馬亞光,龍宇，胡力，沈紅，劉利，林志國(guó)

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科四，哈爾濱 150001)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)是最常見(jiàn)的惡性原發(fā)性腦腫瘤，約占所有膠質(zhì)瘤的57%，占所有原發(fā)性惡性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的48%[1]。其預(yù)后差，復(fù)發(fā)率高，生存率低，5年生存率為4%～5%[2]。目前，GBM的有效治療方法仍為手術(shù)切除，術(shù)后再輔助放療、化療、免疫治療、光動(dòng)力治療、電場(chǎng)療法等，效果不理想。鑒于目前的有效治療方式，靶向治療可以作為GBM的有效治療策略之一。

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在不同的癌癥中常高水平表達(dá)，且其表達(dá)水平與癌癥進(jìn)展和不良預(yù)后呈正相關(guān)，EGFR的不同突變形式會(huì)導(dǎo)致癌癥的異質(zhì)性[3]，最常見(jiàn)的為表皮生長(zhǎng)因子受體Ⅲ型突變體(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ，EGFRvⅢ)，EGFR的突變常見(jiàn)于GBM，其中EGFRvⅢ在中GBM的編碼突變率約為50%，且高達(dá)28%～30%的GBM細(xì)胞上特異性存在EGFRvⅢ[4-5]。另有研究證明，EGFRvⅢ陽(yáng)性患者生存期較短[6]。EGFRvⅢ在25%～30%的GBM中表達(dá)，且只能在腫瘤組織細(xì)胞表達(dá)，這可能是EGFR基因擴(kuò)增重排最常見(jiàn)的結(jié)果[7]。然而，GBM的靶點(diǎn)機(jī)制尚不明確，導(dǎo)致相關(guān)靶向性治療效果不明顯。鑒于EGFRvⅢ在GBM的生長(zhǎng)中起促進(jìn)作用，現(xiàn)就GBM中EGFRvⅢ及其靶向治療研究進(jìn)展予以綜述。

1 EGFR的分子結(jié)構(gòu)功能

EGFR是一種分子量為170 000的跨膜蛋白，屬于酪氨酸激酶受體家族[8]。酪氨酸激酶受體家族成員具有相似的結(jié)構(gòu)，包括：①具有兩個(gè)富含半胱氨酸區(qū)域的胞外結(jié)構(gòu)域；②單個(gè)跨膜區(qū)域；③含有多個(gè)酪氨酸的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。EGFR由表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)家族的成員激活，包括EGF、雙調(diào)蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α、肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子和上皮調(diào)節(jié)蛋白[9]。這些因子的結(jié)合參與細(xì)胞分裂、存活及細(xì)胞死亡的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)和下游途徑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。EGFR家族是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，參與生長(zhǎng)因子細(xì)胞信號(hào)傳遞。在質(zhì)膜上，EGFR的磷酸化通過(guò)識(shí)別和結(jié)合Src同源區(qū)2和磷酸酪氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域到受體上的磷酸酪氨酸基序，導(dǎo)致多種效應(yīng)蛋白的募集。EGFR可以參與和調(diào)節(jié)許多信號(hào)通路，如磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)、RAS/促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和Janus激酶(Janus kinase，JAK)2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)[10-11]。在正常細(xì)胞中，EGFR通過(guò)配體誘導(dǎo)的受體二聚化和酪氨酸自磷酸化在GBM的細(xì)胞增殖中起作用。在腫瘤中，EGF與配體結(jié)合后通過(guò)受體磷酸化而激活受體酪氨酸激酶/RAS/PI3K通路，該信號(hào)通路的激活能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成和對(duì)局部組織侵襲[12]。

2 EGFRvⅢ在GBM中的形成機(jī)制

EGFR基因位于人類染色體7p11～13上，長(zhǎng)度約110 Kb。在GBM中，EGFR缺失包括EGFRvⅠ缺失(N端缺失)、EGFRvⅡ缺失(外顯子缺失14～15)、EGFRvⅢ缺失(外顯子缺失2～7)、EGFRvⅣ缺失(外顯子缺失25～27)、EGFRvⅤ缺失(外顯子缺失)[13]。在GBM中，最常見(jiàn)的為編碼野生型EGFR及其突變體EGFRvⅢ的擴(kuò)增。EGFRvⅢ突變導(dǎo)致野生型EGFR基因外顯因子2和7間801個(gè)堿基對(duì)的缺失，最終使胞外結(jié)構(gòu)域的6～273個(gè)氨基酸產(chǎn)生框內(nèi)截?cái)?，影響氨基酸二聚化及與配體的結(jié)合，因而不具有與EGF結(jié)合的能力[14]。這種突變?cè)谀[瘤表面形成特異性抗原表位，EGFRvⅢ的這種特性能有效避免在治療過(guò)程中對(duì)正常腦組織損害，故使其成為潛在治療靶點(diǎn)。EGFRvⅢ能夠在GBM中表達(dá)，還可能與野生型EGFR DNA擴(kuò)增相關(guān)，其能將突變基因轉(zhuǎn)移到缺乏這種改變的細(xì)胞中[15]；具有擴(kuò)增子的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，具有突變的細(xì)胞經(jīng)過(guò)染色體外DNA元素感染結(jié)果表明細(xì)胞中缺乏擴(kuò)增子，導(dǎo)致EGFRvⅢ中的細(xì)胞表達(dá)為陽(yáng)性，繼續(xù)維持細(xì)胞生長(zhǎng)[16]。研究證明，EGFRvⅢ僅在腫瘤表達(dá)，在正常組織中無(wú)法檢測(cè)到，因此EGFRvⅢ可以作為精準(zhǔn)靶點(diǎn)藥物治療的選擇對(duì)象[17]。

3 EGFRvⅢ表達(dá)與GBM的關(guān)系

根據(jù)世界衛(wèi)生組織膠質(zhì)瘤分級(jí)，GBM屬于Ⅳ級(jí)，惡性程度最高。在GBM中，約60%為原發(fā)性，其余則由低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤經(jīng)惡性轉(zhuǎn)化而來(lái)。Yang等[18]通過(guò)研究EGFRvⅢ對(duì)中國(guó)人腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的影響發(fā)現(xiàn)，在240例膠質(zhì)瘤患者中有73例檢測(cè)到EGFRvⅢ表達(dá)(中度陽(yáng)性和強(qiáng)烈陽(yáng)性)，且EGFRvⅢ的表達(dá)率越高，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，表明膠質(zhì)瘤級(jí)別與ERFGvⅢ表達(dá)水平呈正相關(guān)。此外，腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移不可避免地依賴或釋放基質(zhì)成分，均與基質(zhì)降解蛋白酶的蛋白水解酶活性增加有關(guān)，且它們?cè)谀z質(zhì)瘤中上調(diào)均與EGFR和EGFRvⅢ的上調(diào)有關(guān)，如EGFRvⅢ的表達(dá)與基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)密切相關(guān)，因?yàn)镋GFRvⅢ可通過(guò)激活膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular singal-regulated kinase，ERK)增加基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)來(lái)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性。

4 EGFRvⅢ介導(dǎo)的信號(hào)通路參與GBM發(fā)生的機(jī)制

4.1PI3K/Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、自噬和代謝中起關(guān)鍵作用[19]。該信號(hào)通路激活能使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸磷酸化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，并進(jìn)一步激活A(yù)kt和mTOR。激活的mTOR復(fù)合物2能通過(guò)磷酸化作用激活A(yù)kt信號(hào)通路，同時(shí)失去人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因主要抑制因子，失去抑制因子的Akt信號(hào)通路無(wú)法阻止磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸的去磷酸化進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路，導(dǎo)致Akt信號(hào)通路在細(xì)胞質(zhì)中無(wú)法重新定位，從而再一次激活A(yù)kt和mTOR[20-21]。另外，PI3K具有獨(dú)立p85調(diào)節(jié)亞基家族性激酶異二聚體，通過(guò)p85-p110復(fù)合物或RAS直接或間接激活PI3K/Akt通路[19]。而EGFRvⅢ參與該信號(hào)通路，因?yàn)镋GFRvⅢ具有配體和非依賴性酪氨酸激酶能夠以自磷酸化的方式激活PI3K，激活后的PI3K進(jìn)一步磷酸化Akt蛋白，激活A(yù)kt依次磷酸化下游通路分子，以調(diào)節(jié)代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成、運(yùn)動(dòng)和凋亡[6]。

4.2JAK/STAT信號(hào)通路 在GBM中，EGFRvⅢ在通過(guò)JAK-STAT信號(hào)通路促進(jìn)GBM形成機(jī)制中起重要作用。當(dāng)STAT被JAK磷酸化時(shí)，非活性胞質(zhì)STAT單體胞質(zhì)發(fā)生構(gòu)象變化，形成活性同二聚體、異二聚體或四聚體，激活的STAT可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，作為轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，EGFRvⅢ不能結(jié)合EGF配體或被EGF配體激活導(dǎo)致EGFR磷酸化，磷酸化的EGFRvⅢ被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中形成一個(gè)復(fù)合物，從而增強(qiáng)STAT3的磷酸化；同時(shí)，該研究還發(fā)現(xiàn)野生型EGFR和EGFRvⅢ細(xì)胞中的共同表達(dá)表型能增加STAT3和STAT5的磷酸化，并通過(guò)促進(jìn)腫瘤免疫抑制環(huán)境的形成，使其共同表達(dá)腫瘤惡性程度明顯高于單一受體表型[14]?？梢?jiàn)，EGFRvⅢ不僅具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自我更新、增殖和侵襲的作用，還起到腫瘤免疫抑制作用。

4.3RAS/MAPK/ERK信號(hào)通路 在所有信號(hào)網(wǎng)絡(luò)通路中，ERK是MAPK的家族成員，其是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是一種傳遞絲裂原的信號(hào)傳遞蛋白，而ERK/MAPK信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和分裂的核心[24]。由于EGFRvⅢ胞外域的缺失，其不能與EGF結(jié)合，僅能結(jié)合含有Src同源區(qū)2結(jié)構(gòu)域的生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2，促進(jìn)RAS蛋白激活，激活的RAS驅(qū)動(dòng)RAF-MAPK/ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)，同時(shí)信號(hào)通路中的ERK激活反過(guò)來(lái)磷酸化大量下游底物并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，以調(diào)節(jié)一系列蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[25-26]。

4.4Src家族激酶(Src family kinase，SFK)信號(hào)通路 研究發(fā)現(xiàn)，SFK、Fyn和Src是致癌EGFR信號(hào)的效應(yīng)因子，這些效應(yīng)因子能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和在體內(nèi)的存活，而EGFRvⅢ的表達(dá)導(dǎo)致酪氨酸磷酸化的激活，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)[27]。EGFRvⅢ(也稱為de2-7EGFR)在GBM中常與EGFR共同表達(dá)，它通過(guò)SFK依賴的Dock180磷酸化促進(jìn)腫瘤發(fā)生，Dock180是Rac1鳥嘌呤核苷酸交換因子，可激活Rac1，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲。同時(shí)，EGFRvⅢ還可誘導(dǎo)酪氨酸殘基722位點(diǎn)Dock180磷酸化，并刺激Rac1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致GBM細(xì)胞存活和遷移[28]。

5 EGFRvⅢ參與GBM的靶向性治療

目前，通過(guò)了解EGFR/EGFRvⅢ在GBM中的發(fā)生機(jī)制，已將EGFR/EGFRvⅢ作為一個(gè)理想的靶點(diǎn)，且針對(duì)EGFR/EGFRvⅢ靶點(diǎn)研制出多種治療方法，包括EGFR/EGFRvⅢ小分子抑制劑治療、EGFR/EGFRvⅢ抗體治療、EGFR/EGFRvⅢ介導(dǎo)相關(guān)疫苗治療、嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫治療(chimeric antigen receptors T-cell immunotherapy，CAR-T)等。

5.1EGFR/EGFRvⅢ小分子抑制劑治療 EGFR在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和抗凋亡中起重要作用，其在GBM中發(fā)生擴(kuò)增和表達(dá)；EGFRvⅢ是EGFR的一種活躍突變形式，驅(qū)動(dòng)GBM亞群生長(zhǎng)，使小分子靶向治療成為有效治療方案[29]。其中，第一代藥物EGFR抑制劑被設(shè)計(jì)為原位阻斷酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)EGFR/ATP結(jié)合位點(diǎn)，阻斷EGFR激活，代表藥物有吉非替尼、埃羅替尼和拉帕替尼[30]。由于酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)外顯子的突變不存在GBM患者中，故第一代藥物治療效果不明顯[10]。第二代藥物EGFR-酪氨酸激酶抑制劑被設(shè)計(jì)為不可逆的EGFR與其他ERBB家族成員酪氨酸激酶結(jié)合，代表藥物有阿法替尼，但目前關(guān)于第二代藥物治療GBM患者的有效劑量仍需進(jìn)一步臨床試驗(yàn)驗(yàn)證[31-32]。第三代藥物是一種不可逆抑制劑，具有抗EGFR突變體(T790M、L858R、外顯子19活性缺失)，同時(shí)保留野生型EGFR[33]。如第三代藥物羅西替尼正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，雖然T790M突變?cè)贕BM患者中并不常見(jiàn)，但仍可以作為一個(gè)備選靶點(diǎn)基因[34]。

5.2EGFR/EGFRvⅢ抗體治療 與野生型EGFR相比，EGFRvⅢ由于配體結(jié)合域缺失突變，其對(duì)L2結(jié)構(gòu)域抗體不敏感[35]。目前，臨床批準(zhǔn)針對(duì)EGFR的抗體包括西妥昔單抗、帕尼單抗和尼妥珠單抗。EGFRVⅢ靶向抗體包括西妥昔單抗、奈昔拖珠單抗、尼妥珠單抗，這些單抗均不能抑制EGFRvⅢ的激活，而帕尼單抗是唯一能夠同時(shí)消除EGFRvⅢ和野生型EGFR的抗體，導(dǎo)致p-S6信號(hào)通路受到抑制，從而在體內(nèi)外具有抗腫瘤活性[36]。由于血腦屏障作用，EGFR/EGFRvⅢ抗體治療GBM仍面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

5.3EGFRvⅢ介導(dǎo)相關(guān)疫苗治療 抗GBM疫苗(如Glio Vac)是一種滅活腫瘤細(xì)胞的復(fù)合物[37]。目前針對(duì)以EGFRvⅢ為靶點(diǎn)學(xué)者研究出主動(dòng)和被動(dòng)免疫的特異性疫苗，其中多肽疫苗在治療腫瘤過(guò)程中發(fā)揮免疫作用[38]。EGFRvⅢ是一種腫瘤抗原，且僅表達(dá)于腫瘤組織中，其能夠成為主動(dòng)免疫治療的目標(biāo)。ridopepimut(CDX-110)是經(jīng)過(guò)EGFRvⅢ氨基酸序列重新連接合成的由14-聚體肽組成的多肽疫苗，可以誘導(dǎo)EGFRvⅢ特異性的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，該疫苗的特異性可能與EGFRvⅢ在GBM細(xì)胞上的獨(dú)立表達(dá)有關(guān)[39]。由于ridopepimut的有效性和安全性，其能夠成為一個(gè)極具前景的GBM治療策略。

5.4CAR-T 嵌合抗原受體是人工融合蛋白，包括細(xì)胞外抗原識(shí)別域、跨膜域和細(xì)胞內(nèi)T細(xì)胞信號(hào)域。CAR-T是通過(guò)對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行修飾，導(dǎo)致T細(xì)胞表達(dá)腫瘤抗原的嵌合抗原受體，從而特異性識(shí)別腫瘤抗原，清除癌細(xì)胞，達(dá)到臨床緩解并根治腫瘤的目的[40]。在小鼠模型中，以EGFRvⅢ突變?yōu)榘袠?biāo)的嵌合抗原受體能夠識(shí)別并消除表達(dá)其靶點(diǎn)的細(xì)胞[41]。另一項(xiàng)Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)顯示，在表達(dá)EGFRvⅢ的惡性膠質(zhì)瘤患者中，使用嵌合抗原受體T細(xì)胞與抗EGFRvⅢ人139-scFv、CD28和4-1BB共同刺激結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示CAR-T無(wú)任何不良反應(yīng)[42]。一項(xiàng)測(cè)試?yán)们逗峡乖荏w治療以EGFRvⅢ為靶點(diǎn)的GBM患者，結(jié)果顯示其能夠提高患者生存率[40]。另有研究顯示，在膠質(zhì)瘤模型中發(fā)現(xiàn)嵌合抗原受體修飾免疫細(xì)胞能夠穿透血腦屏障，為GBM患者提供潛在的治療方案[43]。

5.5雙特異性T細(xì)胞銜接器(bispecific T-cell engagers，BiTEs)治療 BiTEs是一種通過(guò)基因工程改造的融合的二價(jià)單克隆抗體，可與兩個(gè)不同抗體的單鏈可變片段相互作用：一種抗體片段與T細(xì)胞結(jié)合，另一個(gè)片段與腫瘤細(xì)胞的抗原結(jié)合，同時(shí)結(jié)合腫瘤細(xì)胞上的抗原和T細(xì)胞上的表面分子來(lái)誘導(dǎo)腫瘤溶解[44]。Gardell等[45]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)篩選巨噬細(xì)胞分泌一種病毒編碼，針對(duì)功能性靶向性EGFRvⅢ的BiTE蛋白，能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞活化、增殖、脫顆粒和殺死抗原特異性腫瘤細(xì)胞。AMG 596是一種BiTEs免疫腫瘤治療方法，它由兩個(gè)單鏈可變片段組成，通過(guò)兩個(gè)單鏈可變片段與GBM細(xì)胞上的腫瘤特異性抗原、EGFRvⅢ和T細(xì)胞上的CD3結(jié)合，從而激活T細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞毒性物質(zhì)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞溶解[46]。雖然BiTE治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的應(yīng)用尚未進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但其抑制腫瘤的作用得到進(jìn)一步證實(shí)。

6 小 結(jié)

EGFRvⅢ獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)及相關(guān)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)通路為GBM的治療提供新靶點(diǎn)，目前隨著分子生物學(xué)發(fā)展，EGFR和EGFRvⅢ在GBM的作用中得到有效的驗(yàn)證。雖然對(duì)EGFR信號(hào)通路的理解取得明顯進(jìn)步，但是針對(duì)EGFR和EGFRvⅢ的治療未顯示明顯臨床獲益。且復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、低效率的血腦屏障穿透、腫瘤的異質(zhì)性和次級(jí)突變?cè)鰪?qiáng)了GBM的耐藥性。EGFRvⅢ靶向治療可能能有效殺死EGFRvⅢ陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞，但那些殘存下來(lái)的腫瘤細(xì)胞仍然依賴EGFR，應(yīng)采取新的組合療法針對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行治療。因此，未來(lái)應(yīng)全面了解EGFRvⅢ的分子結(jié)構(gòu)及相關(guān)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)通路，以為GBM提供更有效的聯(lián)合治療方案。