趙婉清，史淦琳，高詩聰，張虎芳

（忻州師范學(xué)院 生物系，山西 忻州 034000）

盲蝽科（Miridae）隸屬于半翅目（Hemiptera）異翅亞目（Heteroptera）臭蟲次目（Cimicomorpha），大部分種類為重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，主要危害小麥、棉花、苜蓿、馬鈴薯、甜菜、芝麻、煙草等［1，2］。一些盲蝽為捕食性昆蟲，如異須盲蝽、黑食齒爪盲蝽、煙盲蝽、中華微刺盲蝽等，可作為天敵昆蟲用于生物防治［3～6］。盲蝽物種豐富，體型小且體色多樣，所以常用分子生物學(xué)手段來輔助鑒定［7］。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，線粒體基因組在昆蟲系統(tǒng)學(xué)中的應(yīng)用越來越廣，它包含的遺傳信息量更大，對昆蟲系統(tǒng)進(jìn)化研究具有重要意義［8］。

線粒體具有獨(dú)立的遺傳物質(zhì)和體系，為半自主型細(xì)胞器，除了本身的細(xì)胞功能外，還參與細(xì)胞分化、信息傳遞和凋亡、調(diào)控細(xì)胞的增長速度和細(xì)胞周期的能力。昆蟲線粒體基因組為共價閉合的環(huán)狀DNA 分子，通常為15～18 kb 的長度，包含一條重鏈和一條輕鏈。昆蟲線粒體基因組共編碼37 個基因，分別為13 個蛋白編碼基因（PCGs），2 個核糖體RNA 基因（rRNAs）和22 個 轉(zhuǎn) 運(yùn)RNA 基 因（tRNAs）［9，10］。其中，13 個蛋白編碼基因是常用的昆蟲分子進(jìn)化研究標(biāo)記。

本研究選取盲蝽科14 個屬的代表物種，通過比較分析線粒體基因組中13 個蛋白質(zhì)編碼基因的密碼子使用情況、堿基組成，以及核苷酸進(jìn)化速率等序列特征，并基于最大似然法（ML）和貝葉斯法（BI）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，旨在為盲蝽科系統(tǒng)分類學(xué)研究提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1. 1 序列獲取

本研究選取盲蝽14 個屬的代表物種進(jìn)行昆蟲線粒體蛋白編碼基因進(jìn)行研究，所有序列均從NC?BI 數(shù)據(jù)庫（https//www ncbi. Nlm. nih. gov/）下載得到，詳細(xì)的序列信息見表1。

表1 本研究所用序列信息Table 1 List of sequence information in this study

1. 2 數(shù)據(jù)分析

利用Geneious 8. 0. 4 軟件［11］從線粒體基因組序列中抽提13 個蛋白編碼基因，統(tǒng)計(jì)起始和終止密碼子的使用情況。在MEGA7. 0［12］中打開不同物種的同一基因序列（同源序列），刪除序列末尾的終止密碼子后，將核苷酸序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列進(jìn)行Mus?cle 比對，保存比對后的整齊核苷酸矩陣序列。分別將蛋白編碼基因串聯(lián)成13 個蛋白編碼基因（PC?Gs）、重鏈編碼的蛋白編碼基因（PCGs-J）和輕鏈編碼的蛋白編碼基因（PCGs-J）3 個數(shù)據(jù)集。 在MEGA7. 0 中統(tǒng)計(jì)各基因和數(shù)據(jù)集的堿基組成、信息位點(diǎn)和密碼子使用情況。在DNAsp 6. 0 軟件［13］中計(jì)算13 個蛋白編碼基因的非同義替換率（non?synonymous substitution rate，Ka）和同義替換率（synonymous substitution rate，Ks），進(jìn)而統(tǒng)計(jì)每個基因的核苷酸進(jìn)化速率，即Ka/Ks 值。

為了研究盲蝽科昆蟲的親緣關(guān)系，選擇網(wǎng)蝽科1 種Pseudacysta perseae作為外群，基于最大似然法（ML）和貝葉斯法（BI）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用Par?titionFinder［14］分別對2 種建樹方法選擇最優(yōu)的分區(qū)和模型，對13 個蛋白編碼基因的3 位密碼子進(jìn)行劃分（表2）。ML 發(fā)育樹在RAxML-7. 0. 3［15］中生成，自展檢驗(yàn)值為1 000。BI 發(fā)育樹在MrBayes3. 2. 2［16］中運(yùn)行計(jì)算，運(yùn)行10 000 000 代，每1 000 代抽樣一次，舍去收斂前的樣本。

表2 系統(tǒng)發(fā)育分析采用的數(shù)據(jù)集分區(qū)和最優(yōu)模型結(jié)果Table 2 Subset partition and best optimal model of datasets for phylogenetic analysis

2 結(jié)果與分析

2. 1 核苷酸組成分析

盲蝽科昆蟲線粒體蛋白編碼基因序列中，A+T 堿基含量為75. 5%，呈明顯的AT 偏好性，具體占比 為T（43. 1%）＞A（34. 2%）＞G（12. 3%）＞C（12. 2%）。 13 個蛋白編碼基因中，除nad1、nad4、nad4L和nad5在N 鏈編碼外，其余9 個基因均在J鏈編碼。 PCGs-J 的堿基含量為T（51. 4%）＞A（26. 6%）＞G（13. 7%）＞C（8. 4%），PCGs-N 堿基含量為A（38. 9%）＞T（35. 1%）＞C（14. 6%）＞G（11. 4%），可以看出，N 鏈編碼基因的A+T 含量高于J 鏈。另外，在這13 個蛋白編碼基因中，atp8基因的A+T 含量最高（83. 4%），cox1基因的A+T含量最低（68. 8%）。

對PCGs、PCGs-J、PCGs-N 鏈和13 個蛋白編碼基因的AT、CG 偏向性進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)（表3）。PCGs和PCGs-N 鏈均為負(fù)偏向性，PCGs-J 則均為正偏向性。

表3 盲蝽科線粒體蛋白編碼基因的核苷酸組成Table 3 Nucleotide composition of the mitochondrial genome of Miridae

2. 2 序列信息位點(diǎn)分析

本研究對盲蝽科昆蟲13 個蛋白編碼基因的核苷酸和氨基酸串聯(lián)序列的信息位點(diǎn)進(jìn)行了分析。在核苷酸序列中，保守位點(diǎn)有4 958 個，約占42. 7%；變異位點(diǎn)有6 149 個，約占53. 0%；簡約信息位點(diǎn)有3 977個，約占34. 3%。在氨基酸序列中，保守位點(diǎn)有764 個，約占19. 7%；變異位點(diǎn)有2 846 個，約占73. 6%；簡約信息位點(diǎn)有1 910個，約占49. 4%。

2. 3 起始密碼子和終止密碼子的使用情況

本研究對盲蝽科14 屬代表物種的昆蟲線粒體蛋白編碼基因的起始和終止密碼子進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)（圖1、圖2）。 在起始密碼子使用中，密碼子ATG 和ATT 的使用頻率較高，而密碼子ATC 和ATA 的使用頻率相對較低。atp6和cox1的起始密碼子均為ATG，而且ATG 在cox3和cytb中的占比也很大。nad4L的起始密碼子全為ATT，而且在nad1、nad2、nad4和nad5中ATT 都有－很高的占比。cox2中起始密碼子的種類最豐富，其中ATC 使用頻率最高。

圖1 起始密碼子的使用情況Fig.1 Start codons usage of Miridae protein-coding genes

圖2 終止密碼子的使用情況Fig.2 Stop codons usage of Miridae protein-coding genes

在終止密碼子的使用中，密碼子TAA 和T 的使用頻率較高，而TAG 較少使用。nad6的終止密碼子均為TAA，且TAA 在atp6、cytb、nad1、nad2和nad4L中的使用頻率也很高。cox3的終止密碼子均為T，且T 在cox1、nad4和nad5中也很占優(yōu)勢。TAG 在atp8中的使用頻率最高，有11 個物種使用該終止密碼子。cytb和nad3的終止密碼子種類最豐富，且nad3對幾種終止密碼子的使用次數(shù)相對平均。

2. 4 同義密碼子相對使用頻率（RSCU）分析

本研究對蛋白編碼基因的RSCU 值統(tǒng)計(jì)分析（圖3）。密碼子使用頻率最高是UUA（L），其次為UCU（S）、GCU（A）和GUU（V）等，使用頻率相對較低為CGC（R）、GGC（G）和ACG（T）。在編碼氨基酸的同義密碼子中，第3 位點(diǎn)為A 或者T 的密碼子使用頻率較高。例如：編碼亮氨酸Leu（L）的同義密碼子中，密碼子UUA（RSCU=3. 18）使用頻率遠(yuǎn)高于UUG（RSCU=1. 15）；編碼異亮氨酸的同義密碼子中，密碼子AUU（RSCU=1. 6）使用頻率遠(yuǎn)高于密碼子AUC（RSCU=0. 4）。

圖3 同義密碼子相對使用頻率Fig.3 The codon usage of PCGs in Miridae mitogenomes

2. 5 同義替換率和非同義替換率

13 個線粒體蛋白編碼基因的核苷酸同義替換率（Ks）、非同義替換率（Ka）和Ka/Ks 值得統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖4。所有蛋白編碼基因的Ka/Ks 值都小于1，即同義替換率Ks 值都大于非同義替換率Ka 值，說明13 個蛋白編碼基因都受到了純化選擇的影響。對同義替換率Ks 來說，nad3的值最大，nad4的值最?。粚Ψ峭x替換率Ka 來說，atp8的值最大，cox1的值最小。Ka/Ks 的比較結(jié)果顯示，cox1的值最小，進(jìn)化速率最慢；atp8的值最大，進(jìn)化速率最快。

圖4 盲蝽科昆蟲蛋白編碼基因同義替換率及非同義替換率Fig.4 The Ka，Ks and Ka/Ks values of protein-coding genes of Miridae

2. 6 系統(tǒng)發(fā)育分析

以網(wǎng)蝽科Pseudacysta perseae為外群，采用13個線粒體蛋白編碼基因構(gòu)建了盲蝽科14 屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系?；谧畲笏迫环ǎ∕L）和貝葉斯法（BI）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致，且節(jié)點(diǎn)支持率均較高（PP=1. 00/BP＞73）。結(jié)果表明，整個系統(tǒng)發(fā)育樹分成3 支，網(wǎng)蝽科作為外群為一支，盲蝽亞科為一支，葉盲蝽亞科為一支。在盲蝽亞科中，狹盲蝽族Stenodemini 和盲蝽族Mirini 互為姐妹群關(guān)系，盲蝽族內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系為：（Apolygus+Lygus）+（Adel?phocoris+Creontiades）。葉盲蝽亞科中，葉盲蝽族沒有形成單系群，該類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系有待進(jìn)一步論證。

3 討論

昆蟲線粒體蛋白編碼基因，在適應(yīng)性進(jìn)化的過程中形成了本身獨(dú)有的一些特征，再加上其包含大量的遺傳信息，已成為昆蟲系統(tǒng)進(jìn)化和遺傳分化研究的重要分子標(biāo)記［17］。另外，昆蟲蛋白編碼基因在密碼子使用上也有一定的偏好性，不同基因的核苷酸進(jìn)化速率也有差別，這些信息對物種特殊功能進(jìn)化的研究有著重要的作用［18］。

盲蝽科線粒體基因組的結(jié)構(gòu)較保守，蛋白編碼基因的排列與其他異翅亞目昆蟲的原始排布一致。在密碼子的使用上，ATN 是盲蝽科線粒體蛋白編碼基因偏好使用的起始密碼子，沒有發(fā)現(xiàn)TTG 和GTG 起始密碼子。在終止密碼子的使用中，盲蝽科線粒體蛋白編碼基因使用TAA 和T 的頻率較高，不完整的終止密碼子在多聚腺苷酸化作用下，轉(zhuǎn)錄為mRNA 后補(bǔ)齊變成完整的終止密碼子［19］。同義密碼子使用頻率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，使用頻率較高的同義密碼子大部分以A/T 結(jié)尾，也從另一方面體現(xiàn)了線粒體基因組的高AT 特性［20］。同時，密碼子的偏好使用也體現(xiàn)了線粒體基因組的保守性［21］。盲蝽科昆蟲線粒體蛋白編碼基因的AT 含量高達(dá)75. 5%，顯著高于GC 的含量，ATGC 堿基含量不均衡。

13 個蛋白編碼基因中，有些基因進(jìn)化速率適中，適合作為DNA 條形碼分子標(biāo)記來鑒定物種，有些基因的進(jìn)化速率較快，可以作為種下階元的親緣關(guān)系研究［22］。對盲蝽科昆蟲的核苷酸進(jìn)化速率分析表明，cox1的進(jìn)化速率較慢，atp8的進(jìn)化速率最快，前者的同義替換率相對較高，說明在其進(jìn)化過程中受到了更強(qiáng)的純化選擇作用，與先前有關(guān)異翅亞目昆蟲的研究保持一致。

通過不同方法構(gòu)建的盲蝽科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，ML 和BI 發(fā)育樹均支持盲蝽亞科和葉盲蝽亞科的單系性，且盲蝽亞科中的狹盲蝽族Stenodemini 和盲蝽族Mirini 也為單系，與張樂采用支序分類研究盲蝽亞科的結(jié)果一致［23］。 葉盲蝽亞科中，葉盲蝽族Phylini 和奇盲蝽族Leucophoropterini 的單系性沒有得到支持，由于奇盲蝽族線粒體基因組數(shù)據(jù)太少，此結(jié)果有待進(jìn)一步論證。盲蝽科屬級階元系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究甚少，Wang 對其中5 屬的研究結(jié)果Nesidiocoris+ （Trigonotylus+ （Adelphocoris+（Apolygus+Lygus）））與本研究結(jié)果一致［24］。盲蝽科昆蟲的種類眾多，但是其體型小且柔弱，標(biāo)本極易破壞，所以相較異翅亞目其它類群，該科系統(tǒng)學(xué)研究相對薄弱，分子數(shù)據(jù)也積累較少。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，今后增加更多的線粒體基因組數(shù)據(jù)，將會對盲蝽科的分類和遺傳進(jìn)化有重要意義。

圖5 基于13 個PCG 基因構(gòu)建的盲蝽科系統(tǒng)發(fā)育樹（分支節(jié)點(diǎn)處所示為貝葉斯后驗(yàn)概率/Bootstrap 值）Fig.5 The phylogenetic tree of Miridae based on PCGs dataset.（Bayesian posterior Probability/ Bootstrap value on the left/right branch node）

4 結(jié)論

本研究選取盲蝽科2 亞科14 屬的代表物種，旨在對線粒體基因組中13 個蛋白質(zhì)編碼基因的堿基組成、密碼子使用以及核苷酸進(jìn)化速率進(jìn)行比較分析。盲蝽科線粒體蛋白編碼基因序列的堿基組成，具有明顯的AT 偏好性。在同義密碼子的使用中，第3 位是A/T 結(jié)尾的密碼子使用頻率較高。盲蝽科昆蟲都以ATN 作為起始密碼子，終止密碼子偏好使用TAA 密碼子。利用Ka/Ks 比值對比蛋白編碼基因的進(jìn)化速率差異，cox1的進(jìn)化速率最慢，atp8的進(jìn)化速率最快。ML 和BI 系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果一致，與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類基本一致。此項(xiàng)研究將為該科昆蟲的分子進(jìn)化信息增添有益的數(shù)據(jù)，同時也為后續(xù)的盲蝽科系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究奠定理論基礎(chǔ)。