張 維

（湖南省汨羅市畜牧水產(chǎn)服務(wù)中心，湖南 汨羅 414400）

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）屬于圓環(huán)病毒屬，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小的DNA病毒之一，但該病原對(duì)宿主的致病性很高[1]。斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征主要由PCV2感染引起，其臨床癥狀包括咳嗽、精神萎靡和呼吸困難等，但單獨(dú)感染的病死率較低[2]。值得注意的是，PCV2感染可導(dǎo)致病畜出現(xiàn)免疫抑制，這導(dǎo)致其它病原的混合感染較嚴(yán)重，給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也導(dǎo)致疫病的診斷與防控較為困難[3]。豬葡萄球菌是引起仔豬滲出性皮炎的主要病原，仔豬感染該病原的主要臨床癥狀包括消瘦、發(fā)熱、皮膚表面有紅斑或潰瘍等，影響患豬采食和健康成長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡[4]。豬葡萄球菌屬于機(jī)會(huì)致病菌，該病原廣泛存在于豬體表，其感染健康豬群一般不發(fā)病，但豬群因病原感染或其它因素造成抵抗力下降時(shí)會(huì)導(dǎo)致該病相關(guān)臨床癥狀出現(xiàn)，故在臨床上該病主要是散發(fā)，但我們也不能忽視其對(duì)生豬養(yǎng)殖造成的危害與損失[5]。

2020年9月初，湖南汨羅市某豬場(chǎng)部分仔豬持續(xù)發(fā)病，臨床癥狀主要包括滲出性皮炎、咳喘和體溫升高等，病死豬體表末端（如耳朵和四肢等）發(fā)紺，剖檢發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)腫大、腎臟有明顯出血點(diǎn)，遂該企業(yè)負(fù)責(zé)人采集病死豬肺臟、腎臟、淋巴結(jié)等組織樣品送至汨羅市畜牧水產(chǎn)服務(wù)中心進(jìn)行病原檢測(cè)，以期為相應(yīng)的疫病防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

豬病變組織（肺臟、淋巴結(jié)及腎臟）由汨羅市某豬場(chǎng)提供。豬場(chǎng)獸醫(yī)無(wú)菌采集組織樣品后進(jìn)行標(biāo)記，低溫送至汨羅市畜牧水產(chǎn)服務(wù)中心進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 主要材料及試劑

動(dòng)物組織DNA/RNA基因組提取試劑盒購(gòu)自于賽默飛科技有限公司，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×Taq PCR mix及DL 5 000 DNA Marker等產(chǎn)品均購(gòu)自于Tankera；藥敏紙片及相應(yīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)基為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

用于檢測(cè)豬瘟病毒（CSFV）、PCV2、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）及豬乙腦病毒（JEV）的特異性引物序列參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]，以上引物及細(xì)菌檢測(cè)16S rRNA基因序列通用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 病毒檢測(cè)

用滅菌眼科剪及手術(shù)刀切取少量組織，剪碎后置于離心管內(nèi)，加入少量滅菌PBS溶液和鋼珠后勻漿。將混合物高速離心，取200 μL上清液用于組織DNA/RNA基因組提取，其具體操作及注意事項(xiàng)均嚴(yán)格參考動(dòng)物組織DNA/RNA基因組提取試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)，提取的基因組保存于-80 ℃，采用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將基因組中的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，相應(yīng)的產(chǎn)物保存于-20 ℃，待檢。

采用PCR對(duì)組織樣品中病原核酸進(jìn)行檢測(cè)，其PCR反應(yīng)體系包含2×PCR mix 10.0 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA/cDNA模板1.0 μL及雙蒸水8.0 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。每次PCR反應(yīng)均設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，其中陽(yáng)性對(duì)照為檢測(cè)體系相應(yīng)陽(yáng)性樣品核酸，陰性對(duì)照為雙蒸水。PCR反應(yīng)結(jié)束后取5.0 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4 細(xì)菌分離及鑒定

1.4.1 細(xì)菌分離及革蘭氏染色鑒定 用滅菌接種環(huán)蘸取肺臟病變組織液接種于普通瓊脂培養(yǎng)基表面，37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18 h后觀察培養(yǎng)基表面是否生長(zhǎng)菌落，將單一菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。

1.4.2 細(xì)菌16S rRNA基因序列擴(kuò)增及分析 取單一菌落在營(yíng)養(yǎng)肉湯中擴(kuò)增，在37 ℃環(huán)境下震蕩12 h，其后用商業(yè)化試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。以基因組DNA為模板，其PCR體系和反應(yīng)條件與上述一致。PCR反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將陽(yáng)性產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。將返回序列進(jìn)行拼接，將序列粘貼在NCBI進(jìn)行核苷酸序列BLAST，分析該菌株序列與NCBI收錄不同病原序列的核苷酸序列同源性。

1.5 藥物敏感試驗(yàn)

采用K-B擴(kuò)散法對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)：將擴(kuò)增菌液稀釋至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度，取50 μL菌液涂布在普通瓊脂培養(yǎng)基表面，待菌液稍干后便可貼上16種含不同抗生素的紙片，每個(gè)培養(yǎng)基表面貼4個(gè)，將平板置于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，最后用卡尺測(cè)量不同紙片的抑菌圈直徑，根據(jù)說(shuō)明書(shū)判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)PCR法分別對(duì)組織樣品中PCV2、PRV、PPV、CSFV、PRRSV和JEV核酸進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)被檢測(cè)樣品中僅PCV2核酸陽(yáng)性（圖1），未檢出其它病原核酸。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

2.2 細(xì)菌分離及革蘭氏染色鑒定結(jié)果

將組織液接種于普通瓊脂培養(yǎng)基表面，18 h后發(fā)現(xiàn)平板表面生長(zhǎng)出濕潤(rùn)、光滑的圓形菌落；進(jìn)一步革蘭氏染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，為葡萄狀排列的球菌（圖2）。

圖2 分離菌株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

2.3 分離菌16S rRNA基因序列擴(kuò)增及分析

隨機(jī)挑選3個(gè)單一菌落在營(yíng)養(yǎng)肉湯中擴(kuò)增，分別提取基因組DNA后，以通用引物16S rRNA-F、16S rRNA-R擴(kuò)增其目的序列。PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖3所示，3個(gè)菌株擴(kuò)增PCR產(chǎn)物大小均為1 600 bp左右，與預(yù)測(cè)大小基本一致。將3個(gè)菌株P(guān)CR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序及拼接后，在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)菌株序列與GenBank收錄的豬葡萄球菌分離株（登陸號(hào)：CP030020.1）對(duì)應(yīng)序列同源性均高于99.8%，與其它菌株對(duì)應(yīng)序列同源性均低于98.0%，提示可將本次分離的菌株鑒定為豬葡萄球菌。

圖3 菌株16S rRNA序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

2.4 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

進(jìn)一步對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)頭孢唑林、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氟苯尼考、利福平、復(fù)方新諾明、萬(wàn)古霉素和新生霉素敏感，對(duì)頭孢克肟、氨芐西林、青霉素和氨曲南抗生素耐藥；對(duì)卡那霉素、氯霉素和氧氟沙星則中度耐藥。

3 討論

近年來(lái)，我國(guó)生豬養(yǎng)殖水平不斷提高，隨著養(yǎng)殖業(yè)對(duì)烈性傳染病防控意識(shí)的提高，目前對(duì)豬場(chǎng)豬瘟、偽狂犬病等危害嚴(yán)重的傳染病得到有效控制。然而，可導(dǎo)致豬群慢性消耗性疾病的病原仍然廣泛存在，其中PCV2可感染不同發(fā)育階段豬群，是導(dǎo)致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原之一，該病的流行對(duì)豬群健康造成巨大威脅[1]。此外，PCV2也是作為原發(fā)性感染導(dǎo)致繼發(fā)感染PRRSV、豬鏈球菌、豬葡萄球菌等的主要病原，這無(wú)疑給臨床診斷與疾病治療帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。

本研究對(duì)汨羅市某規(guī)?；i場(chǎng)疫情進(jìn)行病因診斷，在組織中檢測(cè)出PCV2核酸陽(yáng)性，同時(shí)分離出一株豬葡萄球菌，結(jié)合臨床診斷結(jié)果最終確診該場(chǎng)發(fā)生疫情主要是由PCV2和豬葡萄球菌混合感染所致，進(jìn)一步細(xì)菌耐藥性試驗(yàn)結(jié)果表明，本次分離菌株對(duì)頭孢唑林、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、慶大霉素和新生霉素等多種藥物敏感，這為后續(xù)該場(chǎng)對(duì)此病的防治提供了科學(xué)依據(jù)。