郭寧馨，張麗玲，張雅坤，葛星辰，劉永琪，任雪梅，高建華，韓淵懷*

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801）

甘油三酯（Triacylglycerol，TAG）是植物主要的脂質(zhì)儲(chǔ)存形式［1］，也是重要的能量供體［2］。目前在植物中發(fā)現(xiàn)了3 種合成TAG 的途徑。第1 種為最主要的Kennedy 途徑：首先，2 個(gè)脂酰CoA 在甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（Glycerol-3-phosphate acyl?transferase，GPAT）和溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶（Ly?sophosphatidic acid acyltransferase，LPAT）的作用下轉(zhuǎn)移到3-磷酸甘油（3-phosphoglycerate，G3P）的sn-1、sn-2 位上形成磷脂酸（Phosphatidic acid，PA）；再由磷脂酸磷酸酶（Phosphatidic acid phos?phatase，PAP）脫去磷脂酸sn-3 位的磷酸形成甘油二酯（Diacylglycerol，DAG）；最后由二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（Diacylglycerol acyltransferase，DGAT）催化將另一個(gè)脂酰CoA 轉(zhuǎn)移至DAG 的sn-3 位形成TAG［3］。 第2 種為磷脂酰膽堿（Phosphatidylcho?line，PC）sn-2 位的脂酰基在磷脂：二?；视王；D(zhuǎn) 移 酶（Phospholipid： DAG acyltransferase，PDAT）的作用下被DAG 結(jié)合，從而合成TAG。第3 種為DAG 在DGAT 的作用下，利用另一個(gè)DAG 分子脫下的脂?；纬蒚AG［4］。

DGAT 是植物中TAG 合成的唯一限速酶，對(duì)種子含油量、脂肪酸組成及種子重量具有重要作用［5，6］。DGAT基因家族可分為DGAT1、DGAT2、DGAT3 和WSD 四類。DGAT1 與酰基CoA：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（Acyl CoA：cholesterol acyltransferase，ACAT）家族序列同源性較高［7］，是擬南芥（Arabidopsis thaliana）中甘油三酯合成所必需的［5，8］；DGAT2 可在TAG 中選擇性積累更多的不飽和脂肪酸。過(guò)表達(dá)DGAT2，擬南芥中的油脂總含量升高［9］；紫蘇（Perilla frutescens）［10］和煙草（Nicotiana tabacum）中的不飽和脂肪酸含量升高，而飽和脂肪酸含量下降；另外，煙草中DGAT2 與轉(zhuǎn)錄因子ERF 共表達(dá)，促進(jìn)碳源更多地流向油脂和脂肪酸的生物合成［11］。DGAT1 和DGAT2 是2種結(jié)構(gòu)不同的膜結(jié)合?；D(zhuǎn)移酶，其分布和底物特異性影響了TAG 的合成及脂肪酸組成［12］。WSD 是一種雙功能酶，具有DGAT 功能，也在蠟酯的合成中發(fā)揮作用。DGAT3 最先由Saha 等人在花生（Arachis hypogae）中鑒定，在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，與DGAT1 和DGAT2 基因相似度較低，與WSD 相似度為13%，但不具有蠟酯合成功能，故歸類為DGAT3［7］。DGAT3 傾向于積累更多單不飽和脂肪酸［13］。

谷子（Setaria italica）是一年生禾本科作物，起源于我國(guó)北方黃河流域，具有耐旱、耐鹽堿、根系發(fā)達(dá)等特點(diǎn)。谷子籽粒脫殼后為小米。小米營(yíng)養(yǎng)豐富，含有多酚、氨基酸、黃酮等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及多種礦質(zhì)元素；粗脂肪含量高于大米和小麥，約為4. 28%［14］，且脂肪酸種類豐富，主要為亞油酸、油酸、棕櫚酸和α - 亞麻酸［15］，還含有少量的EPA（Eicosapentaenoic acid）、DHA（Docosahexaenoic acid）和花生四烯酸，對(duì)人體有益的不飽和脂肪酸占總量的80%。但目前鮮有對(duì)谷子中油脂合成的研究，不利于相關(guān)基因的挖掘和小米品質(zhì)的改良。

本研究利用生物信息學(xué)方法，對(duì)谷子DGAT基因的類別、蛋白特性、保守基序、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件及表達(dá)模式進(jìn)行了分析，并利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（Weighted gene co-expression net-work analysis，WGCNA）方法挖掘了潛在的谷子甘油三酯調(diào)控基因，為谷子油脂及脂肪酸的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 谷子DGAT 基因家族成員的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

從MDSI（http：//foxtail-millet. biocloud. net/home）數(shù)據(jù)庫(kù)下載谷子突變體材料x(chóng)iaomi［16］的基因組數(shù)據(jù)。通過(guò)兩種方式獲得谷子DGAT家族基因，一種是在TAIR（https：//www. arabidopsis.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載擬南芥DGAT 的蛋白序列，利用TBtools［17］進(jìn)行BLAST，搜索谷子DGAT（閾值為1e-5）；另一種是從Pfam（http：//pfam. xfam. org/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載DGAT基因家族的HMM 模型（PF03982），利用TBtools 在谷子蛋白質(zhì)組中進(jìn)行HMM search。 將2 種方法獲得的候選蛋白質(zhì)序列，利用Pfam 進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，刪除與DGAT 功能無(wú)關(guān)的基因，最終確定谷子DGAT 家族成員。

從水稻數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//rice. plantbiology. msu.edu/）獲取水稻DGAT家族基因的蛋白序列；從玉米 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//maizegdb. org/）獲取玉米DGAT 家族基因的蛋白序列；從UniProt（https：//www. uniprot. org/）中獲取大豆的DGAT家族基因蛋白序列。 利用MEGA-X 軟件對(duì)擬南芥、水稻、玉米、大豆及谷子的DGAT家族基因進(jìn)行序列比對(duì)，并以鄰接法（Neighbor-joining，NJ；bootstrap=1 000）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，利用iTOL（https：//itol.embl. de/）對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行美化。

1. 2 谷子DGAT 基因家族成員蛋白理化性質(zhì)分析

利用ExPASy 網(wǎng)站（https：//web. expasy. org/protparam/）分析蛋白的理化性質(zhì)。利用Softberry（http：//linux1. softberry. com/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。利用TMHMM 2. 0（www. cbs. dtu. dk/ser?vices/TMHMM-2. 0/）進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)。

1. 3 谷子DGAT 基因家族成員的保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

利用MEME 在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme/）預(yù)測(cè)谷子DGAT 的保守基序，基序數(shù)目設(shè)置為20。 利用在線網(wǎng)站（https：//www. ge?nome. jp/tools/motif/）預(yù)測(cè)Motif 的類型。利用TBtools 對(duì)谷子DGAT 基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化。

1. 4 谷子DGAT 基因家族成員的啟動(dòng)子順式作用元件分析

提取谷子DGAT家族基因的上游2 000 bp 序列，提交至PlantCARE 在線網(wǎng)站（http：//bioinfor?matics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)，利用TBtools 進(jìn)行可視化。

1. 5 晉谷21 不同組織中DGAT 基因家族成員的表達(dá)模式分析

從MDSI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載谷子DGAT家族基因在晉谷21（JG21）不同組織的表達(dá)量數(shù)據(jù)，包括：FY（發(fā)芽種子-3 天）、D4sh（倒4 葉葉鞘）、D4Y（倒4葉）、FL（旗葉）、J2（倒2 節(jié)莖桿）、QYQ（旗葉葉鞘）、R（根）、SXJ（穗頸節(jié)）、S1（未成熟種子-S1）、S2（未成熟種子-S2）、S3（未成熟種子-S3）、S4（未成熟種子-S4）、S5（未成熟種子-S5）、d30（種子-成熟后30 天）和d60（種子-成熟后60 天）。利用TB?tools 繪制熱圖，比較基因表達(dá)差異。

1. 6 晉谷21 灌漿期籽粒中SiDGAT1 和SiDGAT2 的差異表達(dá)分析

對(duì)2020 年在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地種植的JG21 灌漿期S1（外觀鮮綠，內(nèi)含物呈乳狀）和S3（外觀黃綠，胚可與固態(tài)內(nèi)含物分離）籽粒進(jìn)行取樣，置于液氮中速凍，保存于-80℃冰箱。 利用Trizol 法提取JG21 籽粒的總RNA，利用Primer Script RT reagent Kit（Takara）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)JG21 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，選擇在谷子籽粒中表達(dá)量較高的谷子DGAT家族基因，利用Primer6. 0 軟件設(shè)計(jì)引物（表1），進(jìn)行熒光定量PCR，根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算基因表達(dá)量。

1. 7 谷子DGAT 所在模塊的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

從MDSI 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取JG21 的15 個(gè)組織表達(dá)量數(shù)據(jù)，利用R 軟件（R version 3. 6. 3）中的WGC?NA［18］包構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。利用WGC?NA 包中的函數(shù)pickSoftThreshold 計(jì)算權(quán)重值，根據(jù)無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)原則，選擇軟閾值power=9。使用函數(shù)blockwiseModules=5 000 構(gòu)建無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)。利 用cytoscape 3. 8. 2［19］繪 制SiDGAT2. 1 和SiDGAT2. 2 所在模塊的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 谷子DGAT 的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)BLAST 和HMM search，共鑒定到14 個(gè)谷子DGAT 家族基因。將14 個(gè)谷子DGAT 與擬南芥、水稻、玉米以及大豆的DGAT 進(jìn)行蛋白序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1）。結(jié)果顯示，5 個(gè)物種的DGAT家族基因可劃分為DGAT1、DGAT2、DGAT3 以及WSD4 個(gè)類群。 14 個(gè)谷子DGAT中，5 個(gè)屬于DGAT1，2 個(gè)屬于DGAT2，7 個(gè)屬于WSD，谷子中沒(méi)有DGAT3。依據(jù)谷子DGAT 基因類型和在染色體中的位置進(jìn)行命名。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，DGAT1 與DGAT2 親緣關(guān)系較近，DGAT3 與WSD 的親緣關(guān)系較近。各類群分支中，谷子基因總是與水稻和玉米基因聚在一起，而與擬南芥、大豆親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。谷子、水稻、玉米同為禾本科，擬南芥為十字花科，大豆為豆科。從DGAT1 中分析發(fā)現(xiàn)，谷子與玉米的親緣關(guān)系較水稻更近，因?yàn)楣茸优c玉米同為C4作物，而水稻為C3作物。 DGAT2 中，SiDGAT2. 3、SiDGAT2. 4和SiDGAT2. 5單獨(dú)聚為一類，表明其可能具有相似且特殊的功能。 WSD 中，Si?WSD1和SiWSD4可能與水稻中的WSD 功能更相似，SiWSD3則與玉米中的WSD 功能更接近，SiWSD5、SiWSD6 和SiWSD7 與其它谷子WSD親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，功能可能與其它蛋白有差異。

2. 2 谷子DGAT 的理化性質(zhì)分析

分析谷子DGAT家族基因的序列特征發(fā)現(xiàn)（表2），14 個(gè)谷子DGAT 蛋白氨基酸數(shù)目在334～701 aa 之間，相對(duì)分子質(zhì)量在37. 10～78. 35 ku 之間，等電點(diǎn)在6. 33～9. 76 之間，大部分蛋白質(zhì)呈堿性；疏水性在-0. 212～0. 307 之間。亞細(xì)胞定位顯示，SiDGAT2. 3、SiDGAT2. 4和SiDGAT2. 5定位于葉綠體，其余蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)?？缒^(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SiDGAT1. 1、SiDGAT1. 2、SiDGAT2. 1、SiDGAT2. 2和SiWSD1含有跨膜區(qū)，其余蛋白質(zhì)未檢測(cè)到跨膜區(qū)。由于SiDGAT1和SiDGAT2是結(jié)構(gòu)不同的膜結(jié)合?；D(zhuǎn)移酶［20］，WSD 是可溶性蛋白或膜結(jié)合蛋白［21］，膜結(jié)合蛋白可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或葉綠體，可溶性蛋白可能定位于胞外。因此推測(cè)SiDGAT1. 1、SiDGAT1. 2、SiDGAT2. 1、SiDGAT2. 2和SiWSD1為膜蛋白。

2. 3 谷子DGAT 的保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析

將谷子DGAT 蛋白序列提交至MEME 在線網(wǎng)站進(jìn)行保守基序預(yù)測(cè)，數(shù)目設(shè)置為20，并利用在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)motif 的類型（圖2）。不同類群之間差異明顯，同種DGAT基因間具有相似的保守基序，且所有DGAT基因都有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的保守基序。 2 個(gè)SiDGAT1都具有motif12（MBOAT），是一種膜結(jié)合的?；D(zhuǎn)移酶家族，與前人研究結(jié)果一致［3］；5 個(gè)SiDGAT2都有Motif9（DGAT） ；SiDGAT2. 3、SiDGAT2. 4和SiDGAT2. 5特有motif17，預(yù)測(cè)為Hydrolase_4；7個(gè)SiWSD都含有motif1（WES_acyltransf）、motif4（WES_acyltransf）、motif2（WS_DGAT_C）、motif3（WS_DGAT_C）和motif5（WS_DGAT_C），表明其既有蠟酯合成功能，也在甘油三酯合成中發(fā)揮作用。

圖2 谷子DGAT 家族蛋白保守基序及基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Protein conserved motif and sequence structure of DGAT gene family in foxtail millet

基因結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果顯示，SiDGAT1具有16個(gè)外顯子區(qū)；SiDGAT2. 1和SiDGAT2. 2都具有9個(gè)外顯子區(qū)，SiDGAT2. 3、SiDGAT2. 4和SiDGAT2. 5具有13 個(gè)外顯子區(qū)；SiWSD2、Si?WSD3、SiWSD4、SiWSD5、SiWSD6和SiWSD7都具有7 個(gè)外顯子區(qū)，而SiWSD1具有5 個(gè)外顯子區(qū)。除SiWSD1外，聚為一簇的基因具有相似的結(jié)構(gòu)。

本研究的目標(biāo)分析物是合成麝香，對(duì)水樣的預(yù)處理主要包括過(guò)濾、萃取和濃縮。采用玻璃纖維濾紙?jiān)谡婵諚l件下進(jìn)行水樣過(guò)濾，使溶解相和顆粒相分離。對(duì)于溶解相，量取1.5 L過(guò)濾后的水樣至分液漏斗中，加入 10 μL 500 ng·mL-1 DnBP-d4 回收率指示物標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后再加入50 mL二氯甲烷進(jìn)行液液萃?。?次）；對(duì)于顆粒相，將玻璃纖維濾紙中的顆粒相樣品加入到索氏抽提器中以150 mL二氯甲烷靜置萃取24 h。將萃取液過(guò)無(wú)水硫酸鈉以去除剩余水分，收集萃取液于250 mL蒸發(fā)瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1 mL左右，最后氮吹濃縮至約 150 μL。

2. 4 谷子DGAT 的啟動(dòng)子順式作用原件分析

為了探究谷子DGAT家族基因在非生物脅迫中可能存在的調(diào)控機(jī)制，利用PlantCare 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其上游2 000 bp 序列進(jìn)行了分析（圖3），共鑒定到14 類順式作用原件，包括：光響應(yīng)、厭氧誘導(dǎo)、脫落酸響應(yīng)、MYB 結(jié)合位點(diǎn)、生長(zhǎng)素響應(yīng)、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)、水楊酸響應(yīng)、赤霉素響應(yīng)、晝夜節(jié)律響應(yīng)、胚乳表達(dá)、分生組織表達(dá)、低溫響應(yīng)和抗逆。SiDGAT2. 2和SiDGAT2. 4啟動(dòng)子區(qū)含有的順式作用原件種類最多（10 種），SiDGAT2. 1和Si?WSD2啟動(dòng)子區(qū)含有的順式作用元件數(shù)目較少（6種）。所有谷子DGAT 啟動(dòng)子區(qū)均包含光響應(yīng)、厭氧誘導(dǎo)、脫落酸響應(yīng)和茉莉酸甲酯響應(yīng)元件。從組成類型特異性來(lái)看，大部分基因啟動(dòng)子區(qū)都包含MYB 結(jié)合位點(diǎn)和分生組織表達(dá)元件；約半數(shù)基因啟動(dòng)子區(qū)含有生長(zhǎng)素和赤霉素響應(yīng)元件；SiDGAT1. 1、SiWSD1、SiWSD3、SiWSD4和Si?WSD5的啟動(dòng)子區(qū)包含脫落酸響應(yīng)元件；SiDGAT1. 1、SiDGAT1. 2、SiDGAT2. 2和SiDGAT2. 5啟動(dòng)子區(qū)含有低溫響應(yīng)元件；SiDGAT1. 2和SiDGAT2. 3啟動(dòng)子區(qū)包含晝夜節(jié)律控制元件；SiDGAT1. 1和SiWSD3啟動(dòng)子序列含有柵欄狀葉肉細(xì)胞分化相關(guān)的元件；SiDGAT2. 3和SiDGAT2. 5啟動(dòng)子區(qū)序列含有與胚乳表達(dá)相關(guān)的作用元件；僅SiDGAT2. 4啟動(dòng)子區(qū)含有與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的作用元件。

圖3 谷子DGAT 家族基因啟動(dòng)子順勢(shì)作用元件分布Fig.3 Distribution of cis-acting elements in the promoter region of DGAT gene family in foxtail millet

2. 5 谷子DGAT 的表達(dá)模式分析

JG21 不同組織及收獲后籽粒中表達(dá)模式分析顯示（圖4），SiDGAT1在谷子各個(gè)組織中均有表達(dá)；SiDGAT1. 1在灌漿期籽粒和發(fā)芽種子種表達(dá)量較低，在葉、葉鞘、莖稈和根中表達(dá)量較高；SiDGAT1. 2則相反，在S2 中表達(dá)量最高。SiDGAT2中，SiDGAT2. 1在旗葉鞘、根、穗下節(jié)和S5 中高表達(dá)；SiDGAT2. 2整體表達(dá)量較高；SiDGAT2. 3和SiDGAT2. 4在發(fā)芽3 d 種子和根中表達(dá)量較高；未檢測(cè)到SiDGAT2. 5的表達(dá)。Si?WSD在灌漿期籽粒中幾乎不表達(dá)；除SiWSD3外，SiWSD在發(fā)芽3 d 的種子中表達(dá)量較高；Si?WSD2也根中高表達(dá)；SiWSD4在旗葉、旗葉鞘、倒4 葉和倒4 葉鞘中高表達(dá)，可能與蠟酯合成的功能有關(guān)。

圖4 谷子DGAT 基因表達(dá)譜Fig.4 Gene expression profiles of DGAT genes in foxtail millet

谷子灌漿期籽粒中（S1～S5），SiDGAT2. 1和SiDGAT2. 2的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，且SiDGAT2. 2是所有谷子DGAT基因中在灌漿期籽粒中表達(dá)量最高的，表明SiDGAT2在谷子籽粒甘油三酯和脂肪酸的積累中發(fā)揮重要作用；SiDGAT2. 2在S2 時(shí)期表達(dá)量降低，而SiDGAT1. 2在S2 時(shí)期表達(dá)量最高，表明谷子籽粒灌漿期S2 時(shí)SiDGAT1. 2發(fā)揮主要作用；SiDGAT1. 1是谷子DGAT 家族基因中唯一在收獲后30 d 和60 d 籽粒中表達(dá)的基因，可能參與谷子后熟；SiWSD對(duì)灌漿期谷子籽粒中甘油三酯和脂肪酸積累的作用較小。

2. 6 晉谷21 籽粒灌漿期SiDGAT1 和SiDGAT2的表達(dá)模式分析

為了進(jìn)一步篩選在谷子籽粒甘油三酯積累過(guò)程中發(fā)揮重要作用的基因，對(duì)JG21 灌漿期S1 和S3 的籽粒進(jìn)行取樣，利用熒光定量PCR 檢測(cè)了SiDGAT1和SiDGAT2的相對(duì)表達(dá)量（圖5）。結(jié)果顯示，除SiDGAT2. 5外，其余6 個(gè)基因的表達(dá)都在S3 顯著上調(diào)，表明其在谷子籽粒灌漿過(guò)程中發(fā)揮一定作用。部分基因的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果不同，可能是由于取樣的差異導(dǎo)致。谷子籽粒灌漿前期，胚形成，胚乳固化，油脂快速積累［22］，是甘油三酯積累的重要時(shí)期。SiDGAT2. 1和SiDGAT2. 2從S1 至S3 表達(dá)量升高了8 倍左右，推測(cè)其可能在谷子籽粒甘油三酯積累中發(fā)揮重要作用。

圖5 SiDGAT1 和SiDGAT2 在灌漿期谷子籽粒中的表達(dá)分析Fig.5 Expression analysis of SiDGAT1 and SiDGAT2 at grain filling stage of foxtail millet

2. 7 谷子DGAT 的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

利用WGCNA 包中的goodSamplesGenes 函數(shù)檢測(cè)并過(guò)濾缺失值基因，最終獲得29 727 條轉(zhuǎn)錄本用于后續(xù)加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。選擇軟閾值power=9 來(lái)構(gòu)建權(quán)重基因網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置模塊最小基因數(shù)minModuleSize=30，合并模塊參數(shù)mergeCutHeight=0. 25，maxBlockSize=6 000，構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)模塊。最終得到25 個(gè)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)模塊，模塊中基因個(gè)數(shù)17～7 810 不等。13 個(gè)谷子DGAT 基因（SiDGAT2. 5被過(guò)濾掉）分布在8 個(gè)模塊中。DGAT2 在谷子籽粒灌漿期發(fā)揮著較為重要的作用，因此本研究選取SiDGAT2. 1所在的模塊1 和SiDGAT2. 2所在的模塊2 進(jìn)行分析。利用Cytoscape 對(duì)模塊共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化（圖6），篩選模塊的核心基因和轉(zhuǎn)錄因子，在水稻數(shù)據(jù)庫(kù)及擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源基因功能注釋（表3）。

表3 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)核心基因和轉(zhuǎn)錄因子注釋Table 3 Functional annotation of co-expression network core genes and transcription factors

圖6 模塊1（A）和模塊2（B）的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Co-expression network of module 1（A）and module 2（B）

在模塊1 中篩選到5 個(gè)核心基因和5 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。Si5g43630預(yù)測(cè)為ARF 轉(zhuǎn)錄因子，與生長(zhǎng)素運(yùn)輸相關(guān)，同時(shí)也是模塊的核心基因，表明其在模塊1 中具有重要的作用；Si2g25960和Si3g16230預(yù)測(cè)為MYB-related 轉(zhuǎn)錄因子；Si7g23570預(yù)測(cè)為Tri?helix 轉(zhuǎn)錄因子；Si2g30160預(yù)測(cè)為Nin-like 轉(zhuǎn)錄因子。在模塊2 中篩選到5 個(gè)核心基因，Si9g05730注釋為液泡分選蛋白，與生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)壬镞^(guò)程相關(guān)［23］；Si9g47710注釋為糖基水解酶，可能與糖脂的形成有關(guān)。

篩選網(wǎng)絡(luò)中與SiDGAT2相關(guān)聯(lián)的基因、與核心基因高連通性的基因作為候選基因，進(jìn)行同源基因功能注釋（表4）。其中包含脂肪水解酶、磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)酶、甘油醛磷酸脫氫酶、半乳糖?；视秃厦傅扰c脂質(zhì)合成相關(guān)的酶；還有含C3HC4 結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白，與小麥的干旱和鹽脅迫相關(guān)［24］；含PHD結(jié)構(gòu)域的蛋白，其主要功能是與各種組蛋白修飾特異結(jié)合，作為組蛋白密碼識(shí)別器來(lái)調(diào)控下游基因的表達(dá)［25］；含GRAM 和C2 鈣/脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白；和含MIF4G 結(jié)構(gòu)域的蛋白。

表4 候選基因功能注釋Table 4 Functional annotation of candidate genes

3 討論

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析鑒定到14 個(gè)谷子DGAT基因，并對(duì)其進(jìn)化模式、序列特征、基因結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位和表達(dá)模式進(jìn)行系統(tǒng)分析，利用WGCNA 挖掘了可能與谷子DGAT2 存在調(diào)控關(guān)系的候選基因。這14 個(gè)谷子DGAT基因?qū)儆? 個(gè)類群：DGAT1（2 個(gè)）、DGAT2（5 個(gè)）和WSD（7個(gè)），未鑒定到DGAT3。 有研究發(fā)現(xiàn)DGAT3 有較高的底物特異性，敲除CsDGAT3-3 基因會(huì)導(dǎo)致亞麻薺種子中花生烯酸的積累減少［26］。谷子中花生烯酸C20∶1 較少［15］，可能不存在DGAT3 或幾乎不表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)谷子DGAT 不僅可能在甘油三酯合成中發(fā)揮作用，也可能參與植物逆境、低溫等非生物脅迫響應(yīng)，這與以往研究一致［27］。植物遭遇逆境時(shí)膜流動(dòng)性會(huì)發(fā)生變化，而脂肪酸與膜流動(dòng)性有關(guān)［28］。 大部分谷子DGAT 啟動(dòng)子區(qū)都含有MYB 結(jié)合位點(diǎn)，表明谷子DGAT 可能受MYB 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。

雙子葉植物中的DGAT1 在灌漿期籽粒中高表達(dá)，而在葉和莖中低表達(dá)［29～31］。 但本研究中SiDGAT1. 1在灌漿期籽粒中表達(dá)量較低，反而是唯一在收獲后的種子中表達(dá)的DGAT基因，推測(cè)在谷子籽粒的后熟過(guò)程中具有重要作用。

與DGAT1 相比，DGAT2 更側(cè)重于脂肪酸的積累，在一些含有稀有脂肪酸的植物中，DGAT2更重要［6］。種子中DGAT2 的高表達(dá)能顯著增加含油量和不飽和脂肪酸的含量［32］。谷子中沒(méi)有在灌漿期籽粒中特異性高表達(dá)的DGAT基因，這可能是小米含油量無(wú)法與油料作物相比的原因之一。 谷子中不飽和脂肪酸占比達(dá)80%，SiDGAT2. 2在谷子籽粒灌漿期的表達(dá)明顯高于其他基因，且在灌漿前中期顯著上調(diào)，可能對(duì)谷子籽粒中不飽和脂肪酸的積累具有重要作用。DGAT2 以微粒體形式存在，結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上［33］，但本研究中SiDGAT2. 3、SiDGAT2. 4、SiDGAT2. 5的亞細(xì)胞定位結(jié)果為葉綠體，且在系統(tǒng)進(jìn)化分析中單獨(dú)聚為一類，這與以往研究存在差異，但也有研究發(fā)現(xiàn)葉片中的TAG 合成發(fā)生在葉綠體被膜上，并以質(zhì)體小球的形式釋放到葉綠體基質(zhì)中［5，34，35］，這3 個(gè)基因在谷子葉、莖稈等組織中的表達(dá)高于在灌漿期籽粒中，推測(cè)其主要在葉片的TAG 合成中發(fā)揮作用。

WSD 是具有蠟酯合成和二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶功能的雙功能酶。蠟酯主要存在于植物初生芽的角質(zhì)層，或以較高的濃度積累在種子中［36］。Si?WSD主要在葉、莖稈及萌發(fā)的種子中表達(dá)，其主要作用于蠟酯合成還是甘油三酯合成仍需進(jìn)一步深入研究。

另外，本研究通過(guò)WGCNA 挖掘了與SiDGAT2. 1和SiDGAT2. 2相關(guān)聯(lián)的基因。候選基因中包括MYB-related、ARF、NIN、Trihelix 轉(zhuǎn)錄因子，在生長(zhǎng)發(fā)育、非生物脅迫［37］、氮信號(hào)調(diào)節(jié)［38］等過(guò)程中發(fā)揮作用；還有各種功能蛋白和酶。通過(guò)對(duì)候選基因的功能注釋，發(fā)現(xiàn)DGAT 可能參與多種生物學(xué)過(guò)程。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析，鑒定了14 個(gè)谷子DGAT基因，分為3 個(gè)類群，同一類群基因具有相似的結(jié)構(gòu)和功能；谷子DGAT 基因啟動(dòng)子區(qū)包含生長(zhǎng)發(fā)育、非生物脅迫相關(guān)的順式作用原件；基于不同組織表達(dá)模式分析推測(cè)2 個(gè)SiDGAT2在谷子籽粒甘油三酯積累中發(fā)揮著重要作用；利用15份谷子組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了WGCNA，挖掘了潛在的影響谷子籽粒甘油三酯合成的基因和轉(zhuǎn)錄因子，為深入探究谷子甘油三酯和脂肪酸的積累提供依據(jù)。