗(yàn)，按2.1 項(xiàng)下方法制備，2.2.1項(xiàng)下方法測(cè)試指標(biāo)。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)得出的最優(yōu)成型工藝進(jìn)行3 批平行試驗(yàn)，并測(cè)試初黏力、持黏力、剝離強(qiáng)度、膜殘留性指標(biāo)，并將此數(shù)據(jù)與Design-Expert V 8.0.6 軟件中給出的預(yù)測(cè)值對(duì)比。

2.6 載藥量的考察

土元貼膏所載藥物為土元提取物的凍干粉，其制備方法如下：土元加8 倍量水，提取2 次，每次40 min，純化后凍干。藥物含量設(shè)置4 個(gè)水平，按2.4 項(xiàng)下得到的最佳配比，分別加入貼膏總質(zhì)量2.5%、5.0%、7.5%、10.0%的土元凍干粉，制備凝膠貼膏評(píng)價(jià)。

為盡可能增大載藥量，以載藥量（X）、高嶺土用量（Y）、甘油用量（Z）和為因素，使用正交設(shè)計(jì)對(duì)含藥貼膏進(jìn)行再次優(yōu)化，因素水平見(jiàn)表3。

表3 土元凝膠貼膏載藥量正交試驗(yàn)因素水平

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 交聯(lián)時(shí)間考察 由圖1 可知，凝膠貼膏在交聯(lián)3 d后綜合評(píng)分最高，其黏性和膠強(qiáng)度適宜，故確定交聯(lián)時(shí)間為3 d。

圖1 土元凝膠貼膏交聯(lián)時(shí)間考察結(jié)果

3.1.2 優(yōu)選交聯(lián)劑種類 由圖2 可知，甘羥鋁用量在0.2～0.4 g 時(shí)綜合評(píng)分均高于氫氧化鋁，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨交聯(lián)劑用量增加，膏體硬度增加，用料超過(guò)0.5 g時(shí)，膏體交聯(lián)速度過(guò)快，難以涂布，故選擇交聯(lián)劑為甘羥鋁，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中甘羥鋁的優(yōu)化為0.2～0.4 g。

圖2 土元凝膠貼膏交聯(lián)劑種類考察

3.1.3 優(yōu)選交聯(lián)調(diào)節(jié)劑種類 由圖3 可知，2 種交聯(lián)調(diào)節(jié)劑用量為0.2～0.4 g時(shí)綜合評(píng)分高于0.5～0.6 g，且酒石酸綜合評(píng)分高于檸檬酸，故確定交聯(lián)調(diào)節(jié)劑種類為酒石酸，后續(xù)優(yōu)化用量為0.2～0.4 g。

圖3 土元凝膠貼膏交聯(lián)調(diào)節(jié)劑種類考察

3.1.4 優(yōu)選保濕劑用量 由圖4 可知，隨保濕劑甘油用量增加，綜合評(píng)分先增大后減小，當(dāng)甘油用量為27～45 g 時(shí)綜合評(píng)分最優(yōu)，故選用27～45 g 為后續(xù)實(shí)驗(yàn)考察范圍。

圖4 土元凝膠貼膏保濕劑用量考察

3.1.5 優(yōu)選純凈水用量 由圖5 可知，隨著水用量的增加，綜合評(píng)分先增大后減小，當(dāng)水用量為24 g時(shí)，凝膠貼膏性狀最優(yōu)，故確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)用水量為24 g。

圖5 土元凝膠貼膏水用量考察

3.1.6 優(yōu)選填充劑用量 由圖6 可知，隨填充劑高嶺土的增加，綜合評(píng)分先減小后增加再減小，當(dāng)高嶺土用量為4～12 g 時(shí)綜合評(píng)分最優(yōu)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高嶺土用量為16 g 時(shí)，膏體過(guò)硬，難以涂布，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用4～12 g為考察范圍。

圖6 土元凝膠貼膏填充劑用量考察

3.2 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)

指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4，回歸方程的方差分析見(jiàn)表5，預(yù)測(cè)效應(yīng)面圖見(jiàn)圖7。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以O(shè)D值對(duì)所選的4個(gè)因素通過(guò)多元回歸分析可得到含有曲率的二階響應(yīng)表面模型方程，即OD=0.54+0.10A+0.30B-0.082C+0.64D-0.004AB+0.06AC+0.071AD-0.13BC+0.16BD-0.008 25CD-0.16A2-0.068B2-0.084C2+0.022D2（P＜0.000 1，r=0.903 5）；方程中模型皆顯著，失擬項(xiàng)皆不顯著，表明該模型可以很好地預(yù)測(cè)凝膠貼膏性狀。r＞0.9，殘差皆分布在一條直線上，進(jìn)一步說(shuō)明模型擬合優(yōu)度較好，可用來(lái)對(duì)凝膠貼膏的制備工藝進(jìn)行初步分析和預(yù)測(cè)。

表4 土元凝膠貼膏Box-Behnken設(shè)計(jì)與指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

根據(jù)表5 可知，4 個(gè)因素對(duì)OD 值影響均顯著，即酒石酸、甘羥鋁、高嶺土和甘油的用量可以顯著改變凝膠貼膏基質(zhì)性狀。凝膠貼膏中NP-700 與甘羥鋁反應(yīng)，形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可以提高基質(zhì)膠強(qiáng)度；酒石酸可以促進(jìn)鋁離子電離，進(jìn)而調(diào)節(jié)交聯(lián)反應(yīng)速度；高嶺土可以增加凝膠貼膏黏彈性，進(jìn)而改變黏度及藥物釋放；甘油可以促進(jìn)皮膚水合作用，且可以改變膏體黏度，不同基質(zhì)組成間具有一定的交互作用[17-18]。預(yù)測(cè)響應(yīng)面圖中，等高線越接近橢圓，說(shuō)明2個(gè)因素間相互作用越大。由圖7可知，多種因素間存在相互作用。響應(yīng)面法是一種綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，通過(guò)對(duì)具有代表性的各點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，回歸擬合全局范圍內(nèi)因素與結(jié)果間的函數(shù)關(guān)系，并且取得各因素最優(yōu)水平值[19]，其較為常用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法有Box-Behnken 設(shè)計(jì)和星點(diǎn)設(shè)計(jì)法，均可以考慮不同因素間的相互作用。本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定各輔料合理使用區(qū)間，可使Box-Behnken 設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化效率更高、結(jié)果更可信。

圖7 土元凝膠貼膏OD值預(yù)測(cè)響應(yīng)面圖

表5 土元凝膠貼膏Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)果OD值方差分析

通過(guò)Design-Expert V 8.0.6軟件分析得出1組最優(yōu)的成型工藝參數(shù)：NP-700 10.00 g、甘羥鋁0.40 g、酒石酸0.32 g、甘油36.65 g、高嶺土12.00 g、水24.00 g，此時(shí)初黏力可粘住直徑為18.764 mm 的鋼球，持黏力達(dá)到600 s，剝離強(qiáng)度為0.321 kN·m-1。

3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

以最優(yōu)成型工藝進(jìn)行3批平行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表6。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)各指標(biāo)RSD 均小于5%，表明差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值相近，認(rèn)為此工藝穩(wěn)定可行，可用于后續(xù)土元凝膠貼膏的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。

表6 土元凝膠貼膏驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4 載藥量的考察

以初黏力、持黏力、剝離強(qiáng)度為指標(biāo)，在空白貼膏的基礎(chǔ)上對(duì)載藥量進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)表7。由表7 可知，隨著載藥量的增加，凝膠貼膏黏性逐漸降低，同時(shí)在制備含藥凝膠貼膏的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，凍干粉的加入可以起到類似填充劑的作用。為保證在含藥量盡量大的同時(shí)貼膏黏性不下降，使用正交設(shè)計(jì)法，以載藥量、高嶺土和甘油含量為因素，進(jìn)行L9（3）4正交試驗(yàn)，優(yōu)化最佳含藥凝膠貼膏處方，結(jié)果見(jiàn)表8～9。

表7 土元凝膠貼膏載藥量的篩選

表8 土元凝膠貼膏載藥量正交試驗(yàn)結(jié)果

表9 土元凝膠貼膏正交試驗(yàn)OD值方差分析

方差分析發(fā)現(xiàn)，載藥量、高嶺土用量和甘油用量對(duì)OD 值影響皆顯著，說(shuō)明3個(gè)因素對(duì)凝膠貼膏均有較大影響。從直觀分析表可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)X 為1、Y 為2、Z 為2 時(shí)，凝膠貼膏綜合評(píng)分最高，其中X 的1、2 水平間差距較小，為盡量增加載藥量，選擇最優(yōu)工藝為X2Y2Z2，即載藥量10%，高嶺土8 g，甘油36 g。使用最佳處方進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證，其初黏力平均可粘住直徑為10.319 mm小球，持黏力平均值為255 s，剝離強(qiáng)度平均值為0.292 kN·m-1，明顯優(yōu)于未優(yōu)化前（9.525 mm、46 s、0.097 kN·m-1），故認(rèn)為此工藝穩(wěn)定可行。

土元凍干粉中大部分為蛋白質(zhì)，另有少量脂肪和氨基酸，其和A 相混合后呈混懸液，加入凝膠貼膏后會(huì)顯著降低其黏性，但對(duì)基質(zhì)強(qiáng)度影響較小。目前，中藥凝膠貼膏的研究多以植物藥為原料，其提取物中含大量多糖、鞣質(zhì)或各種脂溶性化合物，其可降低凝膠貼膏黏性和膠強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)制備得到的凝膠貼膏減少了填充劑的使用，更適用于各種低黏性藥物，如各種動(dòng)物藥、粉質(zhì)類藥材提取物或單體化合物，但可能不適用于含大量脂溶性成分的中藥提取物。

最終優(yōu)化的具體處方為NP-700 10.00 g、甘羥鋁0.40 g、酒石酸0.32 g、甘油36.00 g、高嶺土8.00 g、水24.00 g，載藥10%土元凍干粉，制備方法為將NP-700、甘羥鋁、甘油、高嶺土混勻后作為B 相，酒石酸、土元凍干粉、水混勻后作為A 相，將A 相邊攪拌邊加入B相中，以約60 r·min-1手動(dòng)攪動(dòng)均勻，后置于無(wú)紡布上加蓋壓花膜進(jìn)行涂布，室溫放置3 d即得。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)制備得到了初黏力高、剝離無(wú)痛感、膠體強(qiáng)度大的土元凝膠貼膏，其基質(zhì)更適用于低黏性藥物及其提取物，后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其具有良好的促骨折愈合活性，且無(wú)皮膚刺激性或毒性，為土元凝膠貼膏的臨床應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。