杜笑，衛(wèi)銀，郭楊昪，常明昌，2，孟俊龍，2，劉靖宇，2*

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；2. 黃土高原食用菌提質(zhì)增效協(xié)同創(chuàng)新中心，山西 太谷 030801）

糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）隸屬于擔(dān)子菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，是我國栽培量和消費量最大的食用菌種類之一［1］。黃斑病是糙皮側(cè)耳生產(chǎn)中最為常見的一種細(xì)菌性病害［2］。糙皮側(cè)耳生產(chǎn)中細(xì)菌性病害多采用化學(xué)防治，長期大量使用化學(xué)試劑造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、生態(tài)破壞、病菌產(chǎn)生抗藥性等問題［3］。近年來，微生物來源的生物防治，無農(nóng)藥殘留，同時有利于生態(tài)平衡和可持續(xù)發(fā)展，已成為食用菌病害防治研究的熱點內(nèi)容之一［4］。

醋酸桿菌（Acetobacter）隸屬于變形菌門、α-變形桿菌綱、紅螺菌目、醋酸菌科、醋酸單孢菌屬，是醋發(fā)酵階段的關(guān)鍵菌種［5］。醋酸桿菌中含有多酚、多糖、生物堿和色素等多種活性物質(zhì)，具有抑菌、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老和降血糖等多種功能活性［6～9］。多酚作為其最主要的生物活性物質(zhì)之一，現(xiàn)有研究主要集中于提取工藝優(yōu)化、抗氧化作用和化學(xué)成分分離等方面［10～12］，而針對多酚防治食用菌病害的研究鮮有報道。本課題組前期研究結(jié)果表明醋酸桿菌發(fā)酵液對糙皮側(cè)耳黃斑病致病菌解淀粉芽孢桿菌有顯著的抑制作用［13］。為此，本研究以醋酸桿菌液體發(fā)酵液為供試材料，通過Box-Behnk?en 試驗設(shè)計對醋酸桿菌發(fā)酵液多酚的提取工藝進行優(yōu)化，并研究醋酸桿菌發(fā)酵液多酚對該病原菌的防治作用，旨在為糙皮側(cè)耳，乃至其它大型真菌生產(chǎn)中細(xì)菌性病害的防治提供一個新的思路。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 菌株

醋酸桿菌（Acetobacter）菌株BA15、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）HB-1 均由山西省食用菌工程技術(shù)研究中心提供。

1. 1. 2 培養(yǎng)基

LB 液體培養(yǎng)基：10 g 蛋白胨，5 g 酵母膏，10 g氯化鈉，1 L 蒸餾水，pH 7. 4；

醋酸桿菌液體培養(yǎng)基：20 g 葡萄糖，10 g 酵母膏，20 mL 無水乙醇，1 L 蒸餾水。

1. 1. 3 主要試劑和儀器

福林酚顯色劑、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品均購自北京索萊寶科技有限公司；其余基本試劑為國產(chǎn)分析純。

FA1004 電子分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；RV10 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA）、JY92-N 超聲波（寧波生物科技股份有限公司）；RGX 人工氣候培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；HCB-1300V 垂直層流潔凈工作臺（青島海爾特種電器有限公司）；UV-1800PC 紫外可見光分光光度計（上海美浦達(dá)儀器有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確配置1 mg·mL-1的沒食子酸溶液，依次配成0、50、100、150、200、250 μg·mL-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取200 μL 標(biāo)準(zhǔn)液置于10 mL 試管中，加入800 μL 蒸餾水、200 μL 福林酚試劑，混勻后避光保存6 min，再加入2 mL 7% Na2CO3溶液和1. 6 mL 蒸餾水，在避光條件下放置90 min 后于765 nm 波長處測定吸光度［14］。

以多酚濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=0. 517 3x+0. 029 2，R2=0. 996 9。

1. 2. 2 醋酸桿菌發(fā)酵液的制備

將活化的醋酸桿菌菌株BA15 接入裝有100 mL 培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，接種量1%，30 ℃、160 r·min-1，培養(yǎng)7 d，備用。

1. 2. 3 醋酸桿菌發(fā)酵液多酚的提取

在培養(yǎng)好的醋酸桿菌發(fā)酵液中加入乙醇，置于超聲波中進行超聲波輔助提取。提取結(jié)束后離心10 min（6 000×g），取上清。45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干濃縮樣品，蒸餾水定容至2. 5 mL。

1. 2. 4 多酚提取量的測定

精確吸取制備好的多酚溶液200 μL，按照測定沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方法依次加入福林酚試劑和Na2CO3溶液，并測定其吸光度，將所測結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得出多酚的濃度（mg·mL-1），最后根據(jù)公式計算出醋酸桿菌中多酚的提取量。

式中W 為多酚提取量，mg·mL-1；X 為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的多酚濃度，μg·mL-1；M 為濃縮后體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；V 為醋酸桿菌發(fā)酵液體積，mL。

1. 3 單因素試驗設(shè)計

（1）不同料液比對多酚提取量的影響：料液比設(shè)置為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（V/V），乙醇濃度、超聲波功率和超聲時間分別設(shè)置為50%、250 W和20 min。其余步驟同1. 2. 3。

（2）不同乙醇濃度對多酚提取量的影響：乙醇濃度設(shè)置為20%、30%、40%、50%、60%、70%，料液比、超聲波功率和超聲時間分別設(shè)置為1∶3、250 W 和20 min。其余步驟同1. 2. 3。

（3）不同超聲功率對多酚提取量的影響：超聲功率設(shè)置為200、250、300、350、400、450 W，料液比、濃度和超聲時間分別設(shè)置為1∶3、50% 和20 min，其余步驟同1. 2. 3。

（4）不同超聲時間對多酚提取量的影響：超聲時間設(shè)置為5、10、15、20、25、30 min，料液比、超聲波功率和乙醇濃度分別設(shè)置為1∶3、250 W 和50%。其余步驟同1. 2. 3。

以上單因素試驗的每個處理均設(shè)置3 個重復(fù)。

1. 4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

通過對單因素試驗結(jié)果進行分析，選擇乙醇濃度（A）、超聲時間（B）和超聲功率（C）作為響應(yīng)因素，以醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken 試驗設(shè)計進行3 因素3 水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗（表1），以確定醋酸桿菌發(fā)酵液多酚的最佳提取工藝，每組試驗重復(fù)3 次。

表1 Box?Behnken 試驗的因素和水平Table 1 Factors and levels of the Box?Behnken design

1. 5 抑菌活性試驗

1. 5. 1 菌液制備

將活化的解淀粉芽孢桿菌菌株接種到裝有100 mL LB 液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，接種量1%，30 ℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，并用無菌水稀釋至1×106cfu·mL-1，備用。

1. 5. 2 醋酸桿菌發(fā)酵液多酚在平板上對解淀粉

芽孢桿菌的抑制作用（MIC）

吸取新培養(yǎng)的解淀粉芽孢桿菌懸液100 μL，均勻涂布于直徑9 cm 的LB 平板中，待其凝固后在培養(yǎng)基中心放置一個已滅菌的牛津杯。采用二倍梯度稀釋法將多酚提取液稀釋為140、70、35、17. 5、8. 75 μg·mL-1共5 個不同濃度，在牛津杯中加入100 μL 不同濃度的多酚提取液，放入4 ℃冰箱平衡2 h后置于30 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)24 h 觀察抑菌圈直徑，試驗重復(fù)3 次。

1. 5. 3 醋酸桿菌發(fā)酵液多酚在糙皮側(cè)耳子實體上

對解淀粉芽孢桿菌的抑制效果

選取單片健康新鮮的平菇子實體進行試驗，在距離菌蓋與菌柄交接半徑1. 5 cm 處選取3 個區(qū)域作為侵染點。侵染點A1：蘸取100 μL 離心菌液所得沉淀涂布均勻，涂布直徑約為1 cm。侵染點A2：病原菌接種操作同侵染點A1，接種2 h 后，吸取多酚提取液20 μL 完全覆蓋病原菌接種區(qū)域。侵染點A3：吸取無菌水20 μL 涂布，涂布直徑約為1 cm。在室溫16～18 °C、相對濕度85% 和光照400～450 lx 的環(huán)境下培養(yǎng)24 h 后觀察糙皮側(cè)耳染病情況。

1. 6 統(tǒng)計分析

所有試驗均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)均采用Excel 2010和SPSS 16. 0 軟件進行分析和作圖。單因素試驗中醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取量用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。P＜0. 05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素試驗

2. 1. 1 料液比對多酚提取量的影響

如圖1 所示，料液比從1∶1（V/V）增加到1∶3（V/V）時，醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取量隨料液比的增加而增加，當(dāng)料液比為1∶3 時，多酚提取量為0. 112 mg·mL-1，當(dāng)料液比大于1∶3（V/V）時，提取量未出現(xiàn)顯著增加，說明多酚提取量達(dá)到飽和狀態(tài)?？紤]到料液比的增大會加劇時間和能量的消耗，因此選擇料液比為1∶3（V/V）。

圖1 料液比對多酚提取量的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on polyphenol extraction amount

2. 1. 2 乙醇濃度對多酚提取量的影響

如圖2 所示，乙醇濃度在20%～50% 時，醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取量隨乙醇濃度的增大而增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50% 時，多酚提取量達(dá)到最大為0. 125 mg·mL-1，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于50% 時，提取率反而下降，這可能是乙醇的體積分?jǐn)?shù)增加到一定程度時其它一些弱極性成分溶出量增加，減緩了酚類物質(zhì)向乙醇溶劑的擴散［14］，因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

圖2 乙醇濃度對多酚提取量的影響Fig.2 Influence of ethanol volume fraction on polyphenol extrac?tion amount

2. 1. 3 超聲波功率對多酚提取量的影響

如圖3 所示，超聲功率從200 W 增加到250 W時，醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取量隨料液比的增加而增加，當(dāng)料液比為250 W，多酚提取量為0. 129 mg·mL-1，當(dāng)料液比大于250 W，提取量下降，可能是超聲功率過大產(chǎn)生強烈的熱效應(yīng)導(dǎo)致一些不穩(wěn)定多酚被分解轉(zhuǎn)化［15］，因此選擇超聲功率為250W。

圖3 超聲功率對多酚提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction of polyphenols

2. 1. 4 超聲波時間對多酚提取量的影響

如圖4 所示，超聲時間在5～20 min 之間時，醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取量隨時間的增加而增加，當(dāng)超聲時間為20 min 時，多酚提取量為0. 125 mg·mL-1，在達(dá)到20 min 以后提取量的增大速率相對超聲時間較低時放緩。雖然醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取量在大于20 min 后有一定水平的增加，但是出于經(jīng)濟效益考慮，超聲時間應(yīng)選擇在20 min。

圖4 超聲時間對多酚提取量的影響Fig.4 Influence of ultrasonic time on polyphenol extraction quantity

2. 2 Box?Benhnken 試驗結(jié)果

2. 2. 1 模型方程的建立和顯著性分析

依據(jù)響應(yīng)面設(shè)計完成3 因素3 水平條件下醋酸桿菌發(fā)酵液多酚的提取和含量的測定，設(shè)計表及結(jié)果表見表2。經(jīng)過方差分析和二次多項回歸擬合分析，醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取量用響應(yīng)值Y 來表示，得到最終方程：

表2 響應(yīng)面設(shè)計和試驗結(jié)果Table 2 Response surface analysis design and data

由表3 可知，該模型的F 值為17. 42，P值為0. 000 5，說明模型高度顯著，該模型建立有效。模型的決定系數(shù)和校正確定系數(shù)分別為R2=0. 957 3和Radj2=0. 902 3，說明該模型中90. 23% 的試驗數(shù)據(jù)與模型相關(guān)。對回歸模型進行顯著性分析可知，A、AB、A2和C2的差異極顯著，C、BC 和B2的差異顯著，其余項均不顯著。根據(jù)F 值結(jié)果分析，各因素對醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取量的影響順序依次是乙醇濃度（A）＞超聲功率（C）＞超聲時間（B）。

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 Regression analysis data

2. 2. 2 多因素交互作用分析

乙醇濃度、超聲時間和超聲功率3 個因素在醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取過程中的兩兩交互作用如圖5 所示。響應(yīng)曲面越陡峭，說明兩個因素之間的交互作用對多酚提取量影響越顯著［16］。由圖5a 可知，隨著超聲時間和乙醇濃度的增大，醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取量也隨之增長，但超聲時間和乙醇濃度增大到一定程度后，多酚提取量有下降的趨勢，且超聲時間和乙醇濃度響應(yīng)曲面坡度最陡，說明兩因素交互作用對多酚提取量影響最顯著。由圖5b可知超聲時間與超聲功率響應(yīng)面坡度較陡，說明兩因素交互作用對多酚提取量影響顯著；由圖5c 可知乙醇濃度與超聲功率交互作用對多酚提取量影響不顯著。

圖5 響應(yīng)面的三維曲面圖Fig.5 3D curved surface diagram of the response surface

2. 3 驗證試驗

通過分析回歸擬合方程和回歸模型，依據(jù)響應(yīng)面分析法對醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取量進行優(yōu)化，得到醋酸桿菌發(fā)酵液多酚最優(yōu)參數(shù)為料液比1∶3、最佳超聲時間22. 5 min、乙醇濃度45. 6%、超聲功率為250. 43 W，發(fā)酵液中多酚提取量的理論值為0. 144 mg·mL-1。根據(jù)實際情況，設(shè)置料液比、超聲時間、乙醇濃度和超聲功率依次為1∶3、23 min、45%、250 W 進行驗證，最終得到多酚實際提取量為0. 140 mg·mL-1，誤差為2. 7%。此結(jié)果說明所建模型可靠，采用響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計的回歸方程能夠較好地顯示出其各個因素對多酚提取量的影響。

2. 4 醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取液在平板上對解淀粉芽孢桿菌的抑制作用

通過牛津杯法，考察不同濃度的醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取液對解淀粉芽孢桿菌的抑制效果。醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取液濃度為140、70、35、17. 5 μg·mL-1時，隨著濃度的降低抑菌圈直徑也在減小。當(dāng)濃度為8. 75 μg·mL-1時，提取液對解淀粉芽孢桿菌無抑制作用（圖6）。這一結(jié)果表明，醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取液的最小抑菌濃度為17. 5 μg·mL-1。

圖6 不同濃度多酚提取液對解淀粉芽孢桿菌抑制圖Fig.6 Inhibition of different concentrations of polyphenol extracts against Bacillus amyloliticus

2. 5 醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取液在糙皮側(cè)耳子實體上對解淀粉芽孢桿菌的防治效果

選取料液比1∶3、超聲功率250 W、超聲時間23 min 和乙醇體積分?jǐn)?shù)45% 提取的醋酸桿菌多酚提取液研究其在糙皮側(cè)耳子實體上對解淀粉芽孢桿菌的防治效果。由圖7 可知，在子實體涂布病原菌2 h 后涂布醋酸桿菌多酚提取液，可明顯抑制該病原菌的生長。

圖7 醋酸桿菌多酚提取液在糙皮側(cè)耳子實體上對解淀粉芽孢桿菌的防治效果Fig.7 Control effect of Acetobacter polyphenol extract on the fruit?ing body of Pleurotus pellagra against Bacillus amyloliquefa?ciens

3 討論

采用Box-Behnken 方法，對醋酸桿菌發(fā)酵液多酚的超聲波輔助提取工藝優(yōu)化。結(jié)果表明，在料液比1∶3、超聲時間23 min、乙醇濃度45%、超聲功率250 W 的最優(yōu)工藝條件下，醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取量為0. 140 mg·mL-1。其中，超聲時間對醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取量的影響最大，這同鄧勇等［17］的石榴皮多酚提取結(jié)果相一致。 超聲功率在200～250 W 的范圍內(nèi)，醋酸桿菌多酚的提取量與超聲功率呈正相關(guān)。當(dāng)超聲功率為250 W 時，多酚提取量達(dá)到最大值0. 129 mg·mL-1，而當(dāng)超聲功率為250～450 W 時多酚提取量卻呈下降趨勢。其原因可能是超聲功率過大產(chǎn)生強烈的熱效應(yīng)導(dǎo)致一些不穩(wěn)定多酚被分解，也可能是超聲空化泡夾帶的水蒸氣和氧氣等進入到溶劑中，造成多酚被氧化而降解［18］。

現(xiàn)有研究表明：在生物活性組分提取過程中，采用較大的浸提溶劑濃度梯度，可改變原料組織結(jié)構(gòu)及其與溶劑之間的表面張力，從而易于有效成分的溶出，能顯著提高提取效率，但也存在一定缺陷［19，20］。 本文研究顯示：在提取液中含有0～50%乙醇的濃度范圍內(nèi)，醋酸桿菌多酚的提取量隨著乙醇濃度的增加而增加，而當(dāng)乙醇濃度超過50% 后，提取量則呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。這一結(jié)果與張春穎等［21］的小米多酚提取的研究結(jié)果相似，但小米多酚提取量卻是在乙醇濃度達(dá)到70% 后呈下降趨勢。我們推測可能與供試材料的組織結(jié)果及理化性質(zhì)均存在較大差異有關(guān)，這一研究結(jié)果將為醋酸桿菌發(fā)酵液多酚的高效提取技術(shù)研發(fā)及其應(yīng)用提供參考依據(jù)。

醋酸桿菌發(fā)酵液多酚對解淀粉芽孢桿菌的抑制效果分析結(jié)果顯示：采用牛津杯法，醋酸桿菌發(fā)酵液多酚對解淀粉芽孢桿菌的最小抑菌濃度為17. 5 μg·mL-1，明顯優(yōu)于植物來源的葡萄多酚［22］和藻類多酚［23］對于同類細(xì)菌的抑制效果。這可能與我們的提取材料有關(guān)，醋酸桿菌作為一種耐酸性細(xì)菌，其用于環(huán)境競爭分泌在胞外的次級代謝產(chǎn)物與偏堿性細(xì)菌解淀粉芽孢桿菌的自身需求存在較大不同［24］。子實體涂抹抑制試驗結(jié)果進一步顯示：醋酸桿菌發(fā)酵液多酚對黃斑病有明顯抑制作用，但對平菇子實體的正常生長無明顯影響，這與課題組前期的醋酸桿菌發(fā)酵液對糙皮側(cè)耳黃斑病致病菌的抑制作用效果相一致［13］。據(jù)此，推測醋酸桿菌發(fā)酵液多酚是其發(fā)酵液中的一種重要的可抑制解淀粉芽孢桿菌生長的抑菌活性物質(zhì)，其含量可作為應(yīng)用于防治糙皮側(cè)耳黃斑病的醋酸桿菌發(fā)酵液的重要檢測指標(biāo)，研究結(jié)果將為糙皮側(cè)耳，乃至其他大型真菌生產(chǎn)中細(xì)菌性病害的防治提供一個新的思路。

4 結(jié)論

本研究以醋酸桿菌發(fā)酵液為供試材料，通過響應(yīng)面分析法對多酚的提取工藝進行優(yōu)化，并探究其對糙皮側(cè)耳黃斑病病原菌解淀粉芽孢桿菌的防治作用。 研究結(jié)果表明：在料液比1∶3、乙醇濃度45%、超聲功率250 W 和超聲時間23 min 的條件下多酚提取效果最佳，提取量為0. 140 mg·mL-1。醋酸桿菌發(fā)酵液多酚提取液對解淀粉芽孢桿菌最小抑菌濃度為17. 5 μg·mL-1，且其能夠在糙皮側(cè)耳子實體上防治黃斑病。這也將為糙皮側(cè)耳黃斑病的生物防治研究提供重要的參考依據(jù)。