李珊，劉永琪，朱垠豪，葛星辰，段明，韓淵懷，3，馬芳芳，3*

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 太谷 030801；2. 山西農(nóng)業(yè)大學 實驗教學中心，山西 太谷 030801；3. 雜糧種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種山西省重點實驗室，山西 太谷 030801）

谷子（Setaria italica（L.）Beauv.）為禾本科狗尾草屬的一種重要的雜糧作物，在距今6 000～7 000 年前的新石器時代中早期完成馴化，成為農(nóng)耕文化的主栽作物，廣泛種植于亞洲與歐洲溫帶和熱帶地區(qū)。中國是谷子的原產(chǎn)地，主要栽培在北方的干旱半干旱地區(qū)和鹽堿地地區(qū)，常年的播種面積約133. 3 萬hm2左右［1］。谷子對干旱及其他不良環(huán)境的耐受性和適應(yīng)性較強，同時小米富含蛋白質(zhì)、礦質(zhì)營養(yǎng)元素、維生素、類胡蘿卜素、葉酸等營養(yǎng)物質(zhì)且不含麩質(zhì)，對于患有動脈硬化、糖尿病和心臟病的人來說是很好的飲食選擇［2，3］。轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF），也被稱為反式作用因子。現(xiàn)如今抗逆基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在植物響應(yīng)逆境脅迫的研究報道已經(jīng)非常普遍，轉(zhuǎn)錄因子可以單獨或者與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用于逆境響應(yīng)靶基因啟動子區(qū)域中的啟動子元件，與之結(jié)合從而激活或者抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄，進而提高植物對逆境脅迫的耐性與抗性，促進植物在生長發(fā)育、形態(tài)建成過程中逐漸形成抵抗逆境的各種應(yīng)答體系［4］。

ZF-HD（Zinc Finger Homeodomain）轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，它的顯著特征是包含一個鋅指結(jié)構(gòu)域（zinc fingre，ZF）和一個同源異形盒結(jié)構(gòu)域（homeodomain，HD），也是由此命名。生物體中都存在同源異形基因，參與調(diào)節(jié)它們的生長發(fā)育、形態(tài)建成以及對逆境的抗性和耐受性，最早于1984 年在果蠅中發(fā)現(xiàn)［5］。所有同源異形基因都有一個由180 個堿基的核酸序列組成的同源異形框（homeobox），這個區(qū)域非常穩(wěn)定，可以轉(zhuǎn)錄翻譯折疊形成一個60 個氨基酸組成的高度保守的三螺旋結(jié)構(gòu)域，稱為同源異形盒結(jié)構(gòu)域，能夠與特定的DNA 序列相互作用［6］。根據(jù)HD 蛋白氨基酸序列之間的相似程度將其分為7 個不同的亞家族，分別為：ATHB8、GL2、ZM-HOX、HAT1、HAT2、KNOX 和BEL。 之后在水稻中共鑒定出107 個HD 蛋白基因，并將其細分為10 個亞家族，分別為ZF-HD、HD-Zip I-IV（Homeodomain-leucine zip?per）、PHD（Homeodomain-finger）、KNOX I-II（Knottedl-like homeobox），WOX（Wuschel-relat?ed homeobox）和BLH 家族［7］。鋅指結(jié)構(gòu)是一種存在于可以調(diào)控基因表達的DNA 結(jié)合蛋白中的結(jié)構(gòu)，它的典型特征是可以通過兩對保守的半胱氨酸和/或組氨酸殘基與Zn2+結(jié)合自我盤曲折疊形成穩(wěn)定的獨特的“手指”狀的多肽空間構(gòu)型［8，9］。鋅指蛋白最初在非洲爪蟾的卵母細胞中發(fā)現(xiàn)［10］，Shi等通過鋅指蛋白中組氨酸（His）與半胱氨酸（Cys）殘基位置與數(shù)目的不同將其分為C2H2、C2HC、C6、C2HC5、C3HC4、C4HC3、C4、C3H 等多種類型，其中C2H2類型是鋅指蛋白在生物體中存在的主要類型［11］。

目前國內(nèi)外許多研究證明ZF-HD 轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、開花和抵抗外界不良環(huán)境時發(fā)揮著重要作用。已有研究表明在擬南芥中共有17個ZF?HD基因家族成員，它們作為轉(zhuǎn)錄因子，具有獨特的生理特性，其中13 個成員在擬南芥花器官發(fā)育階段的表達量顯著升高［11］；脅迫誘導ZHD1和NAC 轉(zhuǎn)錄因子的共表達增強了擬南芥ERD1基因的表達，從而提高擬南芥的抗逆性［12，13］。在水稻中鑒定出7 種與OsDREB1B基因啟動子結(jié)合的鋅指TFs，這些TFs 與啟動子結(jié)合并相互作用抑制OsDREB1B的表達，參與對不同非生物脅迫的反應(yīng)，并在抵抗生物脅迫中發(fā)揮作用［14］。此外在葡萄基因組中共鑒定了13 個ZHD基因（VvZHD），這些VvZHD基因表達表現(xiàn)出明顯的時空特異性，并在不同脅迫和激素處理條件下差異表達，表明葡萄VvZHDs可能參與調(diào)控葡萄對各種生物和非生物脅迫的反應(yīng)［15］。茶葉CsZF?HDs在不同非生物脅迫和激素誘導（干旱、低溫、外源SA、MeJA、ABA 和GA3）下差異表達［16］。煙草ZH?HD基因家族中NtZF?HD21基因在干旱處理后被誘導高表達，通過亞細胞定位分析和病毒誘導基因沉默（VIGS）等方法證明了NtZF-HD21 蛋白是一種核蛋白并且NtZF?HD21基因的沉默降低了煙草的抗旱性［17］。通過對玉米中24 個ZF?HD家族基因在干旱、高鹽脅迫處理和ABA 誘導下的表達模式進行分析發(fā)現(xiàn)，基因ZmZHD11和ZmZHD12強烈響應(yīng)這3 種處理，并且在干旱處理和高鹽脅迫下表達量顯著升高，表明這2 個基因在逆境脅迫下通過改變ABA 合成代謝和信號傳導途徑來抵抗逆境［18］。在大白菜中大多數(shù)BraZF?HD基因在開花和長日照處理中高表達，表明BraZF?HD家族基因成員在控制大白菜開花方面可能具有冗余和獨特的功能，此外，這些基因大多在非生物脅迫下被顯著誘導，這意味著它們可能在這些過程中也發(fā)揮重要作用［19］。通過上述的研究表明ZF-HD 轉(zhuǎn)錄因子確實在植物生長發(fā)育、形態(tài)建成過程中遭受逆境時發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

本研究通過利用生物信息學方法對谷子ZFHD 家族蛋白的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域以及家族基因系統(tǒng)進化、基因結(jié)構(gòu)、啟動子、在不同組織及干旱脅迫下的表達模式等進行分析，旨在進一步探索ZF?HD家族基因在谷子的生長發(fā)育、形態(tài)建成以及遭受逆境脅迫時的調(diào)控作用，為進一步提高谷子的抗逆性提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1. 1 數(shù)據(jù)獲取

從Phytozome 數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome. jgi.doe. gov/pz/portal. html）下載谷子（Setaria italicav2. 2）、擬南芥（Arabidopsis thalianaTAIR10）和水稻（Oryza sativav7_JGI）的全基因組序列、CDS序列、蛋白序列。 并從NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/pubmed）下載水稻和擬南芥ZF-HD 家族蛋白序列。

1. 2 谷子ZF?HD 家族基因的鑒定及在染色體上的定位

利用Pfam 數(shù)據(jù)庫（http：//pfam. xfam. org/）下載ZF?HD基因的PF04770 結(jié)構(gòu)域種子數(shù)據(jù)stock?holm 文件。利用HMMER 在線軟件中的hmmsearch 在谷子的總蛋白質(zhì)序列中進行搜索［20］，篩選閾值小于0. 01 的基因為谷子ZF?HD家族基因。 使用Pfam 數(shù)據(jù)庫中Batch search（http：//pfam. xfam. org/search#searchBatchBlock）對HM?MER 得到的候選基因進行驗證。

利用谷子的基因組注釋文件，對鑒定驗證后的ZF?HD家族基因所處染色體條數(shù)，基因長度，在染色體上的起始位點等信息進行提取，利用TB?tools［21］對這些結(jié)果進行可視化，得到基因染色體分布圖。

1. 3 谷子ZF?HD 蛋白的基本信息和理化性質(zhì)分析

利用ExPASY-ProtParam 在線軟件（https：//web. expasy. org/ protparam/）分析統(tǒng)計谷子ZFHD 家族中所有的蛋白序列的氨基酸數(shù)目、等電點和分子量等理化性質(zhì)。

1. 4 谷子與擬南芥、水稻ZF?HD 蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建和基因結(jié)構(gòu)分析

利用MEGA 7. 0［22］軟水件對谷子與擬南芥、水稻中ZF-HD 蛋白序列進行聚類和進化分析，采用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，泊松模型（Poisson Model）計算遺傳距離，步長檢測法（Bootstrp method）檢測建樹的質(zhì)量，檢測次數(shù)為1 000（bootstrap：1 000 replica?tions），其它參數(shù)選擇默認。利用FigTree 軟件對系統(tǒng)發(fā)生樹進行編輯和美化。

利用谷子ZF?HD家族基因的CDS 序列和核酸序列文件，通過GSDS 在線軟件（http：//gsds.cbi. pku. edu. cn/）分析谷子ZF?HD基因核酸序列中外顯子-內(nèi)含子（exon-intron）的分布，繪制基因結(jié)構(gòu)圖。

1. 5 谷子ZF?HD 家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

利用在線軟件MEME［23］（http：//meme-suite.org/tools/meme）對谷子ZF-HD 蛋白氨基酸序列中的保守Motifs 進行預測分析，選擇預測的Motifs的個數(shù)（Select the number of motifs）為8 個，并使用TBtools 工具對谷子ZF-HD 蛋白氨基酸序列上的保守motifs 的數(shù)量、外置進行可視化，對于分析ZF-HD 蛋白序列中發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)域是否缺失，功能是否喪失有一定的作用。

1. 6 谷子ZF?HD 基因啟動子區(qū)域啟動子元件分析

選取谷子ZF?HD基因核酸序列起始密碼子上游1 500 bp 長度的序列作為啟動子區(qū)域，將其輸入到PlantCARE 在線軟件（http：//bioinformatics.psb. ugent. be/webtools/plantcare/html）中得到每個谷子ZF?HD基因啟動子區(qū)域中所有的啟動子元件，篩選出一些重要的響應(yīng)元件，通過TBtools進行可視化分析。

1. 7 谷子與擬南芥、水稻ZF?HD 基因共線性及選擇壓力分析

通過用MCScanX［24］軟件獲取谷子ZF?HD基因與擬南芥、水稻全基因組中的共線性基因，分析查找共線性基因在染色體上的位置。 利用TB?tools 工具展現(xiàn)這些共線性基因間的關(guān)系。 利用Tbtools 中Simple Ka/Ks Calculator（NG）工具計算共線性基因之間的Ka/Ks值，分析谷子ZF?HD基因家族進化過程中受到的選擇壓力作用。

1. 8 谷子ZF?HD 蛋白的亞細胞定位預測

通過PSORT Prediction（http：//psort1. hgc.jp/form. html）對谷子的ZF-HD 蛋白序列進行亞細胞定位預測。

1. 9 ZF?HD 家族基因在谷子不同組織以及干旱脅迫下的表達模式分析

從Phytozome 公共數(shù)據(jù)庫下載ZF?HD家族基因的在谷子根、葉、幼芽、穗不同組織的表達量FP?KM 值，分析ZF?HD家族基因各個組織中的表達差異性和特異性；利用本實驗室已有的谷子田間自然干旱脅迫下不同時間點葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對ZF?HD家族基因在不同抗旱性品種早中晚3 個不同時間點的表達情況進行分析。具體處理為：將干旱敏感品種AN04 和抗旱品種YG1 種植于旱棚，出苗3 周后進行自然干旱處理，對照組土壤含水量始終維持在65% 左右，當干旱處理組大部分谷子葉片有萎蔫狀態(tài)，土壤含水量下降到15%～20% 時，在同天早上8 點（M）、中午12 點（N）和晚上8 點（E）剪取葉片，液氮速凍保存，進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1. 10 實時熒光定量RT?PCR

轉(zhuǎn)錄組測序公司測序返回的RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測RNA 的完整性和濃度。 使用寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司的PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒進行基因組DNA 污染的消除和第一鏈cDNA的合成。 采用2×M5 HiPer Realtime PCR Super mix（SYBRgreen，with anti-Taq）定量試劑盒進行qRT-PCR 分析，β?actin作為內(nèi)參［25］。反應(yīng)體系共10 μL，包括2×Super Mix 5 μL，dd H2O 3. 4 μL，cDNA 1 μL，正向引物以及反向引物各0. 3 μL。qPCR 反應(yīng)條件為95 ℃預變性30 s；95 ℃變性下15 s，60 ℃退火20 s，40 個循環(huán)；65～95 ℃條件下檢測熔點曲線。通過分析cDNA 梯度稀釋的標準曲線獲得每個基因的擴增效率，利用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達水平。由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計并合成引物，引物名稱及序列詳見表1。

表1 qRT?PCR 引物序列Table 1 Primers for qRT?PCR

2 結(jié)果與分析

2. 1 谷子ZF?HD 家族基因鑒定及染色體定位

利用ZF?HD家族基因的HMMER 模型在谷子中篩選并鑒定到16 個ZF?HD家族成員。利用功能注釋文件所獲取谷子ZF?HD家族基因在染色體上的具體位置信息繪制染色體分布圖。從圖1 可以看出，谷子共有9 條染色體，ZF?HD家族成員不均勻的分布在除4 號染色體外的其它8 條染色體上，2 號染色體分布的家族成員最多（4 個）。

圖1 ZF?HD 基因染色體定位Fig.1 Chromosome location of ZF?HD genes in foxtail millet

2. 2 谷子ZF?HD 蛋白基本信息和理化性質(zhì)分析

從表2 中可以看出，谷子ZF-HD 蛋白氨基酸長度在87～719 之間，其中Seita. 8G007100基因編碼的蛋白序列最短，Seita. 9G115100基因編碼的蛋白序列最長；蛋白質(zhì)等電點介于6. 42～9. 15 之間，其中有10 個家族蛋白質(zhì)等電點大于7 呈堿性，6 個家族蛋白質(zhì)的等電點小于7 呈酸性；蛋白質(zhì)分子量在9. 32～76. 18 kDa 之間。

表2 谷子ZF?HD 蛋白的序列特征Table 2 Sequence characteristics of ZF?HD proteins in foxtail millet

2. 3 谷子與擬南芥、水稻ZF-HD 蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建

利用谷子、擬南芥和水稻中分別16、17、15 條ZF-HD 蛋白序列、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，可以進一步確定3 個物種間ZF?HD基因的親緣關(guān)系遠近和進化關(guān)系。圖2 顯示：3 個物種共48 個ZF-HD 氨基酸序列構(gòu)建所得的系統(tǒng)發(fā)生樹可分為6 大類：ZHDⅠ、ZHDⅡ、ZHDⅢ、ZHDⅣ、ZHDⅤ、MIF。進化樹顯示ZHDⅢ亞族中只存在3 個擬南芥ZF-HD家族蛋白成員，沒有谷子和水稻ZF-HD 家族蛋白成員。 進化樹中除了Seita. 7G307300 和Sei?ta. 8G007100、Seita. 2G204400 和Seita. 6G160500、Seita. 2G204500 和Seita. 6G161100、Seita. 2G200300和Seita. 5G273000 屬于旁系同源蛋白，其它ZFHD 家族蛋白均與水稻ZF-HD 家族蛋白聚為分支末端，表明谷子與水稻ZF-HD 蛋白的同源性顯著高于擬南芥。

圖2 谷子、擬南芥、水稻ZF-HD 蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2 Phylogenetic tree of ZF-HD proteins in foxtail millet，Abidopsis and rice

2. 4 谷子ZF?HD 家族基因的基因結(jié)構(gòu)分析

基因結(jié)構(gòu)分析顯示（圖3），16 個谷子ZF?HD基因家族中有87. 5% 的基因不含內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，只有外顯子，基因Seita. 2G204400和Seita. 2G200300的核酸序列中包含內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。

圖3 谷子ZF?HD 基因的基因結(jié)構(gòu)Fig.3 Gene structure of ZF?HD genes in foxtail millet

2. 5 谷子ZF?HD 家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

本試驗對谷子ZF-HD 蛋白序列中8 個Motif進行預測，從圖4 中可以看出谷子ZF-HD 蛋白序列中4 個Motif 保守性較高，保守Motif 1 和Motif 3組成了ZF-HD 轉(zhuǎn)錄因子中富含半肌氨酸和組氨酸二聚化的鋅指結(jié)構(gòu)域，保守Motif 2 和Motif 4，組成了ZF-HD 轉(zhuǎn)錄因子的同源異形結(jié)構(gòu)域。所有ZF-HD 家族蛋白進化樹結(jié)果分成2 大分枝，分枝I 中4 個成員都只含有保守Motif 1 和Motif 3，分枝II 中有10 個ZF-HD 家族蛋白序列都含有Motif 1、2、3 和4，Seita. 2G200300 蛋白序列中缺少保守Motif 1、2、4，Seita. 5G273000 蛋白序列中缺少保守Motif 2。

圖4 谷子ZF-HD 家族蛋白氨基酸序列保守基序Fig.4 Conserved motifs of amino acid sequences of ZF-HD family proteins in foxtail millet

2. 6 谷子ZF?HD 基因啟動子元件分析

利用PlantCARE 在線軟件對谷子ZF?HD家族基因啟動子元件進行分析，篩選保留重要的響應(yīng)啟動子元件，通過TBtools 可視化的結(jié)果如下圖5。谷子16 個ZF?HD基因都含有光照響應(yīng)啟動子元件，同時還存在許多其它豐富的啟動子元件，例如：ABA、MeJA、水楊酸、生長素、赤霉素等激素響應(yīng)元件；低溫誘導、干旱誘導等非生物脅迫響應(yīng)元件，其中9 個谷子ZF?HD基因含有干旱誘導響應(yīng)元件。

圖5 谷子ZF?HD 家族基因啟動子元件Fig.5 Promoter elements of ZF?HD family genes in foxtail millet

2. 7 ZF?HD 基因的共線性分析及選擇壓力分析

谷子16 個ZF?HD家族基因分別、擬南芥、水稻的全基因組進行共線性分析，結(jié)果如圖6 所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)谷子ZF ? HD家族基因只有Sei?ta. 1G290100和Seita. 6G185900分別與擬南芥AT2G18350和AT5G65410存在共線性，有14 個谷子ZF?HD與水稻中13 個ZF?HD基因存在共線性，Seita. 2G200300和Seita. 5G273000在水稻和擬南芥中都不存在共線性基因。谷子ZF?HD基因家族中共鑒定出4 對片段重復基因，沒有串聯(lián)重復現(xiàn)象。為確定是否有選擇壓力作用于谷子ZF?HD家族基因，以擬南芥和水稻ZF?HD基因為參照，估算了進化過程中谷子ZF?HD基因的選擇壓力。通過計算共線性基因選擇壓力值，發(fā)現(xiàn)谷子與水稻共線性基因的進化選擇壓力值都小于1，表明谷子與水稻的共線性基因在進化中經(jīng)歷了純化選擇，谷子ZF?HD家族中所有重復事件基因的Ka/Ks 值也均小于1，說明這些基因均在純化選擇的作用下進化。

圖6 水稻、擬南芥與谷子ZF?HD 基因的染色體共線性關(guān)系Fig.6 Collinear relationship of ZF?HD genes among rice，Arabidopsis and foxtail millet chromosome

2. 7 谷子ZF?HD 蛋白亞細胞定位預測

利用PSORT Prediction 在線軟件對谷子ZFHD 家族蛋白進行亞細胞定位預測，結(jié)果顯示（表4）：有7 個ZF-HD 家族蛋白成員定位在細胞質(zhì)中，5 個成員定位到細胞核，Seita. 2G200300 蛋白定位在質(zhì)膜上，其余蛋白定位在微體（過氧化物酶體）上。

2. 8 谷子ZF?HD 基因的表達模式分析

通過Phytozome 公共數(shù)據(jù)庫，查找并整理出ZF?HD基因家族成員在谷子根、葉、幼芽、穗4 個組織中表達量FPKM 值，利用TBtools 繪制表達熱圖。 組織表達分析結(jié)果顯示（圖7-A）：除了Sei?ta. 2G200300和Seita. 5G273000在谷子各組織中表達量幾乎為零外，其余基因在谷子根、葉、幼芽、穗中或多或少都存在差異表達。 在根中，Sei?ta. 7G307300的表達量最高，Seita. 8G007100次之，其余基因的表達量都較低。Seita. 1G290100和Seita. 2G204400在穗中的表達量最高。 在葉中，Seita. 2G204500的表達量最高，Seita. 6G161100的表達量次之。eita. 2G204500在幼芽中的表達最高，Seita. 2G204400表達量次之。

利用本實驗室已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對田間自然干旱脅迫下，谷子ZF?HD家族基因在不同抗旱性品種（AN04：干旱敏感品種，YG1：抗旱品種）早（M）、中（N）、晚（E）3 個不同時間點的表達情況進行了分析。如圖7-B 所示：16 個ZF?HD家族基因根據(jù)表達情況的不同聚為3 類，分別是在早、中、晚3 個不同時間點高表達和差異表達。 早上Sei?ta. 7G307300和Seita. 1G290100在AN04 對照與自然干旱處理之間差異表達，Seita. 3G098100、Sei?ta. 6G160500、Seita. 7G307300和Seita. 8G007100在YG1 對照與自然干旱處理間差異表達。中午Sei?ta. 7G10200和Seita. 9G115100在YG1 自然干旱處理后表達量顯著升高。 晚上Seita. 8G080800、Seita. 2G204400和Seita. 2G236300在YG1 自然干旱處理后表達量顯著升高，Seita. 2G204500和Sei?ta. 3G134200在自然干旱處理后的AN04 中表達量下降，相反在自然干旱處理后的YG1 中表達量上升。

圖7 谷子ZF?HD家族基因的表達分析Fig.7 Expression analysis of ZF?HD family genes in foxtail millet

本研究從谷子ZF?HD家族基因中挑選了差異表達較為明顯的3 個基因Seita. 2G236300、Sei?ta. 3G098100、Seita. 3G134200進行了qRT-PCR驗證。從圖8 中可以看出，晚上YG1 在干旱脅迫處理后，基因Seita. 2G236300的表達量顯著升高。早上干旱處理后的AN04 中基因Seita. 3G098100表達量較對照升高，而在YG1 中表達量降低；相反晚上干旱處理后的AN04 中基因Seita. 3G134200表達量較對照降低，而在YG1 中表達量升高。同時qRT-PCR 表達模式與RNA-Seq 數(shù)據(jù)集一致，驗證了RNA-seq 數(shù)據(jù)的可靠性，也進一步說明這些基因的表達可能存在晝夜節(jié)律，并且在谷子干旱脅迫響應(yīng)過程中起到重要作用。

圖8 不同處理下3 個ZF?HD 家族基因表達模式的qRT-PCR 分析Fig.8 Relative expression patterns of three ZF?HD family genes under different treatments

3 討論

ZF?HD基因可以調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，增強植物對外界環(huán)境變化的適應(yīng)能力［26］。 研究發(fā)現(xiàn)ZF?HD基因家族只存在于陸生植物中［19］，這類基因可能在陸生植物祖先與單細胞藻類趨異后得到了進化。本研究利用生物信息學分析，在谷子中共鑒定出16 個ZF?HD家族成員，不均勻的分布在除4 號染色體外的其他染色體上。系統(tǒng)進化樹中家族基因聚類結(jié)果與Wei［27］等人對擬南芥ZFHD基因家族所分的亞家族相一致，其中ZHDⅢ亞族中只存在擬南芥ZF-HD 家族蛋白成員，可能是擬南芥進化過程中所產(chǎn)生的一個特有的ZF-HD亞家族。谷子ZF?HD基因家族中Seita. 7G307300和Seita. 8G007100、Seita. 2G204400和Sei?ta. 6G160500、Seita. 2G204500和Seita. 6G16110 0、Seita. 2G200300和Seita. 5G273000屬于旁系同源基因，其他ZF?HD家族基因均與水稻ZF?HD家族基因聚為同一分支末端，屬于直系同源基因。表明谷子與水稻ZF?HD 蛋白的同源性顯然高于擬南芥，親緣關(guān)系更近，并且植物漫長的進化過程中，大部分ZF?HD基因均按照物種特異性的方式進行擴展，該現(xiàn)象在植物其他基因家族的研究中也得到了廣泛驗證［28］。16 個谷子ZF?HD基因家族中有87. 5% 的基因不含內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，與擬南芥［9］、茶樹［16］中ZF?HD家族基因缺乏內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果相一致，這是ZF?HD基因家族的特點。缺乏內(nèi)含子結(jié)構(gòu)使得ZF?HD基因不能進行選擇性剪接，從而使ZF-HD 蛋白高度保守，在進化過程中功能不會發(fā)生太大的變化，比較固定［29］。保守基序分析將ZF-HD 家族蛋白成員分為兩大類，Ⅰ類蛋白缺少Motif2 和Motif4，并且這些基因在進化樹中聚類在MIF 分組中，這與研究發(fā)現(xiàn)的MIF 亞家族中的基因只擁有鋅指結(jié)構(gòu)域但是不具有C 末端的同源域結(jié)構(gòu)域一致［30］。Ⅱ類蛋白中兩個基因蛋白序列中保守Motif 的缺失可能是其在長期進化過程中丟失造成的?；騿幼釉治鲲@示ZF?HD基因家族均含有光照響應(yīng)元件以及豐富的低溫誘導、干旱等非生物脅迫響應(yīng)元件，ABA、水楊酸等激素響應(yīng)元件。 在對番茄［31］，玉米［18］ZF-HD 基因家族啟動子元件分析中同樣發(fā)現(xiàn)許多逆境響應(yīng)元件，并通過非生物脅迫實驗進一步驗證該基因家族中部分基因確實響應(yīng)逆境脅迫，這表明ZF-HD 轉(zhuǎn)錄因子這被賦予響應(yīng)逆境脅迫、調(diào)控內(nèi)源激素的潛在功能，但這些基因在谷子中的具體功能還需要通過試驗進一步驗證?；蚣易宄蓡T間常常發(fā)生基因復制事件，從而使基因功能具有特異性和多樣性，這是推動植物進化的主要動力之一［32，33］谷子中ZF?HD家族基因共鑒定出4對片段重復基因，沒有串聯(lián)重復現(xiàn)象，說明片段重復是谷子ZF?HD家族基因擴增的主要方式。并且重復事件基因的Ka/Ks也值均小于1，說明這些基因均在純化選擇的作用下進化［34］。谷子ZF-HD家族蛋白成員亞細胞定位預測發(fā)現(xiàn)有7個蛋白被預測定位到了細胞質(zhì)中，5個蛋白定位到在細胞核中。

表4谷子ZF?HD家族蛋白亞細胞定位預測Table 4 Prediction of subcellular localization of ZF?HDfamily proteins in foxtail millet

基因表達模式能夠一定程度上反應(yīng)基因功能［35］。已有研究發(fā)現(xiàn)小麥［36］、白菜［19］及擬南芥［11］的ZF?HD基因在花中的表達量很高，陸地棉［37］ZF?HD基因家族大部分在胚珠和纖維中表達，玉米［18］ZF?HD基因家族大部分在雄穗、雌穗和幼胚中高度表達。本研究中ZF?HD家族基因大多在谷子穗和莖中高表達，說明ZF?HD家族基因在不同植物的生長發(fā)育過程的不同部位發(fā)揮著各自獨特的作用。已有報道發(fā)現(xiàn)ZF?HD基因家族響應(yīng)干旱脅迫，例如在擬南芥受到干旱脅迫時ZHD1基因被誘導高表達從而提高擬南芥的抗旱性［12］，煙草ZH?HD基因家族中NtZF?HD21基因的沉默降低了煙草的抗旱性［17］。田間自然干旱脅迫下，谷子ZF?HD家族基因在不同抗旱性品種AN04和YG1早（M）、中（N）、晚（E）3個不同時間點的表達情況分析發(fā)現(xiàn)，不同基因的表達模式存在較大差異，部分基因的表達存在晝夜節(jié)律的變化，且在抗、感品種中對干旱脅迫的響應(yīng)模式也不盡相同，表明ZF?HD家族基因具有組織表達特異性和時空特異性，并參與谷子干旱脅迫應(yīng)答響應(yīng)過程。

4 結(jié)論

本研究共鑒定出16 個谷子ZF-HD 轉(zhuǎn)錄因子家族成員，分布在8 條染色體上，分為5 個亞家族，大部分家族成員無內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，在核外和細胞核中均有分布。谷子ZF?HD基因家族具有明顯的組織表達特異性，并參與谷子干旱脅迫應(yīng)答響應(yīng)過程。本研究將加深我們對ZF?HD基因家族在谷子中轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的了解，為完善谷子抗逆分子機制研究，提高谷子抗逆性提供理論基礎(chǔ)。