潘飛豹，柯 莉，蔣絲麗，蔣世杰

腦出血是腦卒中的一種常見類型，發(fā)病率高，死亡率高，多數(shù)病人在發(fā)病后會導(dǎo)致長期的神經(jīng)功能缺損[1]。腦出血發(fā)生后，腦血管滲出的血液在實(shí)質(zhì)內(nèi)形成血腫，進(jìn)而引起局部壓力，導(dǎo)致原發(fā)性腦損傷[2]。手術(shù)清除血腫治療可以消除這種結(jié)構(gòu)性損傷。腦出血后繼發(fā)性腦損傷是由血腫降解的血液成分和產(chǎn)物觸發(fā)的，可引起細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激和炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡、腦水腫和神經(jīng)行為缺陷[3]。目前，越來越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激是腦出血繼發(fā)性腦損傷的關(guān)鍵因素，其原因是活性氧(ROS)的產(chǎn)生，通過直接氧化細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[4]；抗氧化酶類，包括谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性會隨之下降。姜黃素是從姜科、天南星科中一些植物的根莖中提取的一種化學(xué)成分，是植物界很稀少的具有二酮的色素，為二酮類化合物[5]。姜黃素能夠抗氧化、抗炎、抑制線粒體級聯(lián)活性，并在阿爾茨海默病、癲癇、認(rèn)知障礙、帕金森病等各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床前模型中顯示出神經(jīng)保護(hù)活性。有報(bào)道顯示，姜黃素可通過其抗凋亡、抗氧化和抗炎活性，在實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷中起到神經(jīng)保護(hù)作用[6]。但是，姜黃素在腦出血后腦損傷中是否具有神經(jīng)保護(hù)活性尚不清楚。因此，本研究探討了姜黃素對腦出血后氧化應(yīng)激和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，旨在為臨床治療提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 30只無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠，10周齡，體質(zhì)量320～350 g，購自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2017-0001]。實(shí)驗(yàn)開始前至少1周，大鼠被安置在溫度(23±2)℃、12 h光照/黑暗周期交替、濕度50%～60%的動物飼養(yǎng)籠中。將30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、腦出血+溶媒組(CH+V組)、腦出血+姜黃素組(CH+Cur組)，每組均為10只。通過尾狀核注射膠原酶制備大鼠腦出血模型，大鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，利用立體定向儀將24G靜脈留置針進(jìn)針至尾狀核中心并固定于顱骨。將0.3個單位的Ⅳ型膠原酶，溶解于1.0 mL生理鹽水中，用Hamilton微量注射器以1.1 mL/min的速度注入右側(cè)尾狀體內(nèi)，留針10 min，然后慢慢拔出。顱骨鉆孔是用骨蠟封閉的。實(shí)驗(yàn)大鼠可自由飲水和進(jìn)食。Sham組：Hamilton微量注射器抽取藥物為等量生理鹽水，其余操作步驟同上。術(shù)后24 h行Rosenberg評分[7]，>10分者入選。大鼠蘇醒后Sham組及CH+V組予以等量生理鹽水灌胃，CH+Cur組予以姜黃素100 mg/kg灌胃，術(shù)后2 h、24 h、48 h各注射1次。

1.2 原代神經(jīng)元培養(yǎng) 從E18大鼠胚胎中獲得原代皮層神經(jīng)元。用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)機(jī)械粉碎分離皮層組織。將分離的皮層神經(jīng)元按105個/皿的密度加入含1%胎牛血清、1%谷氨酰胺和0.3%葡萄糖的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。神經(jīng)元細(xì)胞在37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第12天準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)，3 d更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.3 細(xì)胞活力、乳酸脫氫酶(LDH)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶修飾的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)檢測 從大鼠動脈血中提取溶血物[8]。將全血中的紅細(xì)胞在干冰上冷凍20 min進(jìn)行裂解。之后，將溶血液保存在-80 ℃待測。用不同濃度的姜黃素(0 mmol/L、10 mmol/L、100 mmol/L、300 mmol/L)或不同濃度(0、0.100、0.020、0.010、0.005)的溶血物在神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液中處理24 h，再用100 mmol/L的姜黃素或0.100的溶血劑在神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液中處理0 h、12 h、24 h、48 h和72 h。每孔加入10 μL細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)，37 ℃孵育2 h，在450 nm處測定吸光度。此外，神經(jīng)元用0.100溶血產(chǎn)物或與100 mmol/L姜黃素共同作用于神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液中24 h。收集每孔培養(yǎng)液100 mL。LDH細(xì)胞毒性檢測試劑盒按照制造商說明書(南京建成生物工程研究所)進(jìn)行測定。另外，TUNEL檢測細(xì)胞凋亡。在熒光顯微鏡下觀察照片，并對凋亡神經(jīng)元的數(shù)量進(jìn)行定量。

1.4 病變體積及腦含水量檢測 在術(shù)后72 h評估腦損傷體積。在戊巴比妥鈉深度麻醉下，大鼠先經(jīng)心灌注PBS，再灌注4%多聚甲醛。然后取腦連續(xù)切片(2 mm，針入口處前后各2 mm)，照相。血腫面積由2人獨(dú)立地應(yīng)用Image J軟件定量計(jì)算。大鼠在術(shù)后72 h進(jìn)行斷頭，取出大腦，分成同側(cè)和對側(cè)皮質(zhì)。將分離的組織樣品稱重，獲得濕重，然后在100 ℃烘干48 h確定干重。腦組織含水量百分比=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5 蛋白印跡法(Western Blot) 取下大鼠腦組織后，在RIPA裂解緩沖液中制備勻漿，在4 ℃條件下以13 000×g/min的速度離心，使用Bradford蛋白分析試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度。在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳膠中負(fù)載等量的蛋白質(zhì)(每個樣品20 μg)，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用抗 Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)抗體、抗核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)抗體、抗血紅素加氧酶-1(HO-1)抗體、抗β-actin抗體、抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗活性Caspase-9抗體或抗活性Caspase-3抗體孵育過夜，然后與辣根過氧化物酶連接的二級抗體孵育3 h。TBST緩沖液洗滌，化學(xué)發(fā)光液(ECL)發(fā)光顯影。采用Image J軟件對圖像進(jìn)行分析。

1.6 免疫熒光和TUNEL染色 大鼠在戊巴比妥鈉深度麻醉下，術(shù)后72 h經(jīng)心內(nèi)灌注4%多聚甲醛/PBS進(jìn)行免疫熒光染色。取下腦組織，4%多聚甲醛/PBS固定1 d。用冰凍切片機(jī)獲得8 mm厚的冠狀面。冠狀切片用0.5% Triton X-100/PBS孵育，用5%山羊血清封閉，然后與抗神經(jīng)元核抗體(稀釋1∶200)或兔抗活性Caspase-3抗體(稀釋1∶200)在4 ℃孵育過夜。切片用PBS洗滌，與羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG(稀釋1∶400)二抗孵育。根據(jù)制造商的說明書，使用原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒(德國羅氏)進(jìn)行TUNEL染色以檢測神經(jīng)元凋亡。最后，用PBS洗滌切片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 生化分析 在戊巴比妥鈉深度麻醉下于術(shù)后72 h處死大鼠。取腦，取同側(cè)皮質(zhì)血腫段。取組織勻漿于冰冷Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)中，4 ℃離心，離心速度為13 000×g/min，采用Bradford蛋白分析試劑盒(北京Solarbio)測定蛋白質(zhì)濃度。利用ROS、SOD和GSH-Px試劑盒(北京Solarbio)測定ROS、GSH-Px、SOD表達(dá)水平。用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的商品化試劑盒檢測8-羥色胺(8-OHDG)、3-硝基酪氨酸、丙二醛(MDA)含量。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素抑制血腫溶解物誘導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)元凋亡 1 mmol/L、10 mmol/L、100 mmol/L、300 mmol/L姜黃素對原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞活力無影響(見圖1A)。在72 h內(nèi)，100 mmol/L姜黃素對原代皮層神經(jīng)元的細(xì)胞活力也無影響(見圖1B)。用不同濃度溶血產(chǎn)物處理24 h，原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞存活率明顯降低(見圖1C)。當(dāng)溶血產(chǎn)物濃度為0.100時，原代皮層神經(jīng)元在12 h、24 h、48 h和72 h細(xì)胞存活率明顯降低(見圖1D)?；谝陨辖Y(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇100 mmol/L姜黃素和濃度為0.100的溶血產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與對照組相比，大腦皮層神經(jīng)元經(jīng)0.100溶血產(chǎn)物處理24 h后，細(xì)胞存活率明顯下降，LDH水平和細(xì)胞凋亡率明顯增加，而經(jīng)100 mmol/L姜黃素處理可有效減弱這一效應(yīng)(見圖1E～圖1G)。

圖1 姜黃素抑制血腫溶解物誘導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞活力及凋亡情況

2.2 姜黃素對腦出血后72 h腦含水量的影響 CH+V組與CH+Cur組的血腫體積分別為(35.5±6.2)mm3、(32.6±5.7)mm3，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖2。在腦出血后72 h評估血腫周圍腦水腫情況，與Sham組相比，腦出血大鼠同側(cè)皮層腦組織含水量增加，姜黃素可明顯降低腦出血后72 h腦組織含水量，見圖3。

圖2 姜黃素對腦出血后72 h腦血腫體積的影響

圖3 姜黃素對腦出血后72 h腦組織含水量的影響

2.3 姜黃素對腦出血后72 h血腫周圍組織氧化應(yīng)激的影響 與Sham組相比，腦出血大鼠腦組織ROS、8-OHDG、3-硝基酪氨酸、MDA水平明顯升高(P<0.05)，而姜黃素干預(yù)可降低腦出血后72 h ROS、8-OHDG、3-硝基酪氨酸、MDA水平。與Sham組比較，CH+V組GSH-Px和SOD活性降低，而姜黃素減輕了GSH-Px和SOD的活性下降。詳見表2。為了進(jìn)一步探討姜黃素在腦出血后氧化應(yīng)激中的作用，利用Western Blot法檢測了Keap1-Nrf2信號通路相關(guān)蛋白變化。結(jié)果表明，與Sham組相比，腦出血后Keap1表達(dá)降低，Nrf2和HO-1表達(dá)增加；與CH+V組相比，CH+Cur組Keap1、Nrf2和HO-1的表達(dá)明顯增加。詳見圖4。

表2 姜黃素對腦出血后72 h血腫周圍組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響(±s)

圖4 Keap1-Nrf2信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4 姜黃素對腦出血后Bcl-2/Bax/Caspase信號通路活性的影響 Western Blot結(jié)果顯示，與CH+V組相比，CH+Cur組Bcl-2表達(dá)明顯增加；CH+V組的Bax、活化Caspase-9和活化Caspase-3水平明顯高于Sham組，而CH+Cur組Bax、活化Caspase-9和活化Caspase-3的表達(dá)明顯低于CH+V組。詳見圖5。

圖5 姜黃素對腦出血后Bcl-2/Bax/Caspase信號通路活性的影響

2.5 姜黃素對腦出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 采用活化Caspase-3或TUNEL/Neun染色方法檢測腦出血后72 h神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，與Sham組相比，腦出血誘導(dǎo)的Caspase-3和TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增加。然而，與CH+V組相比，姜黃素能明顯減少活化Caspase-3和TUNEL陽性神經(jīng)元的數(shù)量。詳見圖6。

圖6 姜黃素對腦出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素(<300 mmol/L)對原代皮層神經(jīng)元的細(xì)胞活力沒有影響，提示姜黃素對神經(jīng)元沒有毒性。有報(bào)道表明，血腫溶解液誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是一種模擬蛛網(wǎng)膜下腔出血臨床病理生理過程的體外模型，在該體外模型中，血腫溶解液誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡是一種劑量依賴的方式[9]，與本研究一致。本研究發(fā)現(xiàn)血腫溶解液可導(dǎo)致皮層神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。膠原酶誘導(dǎo)的腦出血大鼠模型能夠復(fù)制人腦出血模型中觀察到的病理反應(yīng)，利用膠原酶消化血管膠原，并導(dǎo)致出血進(jìn)入周圍腦組織[10]。在實(shí)驗(yàn)性的腦出血大鼠模型中，血腫周圍腦水腫在24～72 h達(dá)到高峰。本研究結(jié)果也顯示，腦出血后72 h，同側(cè)皮質(zhì)的腦含水量明顯增加，而姜黃素減輕了腦出血引起的血腫周圍腦水腫，這一點(diǎn)得到了以往報(bào)道的支持。

氧化應(yīng)激是腦出血后繼發(fā)性腦損傷的重要因素，ROS的產(chǎn)生導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的損傷[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可明顯降低腦出血后72 h升高的ROS水平，也可降低腦出血后72 h由腦出血引起的脂質(zhì)(MDA)、蛋白質(zhì)(3-硝基酪氨酸)和核酸(8-OHDG)氧化損傷標(biāo)志物的增加。Keap1/Nrf2信號通路在腦出血后腦組織的氧化損傷保護(hù)中起著至關(guān)重要的作用。姜黃素可通過上調(diào)多種抗氧化酶的表達(dá)來對抗腦出血誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。有研究表明，在腦出血損傷狀態(tài)下Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)升高可發(fā)揮對機(jī)體的自我保護(hù)機(jī)制，減輕腦出血損傷[12]。本研究中，CH+V組Nrf2、HO-1表達(dá)水平明顯升高，而姜黃素治療后Nrf2、HO-1表達(dá)明顯上調(diào)，說明姜黃素可能加強(qiáng)了這種保護(hù)作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)姜黃素明顯提高了SOD和GSH-Px的活性，提示姜黃素具有拮抗腦出血誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的作用。

盡管凋亡過程的詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚，但是已經(jīng)確定Caspase在凋亡執(zhí)行過程中起著至關(guān)重要的作用，而且細(xì)胞凋亡的過程實(shí)際上是Caspase被活化并發(fā)生凋亡蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)[13]。Caspase家族蛋白存在于胞漿中，其同源性很高，結(jié)構(gòu)相似，均含有一個半胱氨酸激活位點(diǎn)，特異性地?cái)嚅_天冬氨酸殘基后的肽鍵，目前被發(fā)現(xiàn)的Caspases有14種，參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，還參與細(xì)胞的生長、分化、增殖和運(yùn)動[14]。同時，Caspase依賴性程序性死亡在腦出血氧化應(yīng)激導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜損傷、線粒體通透性轉(zhuǎn)變中起關(guān)鍵作用，這一過程受Bcl-2/Bax相對比例的調(diào)控[15]。隨后，凋亡誘導(dǎo)因子從線粒體釋放到胞漿，進(jìn)而激活Caspasse-9和Caspase-3。本實(shí)驗(yàn)中，姜黃素在腦出血后72 h增加了Bcl-2的表達(dá)，而降低了Bax的表達(dá)及Caspase-9和Caspase-3的活性，也減少了活躍的Caspase-3和TUNEL陽性神經(jīng)元的數(shù)量。這表明姜黃素對腦出血相關(guān)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用。

綜上所述，姜黃素可以減輕腦出血后繼發(fā)性腦損傷的氧化應(yīng)激和神經(jīng)細(xì)胞凋亡。