高愛萍

（江蘇省徐州市畜牧獸醫(yī)站 221000）

近幾年，隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)在各行各業(yè)得到廣泛應(yīng)用，PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡(jiǎn)稱，是上世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，該技術(shù)在體外可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量特定目的基因片段，通過DNA基因追蹤系統(tǒng)能迅速掌握體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達(dá)納米級(jí)，從而大大簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中通過熒光信號(hào)對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)的技術(shù)，在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，成為定量依據(jù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有敏感，快速，高通量，簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高等突出優(yōu)勢(shì)，目前已成為疫病流行病學(xué)調(diào)查中病原檢測(cè)及病原學(xué)診斷的常規(guī)操作技術(shù)之一。

隨著我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，及畜禽進(jìn)出口貿(mào)易的加大，動(dòng)物疫病也不斷發(fā)展，尤其是近幾年非洲豬瘟、小反芻獸疫、牛結(jié)節(jié)病等外來疾病的侵入，給傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷和流行病學(xué)調(diào)查帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，為應(yīng)對(duì)這一形式，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室診斷和流行病學(xué)調(diào)查中得以廣泛應(yīng)用。但該實(shí)驗(yàn)條件、技術(shù)要求高，目前雖然一部分基層實(shí)驗(yàn)室具備了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的資質(zhì)，也得到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部及省級(jí)主管部門通過不同方式的考核及授權(quán)，能開展實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)工作，但在實(shí)際檢測(cè)工作的各個(gè)環(huán)節(jié)仍存在很多影響因素，造成檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性的結(jié)果，筆者近幾年一直從事獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)工作，現(xiàn)參考相關(guān)資料，從實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)過程的不同環(huán)節(jié)、不同層面分析存在的影響因素，提出消除因素的方法。

1 人員方面

（1)從事PCR試驗(yàn)的檢測(cè)人員必須參加農(nóng)業(yè)農(nóng)村部或省級(jí)動(dòng)物疫病控制中心舉辦的PCR檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn)班，切實(shí)掌握PCR檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)原理、方法和步驟，經(jīng)考核合格后方可上崗操作，試驗(yàn)操作時(shí)嚴(yán)格按照PCR試驗(yàn)操作規(guī)程、檢驗(yàn)流程進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)。

（2)積極參加行業(yè)部門組織的培訓(xùn)及交流，不斷擴(kuò)充新知識(shí)，提高業(yè)務(wù)技術(shù)水平。

（3)積極參加上級(jí)業(yè)務(wù)部門組織的盲樣比對(duì)試驗(yàn)，不斷提高檢測(cè)技術(shù)能力和檢測(cè)技術(shù)水平。

2 實(shí)驗(yàn)室管理方面

（1)做好實(shí)驗(yàn)室建設(shè)管理，制定科學(xué)合理的實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)規(guī)章制度。主要包括實(shí)驗(yàn)室生物安全制度，實(shí)驗(yàn)室崗位責(zé)任制度，樣品的采集、運(yùn)輸、保存制度，儀器設(shè)備的使用、維護(hù)管理制度，實(shí)驗(yàn)室安全操作管理制度，實(shí)驗(yàn)室廢棄物處理制度，實(shí)驗(yàn)室清潔消毒制度，實(shí)驗(yàn)室試劑保存使用制度，實(shí)驗(yàn)室記錄、檢驗(yàn)報(bào)告的審核制度等。

（2)制定實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)操作流程，制定儀器、設(shè)備的使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序。主要包括生物安全柜的使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序，核酸提取儀的使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序，PCR儀的使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序，離心機(jī)的使用及維護(hù)程序，樣品的準(zhǔn)備及核酸提取操作程序，試劑配制操作程序等，以確保實(shí)驗(yàn)室的日常運(yùn)作符合試驗(yàn)要求，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，確保實(shí)驗(yàn)室的各項(xiàng)生物安全等。

（3)完善實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)記錄，主要包括藥品、試劑采購(gòu)、使用記錄，樣品收集、使用記錄，實(shí)驗(yàn)室的各項(xiàng)檢驗(yàn)原始記錄，儀器設(shè)備的使用及維護(hù)記錄，消毒記錄，廢棄物處理記錄，冰箱溫度記錄及檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告記錄等。

3 功能區(qū)布局方面

（1)依據(jù)熒光PCR試驗(yàn)檢測(cè)流程可將熒光PCR實(shí)驗(yàn)室分為配液區(qū)（核酸擴(kuò)增試劑的配制、分裝和保存)、樣品準(zhǔn)備區(qū)（樣品的登記、分裝；核酸的提取、保存和加樣)、核酸擴(kuò)增區(qū)(核酸擴(kuò)增、結(jié)果分析、登記及報(bào)告)3個(gè)完全獨(dú)立的區(qū)域，以防止交叉污染。整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)室需有一個(gè)整體的緩沖區(qū)，同時(shí)每個(gè)獨(dú)立的分區(qū)也應(yīng)有單獨(dú)的緩沖區(qū)。

（2)各區(qū)域的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)要設(shè)置合理，各緩沖區(qū)的排風(fēng)扇往外排氣，在實(shí)驗(yàn)區(qū)的外墻上和各扇門上安裝可調(diào)的回風(fēng)口，空氣通過回風(fēng)口向室內(nèi)換氣。

（3)試驗(yàn)區(qū)空氣流動(dòng)按配液區(qū)→樣品準(zhǔn)備區(qū)→核酸擴(kuò)增區(qū)單一走向，做負(fù)壓設(shè)計(jì)，使氣流定向流動(dòng)，避免擴(kuò)增產(chǎn)物回流造成污染，各區(qū)通過機(jī)械連鎖不銹鋼傳遞窗傳遞試劑和樣本。

4 儀器與設(shè)備方面

（1)根據(jù)需要，每個(gè)不同的區(qū)域應(yīng)配備相適應(yīng)的設(shè)備、儀器、耗材，且各個(gè)區(qū)域的設(shè)備、儀器、耗材應(yīng)無污染，并做明顯的標(biāo)記，各區(qū)不能混用。

配液區(qū)：超凈工作臺(tái)、合適量程的加樣槍，槍頭，冰箱，臺(tái)式低速離心機(jī)，混勻器，可移動(dòng)紫外燈，專用垃圾桶等。

樣品準(zhǔn)備區(qū)：生物安全柜，冰箱，全自動(dòng)核酸提取儀，合適量程的加樣槍，槍頭，臺(tái)式低速離心機(jī)，臺(tái)式高速離心機(jī)（冷凍及常溫)，混勻器，可移動(dòng)紫外燈，專用垃圾桶等。

擴(kuò)增區(qū)：實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀，通用電腦，自動(dòng)分析軟件，專用垃圾桶等，檢測(cè)設(shè)備必須符合標(biāo)準(zhǔn)PCR熒光實(shí)驗(yàn)室設(shè)置要求。

（2)所有儀器和設(shè)備均需嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和注意事項(xiàng)進(jìn)行使用，并定期進(jìn)行維護(hù)和校正。

5 規(guī)范操作方面

實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入工作區(qū)域應(yīng)按照單一的方向進(jìn)行各項(xiàng)操作工作，由配液區(qū)→樣品準(zhǔn)備區(qū)→核酸擴(kuò)增區(qū)，禁止由核酸擴(kuò)增區(qū)逆行至其他兩個(gè)區(qū)域。進(jìn)入不同區(qū)域需穿戴各區(qū)域?qū)Ｓ玫墓ぷ鞣?、手套、口罩、帽子，切忌從核酸擴(kuò)增區(qū)穿著工作服，戴手套和帽子逆行到核酸提取區(qū)；發(fā)現(xiàn)手套有污染時(shí)應(yīng)立即更換；試驗(yàn)完成離開工作場(chǎng)所時(shí)要脫掉手套，更換工作服。

5.1 試劑配制

配制擴(kuò)增試劑體系需在配液區(qū)的超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，所用耗材確保無污染，最好使用帶濾芯的加長(zhǎng)槍頭。選擇質(zhì)量好的EP管，加入反應(yīng)體系，各試劑在取用前應(yīng)先瞬時(shí)離心，確保管蓋上的試劑沉于管底；打開管蓋動(dòng)作要輕，吸取試劑要慢，吸樣盡量一次完成，忌多次抽吸，以防止管內(nèi)液體濺出或產(chǎn)生氣溶膠而污染環(huán)境。

5.2 樣品制備（核酸提取）

接收樣品時(shí)要確保樣品密封完好、編號(hào)清楚且具有唯一性，嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行加樣，操作時(shí)盡量少說話，所有操作需要在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，操作前后生物安全柜需要進(jìn)行紫外燈消毒，安全柜內(nèi)的物品要擺放整齊、便于操作。核酸提取后小心加入已加入反應(yīng)液的EP管中，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)對(duì)照，小心蓋緊蓋子，上機(jī)前混勻、離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底。

5.3 核酸擴(kuò)增區(qū)

上機(jī)前需檢測(cè)熒光PCR儀的各項(xiàng)指標(biāo)，確保儀器能正常運(yùn)行。

6 控制污染方面

由于極微量的核酸污染即可嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性的結(jié)果，因此，整個(gè)PCR試驗(yàn)過程始終保持“無核酸觀念”，時(shí)刻注意避免來自樣品、試劑及試驗(yàn)各個(gè)環(huán)節(jié)的操作污染，尤其防止形成的氣溶膠對(duì)環(huán)境造成污染。

（1)實(shí)驗(yàn)前對(duì)整個(gè)試驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行徹底消毒，包括環(huán)境、儀器設(shè)備耗材，工作服等。

（2)與試驗(yàn)無關(guān)的人員禁止入試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)，并減少不必要走動(dòng)，減少交叉污染。

（3)試驗(yàn)前后需用紫外線照射整個(gè)試驗(yàn)區(qū)域，時(shí)間不低于30min，并用含有效氯1000mg/L消毒劑擦拭儀器表面、工作臺(tái)和地面。

（4)整個(gè)PCR試驗(yàn)結(jié)束后，所有實(shí)驗(yàn)廢棄物尤其是核酸擴(kuò)增區(qū)的廢棄物必須先浸泡于含有效氯1000mg/L消毒劑中60min以上，經(jīng)高壓滅菌后按醫(yī)療垃圾廢棄物統(tǒng)一處理，同時(shí)清理實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)面，并用消毒劑擦洗干凈。

（5)實(shí)驗(yàn)室要經(jīng)常通風(fēng)換氣和消毒，以消除試驗(yàn)過程中產(chǎn)生的氣溶膠。

總之，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是一項(xiàng)靈敏度高且又快速的檢測(cè)技術(shù)，目前已成為獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室流行病學(xué)調(diào)查及疾病診斷的主要檢測(cè)技術(shù)，在實(shí)際操作中一定要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行操作，盡量消除影響檢測(cè)結(jié)果的因素，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，為動(dòng)物疫病防控提供科學(xué)依據(jù)。