靳豐璐，陳利青，張晉麗，王俊杰，李紅英，韓淵懷，張彬

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801）

糜子（Panicum miliaceumL.）為一年生禾本科黍?qū)僦参铮俏鞅钡貐^(qū)重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物［1］。作為起源于中國最古老的農(nóng)作物之一，糜子具有耐旱、耐瘠和生育期短等優(yōu)點(diǎn)，有穩(wěn)定的生產(chǎn)力和良好的經(jīng)濟(jì)效益，在旱作農(nóng)業(yè)和抗災(zāi)救災(zāi)中具有不可替代的作用［2］。糜子脫殼后稱黍米，富含多種營養(yǎng)元素，食用價(jià)值高，還具有較高藥用價(jià)值，可以預(yù)防癌癥、心臟病和糖尿病等疾?。?］。作為典型的高光合C4作物，糜子更適應(yīng)干旱的環(huán)境，是干旱半干旱地區(qū)的優(yōu)質(zhì)主糧替代作物之一［4］，因此，篩選并培育優(yōu)質(zhì)糜子品種已逐漸進(jìn)入科學(xué)家的視野。

變異是生物進(jìn)化的重要推動力，突變體可以為基因功能的研究提供材料［5］。植物變異包括自然變異和人工誘變2 大類。自然誘變的發(fā)生頻率極低，人工理化誘變是目前種質(zhì)資源創(chuàng)新的常用方法［6］。其中，甲基磺酸乙酯（EMS）化學(xué)誘變因其價(jià)格低廉、操作簡單、誘變率高、染色體畸變少和突變穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于谷子［7］、高粱［8］及小麥［9］等多種作物的誘變育種中，并取得顯著成效。

葉色突變是植物界發(fā)生頻率較高、變異來源廣泛、表型直觀明顯的性狀突變，葉色突變表現(xiàn)形式多樣，常表現(xiàn)在葉片顏色的變化，如白化、黃化、黃綠、條紋等類型［10］，其中葉片黃化最常見。植物葉色黃化突變體又稱葉綠素缺乏突變體，通常因葉綠素的合成或降解途徑被破壞造成［11］，目前已在水稻［12］、番茄［13］和油菜［14］等作物中發(fā)現(xiàn)了黃化突變體。葉片是植物光合作用中重要的組織器官，葉片中葉綠素含量一定程度上決定了植物的光合效率。葉色突變基因可以直接或間接影響葉綠素合成或降解途徑，不同程度的降低葉綠素含量，從而影響植物的光合作用，進(jìn)而使植物發(fā)育減緩、長勢減弱，最終造成植株減產(chǎn)甚至死亡［12］。葉色突變與光合色素變化有直接關(guān)系。多數(shù)研究表明，葉色突變會導(dǎo)致葉綠素和類胡蘿卜素含量降低，總?cè)~綠素含量下降［15］。光合色素代謝中酶的活性變化會影響光合色素合成，人們在葉綠素合成代謝方面進(jìn)行了更深層次的探索。葉綠素前體物質(zhì)是葉綠素合成過程的中間產(chǎn)物。高等植物葉綠素的合成共需15 步，其中任何一步受阻都會影響葉綠素含量［16］。在水稻黃化突變體W1中，膽色素原到尿卟啉原Ⅲ過程受阻，阻礙了葉綠素的合成［17］。根據(jù)光調(diào)控突變體發(fā)育可以將其分為依賴光誘導(dǎo)型和非依賴光誘導(dǎo)型［18］。光是光合作用的能量來源，光照強(qiáng)度是決定光合速率的關(guān)鍵因素之一。光照強(qiáng)度較弱時(shí)，隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)，植物的生長加快；光照強(qiáng)度較強(qiáng)時(shí)，隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)，植物的生長受到抑制。光照強(qiáng)度強(qiáng)弱都會影響葉綠素的合成，而光照過強(qiáng)可能導(dǎo)致光抑制和光氧化［19］。缺乏葉綠素時(shí)，光照過強(qiáng)對植物影響更大。

本研究選用野生型“伊選大紅糜”和對其進(jìn)行EMS 化學(xué)誘變得到的黃化突變體為試驗(yàn)材料，對不同光照條件下糜子苗期的農(nóng)藝性狀、光合色素以及葉綠素前體物質(zhì)進(jìn)行比較分析，探究糜子黃化突變體與野生型糜子的差異，旨在為糜子葉片葉綠素的合成研究提供參考，從生理生化水平明確突變體葉片的黃化機(jī)制，加快篩選優(yōu)質(zhì)糜子種質(zhì)資源。

1 材料和方法

1. 1 試驗(yàn)材料

野生型“伊選大紅糜”YX?0和黃化突變體YX?yl，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程研究所提供，黃化突變體YX?yl為野生型“伊選大紅糜”經(jīng)甲基磺酸乙酯誘變，連續(xù)自交多代穩(wěn)定遺傳而來。

1. 2 試驗(yàn)方法

以野生型“伊選大紅糜”YX?0為對照組，黃化突變體YX?yl為試驗(yàn)組，種植于育苗盤中。每個(gè)育苗盤野生型和突變體材料各一半，共種植9 盆。植株出苗時(shí)，將育苗盤轉(zhuǎn)移到不同光照強(qiáng)度（9 600、12 000、14 400 lx）的人工氣候培養(yǎng)箱中。待植株到苗期時(shí)進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查，測定光合色素含量和葉綠素前體物質(zhì)含量。

1. 2. 1 農(nóng)藝性狀調(diào)查

以野生型“伊選大紅糜”為對照材料，對黃化突變體的生長變異進(jìn)行田間觀察。出苗后14 d，分別選取各材料不同處理下長勢一致的3 株，游標(biāo)卡尺測量植株高度，軟尺測量葉片長度和葉片寬度。

1. 2. 2 光合色素測定

出苗后14 d，分別在不同光照強(qiáng)度下選取長勢一致的糜子野生型和黃化突變體進(jìn)行取樣，參考乙醇浸提法［20］測定葉片光合色素的含量。取樣時(shí)選擇倒二葉的葉片中部，去掉葉片中脈，稱取0. 1 g，液氮充分研磨后，加入10 mL95% 乙醇，在搖床上充分搖勻至組織變白（注意避光）。光合色素含量測定時(shí)，離心取上清液作提取液，用95% 的乙醇為參照，分別在470、649、665 nm 波長下測定對應(yīng)葉綠素提取液的吸光值。 計(jì)算葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）、總?cè)~綠素（Chl）、類胡蘿卜素（Caro）的含量及葉綠素a/b 的值。每組設(shè)置3 個(gè)生物重復(fù)，每份提取液測定3 次作技術(shù)重復(fù)，下同。

1. 2. 3 葉綠素前體物質(zhì)的測定

出苗后14 d，分別選取不同光照處理下長勢一致的糜子野生型和黃化突變體，取倒二葉測定葉綠素前體物質(zhì)。具體的測定方法如下。

（1） 膽色素原（PBG）的測定

參考Bogorad 等的方法［21］，避開葉脈稱取0. 5 g葉片，液氮充分研磨后加入5 mL 提取緩沖液（0. 1 mol·L-1EDTA，0. 6 mol·L-1Tris，鹽酸調(diào)節(jié)pH 至8. 2）。離心后取2 mL 上清液與2 mL Ehrlich-Hg 顯色液混合，黑暗條件下反應(yīng)15 min。以提取緩沖液為參比，在553 nm 波長下測定樣品的吸光值。PBG的含量以553 nm 的摩爾消光系數(shù)6. 1×104L·mol-1·cm-1計(jì)算。

A（PBG）=εCL（A：吸光值；ε：摩爾消光系數(shù)；C：摩爾濃度；L：測試液液層厚度）

（2） 5-氨基酮戊酸（ALA）的測定

參考Dei 等的方法［22］，避開葉脈稱取1 g 葉片，液氮充分研磨后加入三氯乙酸，定容至20 mL。離心后取5 mL 上清液，加入2. 35 mL 醋酸鈉（1 mol·L-1）和0. 15 mL 乙酰丙酮混合液。 沸水浴加熱10 min，冷卻至室溫，取2 mL 液體與2 mL Ehrlich-Hg顯色液混合，黑暗條件下反應(yīng)15 min。以三氯乙酸為參比，在553 nm 波長下測定樣品的吸光值。ALA 的含量以553 nm 的摩爾消光系數(shù)7. 2×104L·mol-1·cm-1計(jì)算。

A（ALA）=εCL（A：吸光值；ε：摩爾消光系數(shù)；C：摩爾濃度；L：測試液液層厚度）

（3） 原卟啉Ⅸ（Proto Ⅸ）、鎂原卟啉（Mg-Pro?to Ⅸ）和原脫植基葉綠素（Pchlide）的測定

參考Hodgins 等的方法［23］，避開葉脈稱取0. 5 g葉片，加入5 mL 80% 堿性丙酮于冰上充分研磨。離心后取3 mL 上清液加入80% 堿性丙酮，定容至25 mL。以80% 堿性丙酮為參比，分別在575、590、628 nm 波長下測定樣品的吸光值。Proto Ⅸ、Mg-Proto Ⅸ和Pchlide 濃度的計(jì)算公式如下：

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均使用Microsoft Excel 和SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖，并對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）、Duncan 檢驗(yàn)和Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同光照強(qiáng)度下野生型和黃化突變體幼苗農(nóng)藝性狀的分析

同一光照強(qiáng)度下，與野生型相比，黃化突變體幼苗葉片顏色明顯變黃，葉長葉寬變窄，植株矮小，生長發(fā)育受到一定程度的抑制（圖1）。 對出苗后14 d 的野生型和黃化突變體糜子農(nóng)藝性狀測量表明（表1），同一光照強(qiáng)度下突變體YX?yl的株高顯著低于野生型YX ? 0。 當(dāng)光照強(qiáng)度為12 000 lx 和14 400 lx 時(shí)，突變體YX?yl的葉長顯著高于9 600 lx光照條件下的葉長，而突變體YX?yl的葉寬顯著變窄。這說明，與野生型相比，黃化突變體苗期的生長發(fā)育受到抑制，適當(dāng)增加光照強(qiáng)度，可以促進(jìn)黃化突變體的生長。

表1 不同光照強(qiáng)度農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of agronomic traits under different illumination intensities

圖1 野生型和突變體糜子表型比較（左：野生型；右：黃化突變體）Fig.1 Comparison of phenotype between wild type YX?0 and mutant YX?yl（left：wild type YX?0；right：mutant YX?yl）

2. 2 不同光照強(qiáng)度下野生型糜子和黃化突變體幼苗葉片光合色素含量的分析

谷子葉片光合色素的含量直接影響葉片顏色［15］，對出苗后14 d 的野生型和黃化突變體糜子的葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，同一光照強(qiáng)度下，突變體YX?yl葉片中的葉綠素a 含量顯著低于野生型YX?0（圖2A）。 在9 600、12 000、14 400 lx 光照強(qiáng)度下，突變體YX?y1葉片中葉綠素a 的含量分別比野生型YX?0減少了20. 7%、18. 8% 和24. 5%，推測葉綠素a 含量的減少是黃化突變體葉色變化的原因之一。不同光照強(qiáng)度下葉綠素b 含量分析結(jié)果表明，在同一光照強(qiáng)度下，突變體YX ? yl葉片中葉綠素b 的含量均低于野生型YX?0。在9 600、12 000、14 400 lx 光照強(qiáng)度下，突變體YX ? yl葉片中葉綠素b 的含量分別比野生型YX?0減少了37. 3%、30. 1% 和32. 3%，差異不顯著，但葉綠素b 含量的降低幅度更大，推測葉綠素b含量的減少對黃化突變體葉色變化的影響更大。葉綠素a/b 可以反映植物對光能利用的多少［24］，分析結(jié)果表明（圖2B），同一光照強(qiáng)度下，野生型YX?0和突變體YX?yl的葉綠素a/b 值均無顯著差異。在9 600、12 000、14400 lx 光照強(qiáng)度下，突變體YX?yl的葉綠素a/b 分別比野生型YX ?0增加了9. 5%、17. 1% 和11. 4%，黃化突變體葉綠素b 的下降幅度大于葉綠素a。

光保護(hù)色素類胡蘿卜素可以保護(hù)葉綠素免受氧自由基的破壞［25］。野生型和黃化突變體糜子出苗后14 d 的類胡蘿卜素含量檢測結(jié)果顯示（圖2C），同一光照強(qiáng)度下，突變體YX?yl葉片中類胡蘿卜素含量均低于野生型YX?0，在12 000、14400 lx 光照強(qiáng)度下顯著降低。與野生型YX ?0相比，9 600、12 000、14 400 lx 光照強(qiáng)度下，突變體YX?y1葉片類胡蘿卜素的含量分別比野生型YX ? 0減少了20. 0%、14. 2% 和23. 7%。結(jié)果說明，黃化突變體中類胡蘿卜素的降低也是其葉色變化的原因之一。黃化突變體可能是一個(gè)總?cè)~綠素缺乏突變體，其中葉綠素b 的降幅變化更大。

圖2 不同光照下突變體YX?yl 與野生型YX?0 幼苗葉片光合色素比較Fig.2 Comparison of photosynthetic pigments in seedlings between mutant YX ? yl and wild type YX ? 0 under different illumination conditions

類胡蘿卜素和葉綠素b 可以吸收光能并傳遞給葉綠素a，促進(jìn)光能轉(zhuǎn)化為有機(jī)物［25］。對野生型和黃化突變體糜子不同光照強(qiáng)度下的類胡蘿卜素含量與葉綠素含量進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，以12 000 lx 為對照，當(dāng)光照強(qiáng)度增加或減弱時(shí)，野生型YX?0和突變體YX?yl的葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量均降低，且存在顯著差異。光照強(qiáng)度減弱時(shí)，相較于野生型YX?0，突變體YX?yl的類胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b 含量的變化幅度更大。 其中，野生型YX?0的葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量分別下降了10. 0%、9. 5% 和7. 9%，突變體YX?yl的葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量分別下降了11. 7%、17. 3% 和16. 1%。由此，我們推測黃化突變體對光照強(qiáng)度的敏感性高于野生型，光合色素的合成受損促進(jìn)了植株幼苗葉片的黃化。

2. 3 不同光照強(qiáng)度下野生型糜子和黃化突變體幼苗葉片葉綠體前體物質(zhì)的分析

對出苗后14 d 幾個(gè)關(guān)鍵葉綠素前體物質(zhì)（ALA、PBG、Mg-Proto Ⅸ、Proto Ⅸ和Pchlide）含量的測定結(jié)果表明（圖3～圖5），在同一光照強(qiáng)度下，突變體YX?yl葉片的ALA、Mg-Proto Ⅸ、Proto Ⅸ和Pchlide 含量與野生型均有顯著差異，而PBG 含量無顯著差異。因此推測，黃化突變體葉綠素含量的減少不是某一特定中間產(chǎn)物合成受阻引起的，是整個(gè)葉綠素生物合成階段合成能力降低導(dǎo)致的。

2. 3. 1 ALA 含量的測定

不同光照強(qiáng)度下，野生型YX?0和突變體YX?yl的ALA 含量均有顯著差異（圖3）。以12 000 lx 為對照，光照強(qiáng)度增加到14 400 lx 時(shí)，野生型YX?0和突變體YX?yl的ALA 含量分別減少了63. 3% 和16. 9%；光照強(qiáng)度減弱到9 600 lx 時(shí)，野生型YX?0的ALA 含量減少了60. 6%，而突變體YX ? yl的ALA 含量增加了23. 5%。這說明，光照強(qiáng)度較弱時(shí)有利于突變體YX?ylALA 合成能力的增強(qiáng)。

圖3 不同光照下突變體YX?yl 與野生型YX?0 幼苗葉片ALA 含量比較Fig.3 Comparison of ALA contents in seedlings between mutant YX?yl and wild type YX?0 under different il?lumination conditions

2. 3. 2 幼苗葉片PBG 含量的測定

不同光照強(qiáng)度下，野生型YX?0和突變體YX?yl的PBG 含量均差異顯著（圖4）。以12 000 lx 為對照，光照強(qiáng)度增加到14 400 lx 時(shí)，野生型YX?0和突變體YX?yl的PBG 含量均顯著降低；而光照強(qiáng)度減弱到9 600 lx 時(shí)，野生型YX?0和突變體YX?yl的PBG 含量均顯著增加?？梢姽庹諒?qiáng)度較弱時(shí)，野生型YX ? 0和突變體YX ? yl的PBG 合成能力均有提高。

圖4 不同光照下突變體YX?yl 與野生型YX?0 幼苗葉片PBG 含量比較Fig.4 Comparison of PBG contents in seedlings between mutant YX?yl and wild type YX?0 under different il?lumination conditions

2. 3. 3 幼苗葉片Mg?Proto Ⅸ、Proto Ⅸ和Pchlide含量的測定

以12 000 lx 為對照，光照強(qiáng)度減弱時(shí)，野生型YX?0和突變體YX?yl的Mg-Proto Ⅸ、Proto Ⅸ和Pchlide 含量均顯著增加；而光照強(qiáng)度增加時(shí)，野生型YX?0和突變體YX?yl的Mg-Proto Ⅸ、Proto Ⅸ和Pchlide 含量無顯著差異（圖5）。在光照強(qiáng)度為9 600 lx 時(shí)，突變體YX?yl的Mg-Proto Ⅸ、Proto Ⅸ和Pchlide 含量均顯著高于野生型YX?0，隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)，兩者M(jìn)g-Proto Ⅸ、Proto Ⅸ和Pchlide含量的差異逐漸減小。不難看出，光照強(qiáng)度的增強(qiáng)可以促進(jìn)突變體YX ?ylMg-Proto Ⅸ、Proto Ⅸ和Pchlide 的合成，同時(shí)縮小二者間的合成差異。

圖5 不同光照下突變體YX?yl 與野生型YX?0 幼苗葉片Mg-Proto Ⅸ，Proto Ⅸ和Pchlide 含量比較Fig.5 Comparison of Mg-Proto Ⅸ，Proto Ⅸand Pchlide contents in seedlings between mutant YX?yl and wild type YX?0 under different illu?mination conditions

3 討論

EMS 是一種高效穩(wěn)定的化學(xué)誘變劑，利用EMS 誘變獲得突變體是植物育種中的一種重要方法［26］。近年來，葉色突變體逐漸受到研究學(xué)者的關(guān)注，已成為研究高等植物葉綠素生物合成降解途徑、葉綠體發(fā)育、核質(zhì)基因互作及光合作用分子機(jī)制等的一種寶貴資源。葉色突變體相關(guān)機(jī)制的研究能夠提高對植物光合作用的認(rèn)知和利用水平，不僅有利于揭示葉綠素的代謝機(jī)理，也為篩選和培育高光效種質(zhì)資源奠定了基礎(chǔ)［8］。同時(shí)，葉色突變還可以作為標(biāo)記輔助育種，在雜交育種和良種繁育中發(fā)揮關(guān)鍵作用［26］。葉片黃化是葉色突變的常見類型，多出現(xiàn)在苗期，通過影響植物的光合作用，導(dǎo)致其生長發(fā)育遲緩和產(chǎn)量減少［27］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在同一光照強(qiáng)度下，突變體YX?yl較野生型YX?0的長勢較差，表明黃化突變體的生長受到了抑制。適當(dāng)降低光照強(qiáng)度，野生型YX?0和突變體YX?yl的農(nóng)藝性狀差別不大，由此推測，較弱的光照強(qiáng)度可能會削弱黃化突變體對生長發(fā)育的抑制作用。

葉色突變體是研究葉綠素生物合成相關(guān)途徑的優(yōu)良材料，其中葉綠素含量和葉綠體結(jié)構(gòu)是其表型發(fā)生變化的主要原因［28］。葉片黃化突變體和葉綠素的含量有直接關(guān)系。大量研究表明，與野生型相比，葉色黃化突變體中葉綠素的含量顯著降低，不同突變體間葉綠素a和葉綠素b含量的降低幅度不同，通常黃化突變體植株中葉綠素a與葉綠素b含量的比值高于野生型。例如，董遵等人［29］發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜中葉綠素含量表現(xiàn)為黃葉＜黃綠葉＜綠葉，而葉綠素a 與葉綠素b 含量的比值表現(xiàn)為黃葉＞黃綠葉＞綠葉。此外，作為輔助捕光色素，類胡蘿卜素能夠擴(kuò)大吸收光的范圍，傳遞光能，還能清除葉綠體中的氧自由基，起到光保護(hù)作用［25］，因此，葉綠體內(nèi)的類胡蘿卜素代謝也可以影響葉綠素含量的變化。綜上，植株體內(nèi)葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素等光合色素的含量異常均可能導(dǎo)致其葉色發(fā)生改變。

本研究中，突變體YX?yl表現(xiàn)為黃葉表型，同一光照強(qiáng)度下葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量均降低。糜子黃化突變體植株的葉綠素含量顯著低于野生型植株，這與多數(shù)植物的黃化突變體研究結(jié)果類似［28］。葉綠素的含量與突變體葉色的表型相一致。且本試驗(yàn)中突變體YX?yl的葉綠素b含量下降幅度均高于同一光照強(qiáng)度下葉綠素a含量的下降幅度，而對照的野生型YX?0植株葉綠素a/b均小于突變體YX?yl，這與水稻yg11突變體葉綠素a生物合成部分阻斷，導(dǎo)致總?cè)~綠素積累減少，且葉綠素a 和葉綠素b 的比值增加的情況相同［29］。本試驗(yàn)結(jié)果說明，在引起突變體苗期葉片黃化表型變化的光合色素中，葉綠素b 的降幅變化更大。

葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要場所，作為光合作用中重要的色素分子，不同的光照強(qiáng)度都會影響葉綠素的生物合成［30］。光照是影響植物葉綠素合成和葉綠體發(fā)育的重要環(huán)境因子之一，光照不足會導(dǎo)致酶活性發(fā)生變化，進(jìn)而影響葉綠素的生物合成；光照過強(qiáng)會導(dǎo)致葉綠素合成受阻或葉綠素溶解，甚至對植物產(chǎn)生光氧化和光抑制［19］。 研究發(fā)現(xiàn)，黑暗或長期遮光可以限制植物的光合碳同化力和光合作用關(guān)鍵酶的活力，導(dǎo)致葉綠素的合成減少，最終引起葉片褪綠［31］。同時(shí)，李漢生等人［32］發(fā)現(xiàn)鎂離子螯合酶在光照后活性增強(qiáng)，植物的葉綠素合成增加。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苗期突變體YX?yl更易受低光強(qiáng)影響，光合色素含量顯著降低，葉片黃化現(xiàn)象加劇；隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)，野生型YX?0和突變體YX?yl的光合色素含量無顯著差異，表明苗期黃化突變體對光照的敏感度更高，且光照強(qiáng)度的增強(qiáng)有利于黃化突變體中葉綠素的生物合成。

葉綠素生物合成途徑受阻是葉色黃化突變體中葉綠素含量降低的主要原因［33］。高等植物葉綠素的生物合成是多種酶共同參與催化的復(fù)雜過程。即由葉綠素前體物質(zhì)L-谷氨酰-tRNA 合成ALA，隨后縮合成PBG，經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)生成具有卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)的Proto Ⅸ，再與鎂結(jié)合成Mg-Proto Ⅸ，通過甲基化、環(huán)化、光還原和酯化等步驟，最終合成葉綠素a 和葉綠素b 的生化過程［34］。其中，任意一步受阻或發(fā)生突變都可能影響葉綠素的合成，導(dǎo)致葉片失綠黃化［33］。葉綠體前體物質(zhì)的分析有利于確定葉綠體生物合成中的代謝異常，當(dāng)合成葉綠素的某一過程受抑制時(shí)，受阻位點(diǎn)前的前體物質(zhì)將顯著積累，而受阻位點(diǎn)后的前體物質(zhì)將顯著減少。擬南芥gun5突變體中Proto Ⅸ向Mg-Proto Ⅸ轉(zhuǎn)化的過程被阻斷，導(dǎo)致葉綠素的生物合成受到抑制，葉綠素合成減少［35］。番茄黃化突變體中ALA、PBG、Urogen Ⅲ、Coprogen Ⅲ、Mg-Proto Ⅸ、Proto Ⅸ和Pchlide 的含量均顯著低于野生型，說明葉綠素整個(gè)合成途徑的合成能力降低會降低突變體中的葉綠素含量。隨后又發(fā)現(xiàn)后面4 種前體物質(zhì)的降低幅度較大，分析發(fā)現(xiàn)可能是Coprogen Ⅲ（糞卟啉原Ⅲ）的合成水平受影響最大導(dǎo)致的，推斷Coprogen Ⅲ的合成受阻可能是黃化突變體中葉綠素含量下降的主要原因［15］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苗期突變體YX?yl的幾種關(guān)鍵葉綠素前體物質(zhì)ALA、Mg-Proto Ⅸ、Proto Ⅸ和Pchlide 的含量與野生型YX?0相比有顯著差異。在12 000 lx 時(shí)，突變體YX?ylALA 含量顯著低于野生型YX?0。ALA 的合成是葉綠素合成的關(guān)鍵步驟，控制ALA 合成的酶是葉綠素生物合成中的限速酶，ALA 的合成決定了葉綠素合成的總量［36］。據(jù)研究結(jié)果推測，ALA 合成的減少可能是導(dǎo)致葉綠素合成總量降低，造成葉片黃化的主要原因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，光照強(qiáng)度的增強(qiáng)有利于突變體YX?ylMg-Proto Ⅸ、Proto Ⅸ和Pchlided 的生物合成，這是由于在葉綠素合成中Proto Ⅸ向Pchlide 轉(zhuǎn)化時(shí)，需要借助原葉綠素酯氧還酶利用光能驅(qū)動NADPH 還原D環(huán)的雙鍵，促使葉綠素E 環(huán)形成，因此合成原葉綠素酯的這一步驟會受到光照強(qiáng)度的影響。光照強(qiáng)度的增強(qiáng)可以促進(jìn)后續(xù)反應(yīng)進(jìn)行，進(jìn)而縮小突變體YX?yl和野生型YX?0Proto Ⅸ、Mg-Proto Ⅸ和Pch?lide 含量之間的差異。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對苗期的野生型和葉片黃化突變體糜子不同光照強(qiáng)度下的農(nóng)藝性狀、光合色素含量和關(guān)鍵葉綠素前體物質(zhì)含量的變化進(jìn)行對比和分析，發(fā)現(xiàn)突變體葉片黃化可能是葉綠素整個(gè)合成途徑合成能力降低，在膽色素原與原卟啉轉(zhuǎn)化階段受阻，造成黃化突變體中葉綠素含量降低導(dǎo)致的。而適當(dāng)?shù)脑鰪?qiáng)光照強(qiáng)度，可能提高突變體YX?yl中葉綠素前體物質(zhì)Mg-Proto Ⅸ、Proto Ⅸ和Pchlided 的合成，從而減緩葉綠素合成通路受阻，促進(jìn)葉綠素和類胡蘿卜素的積累，有助于突變體的生長。