崔朝初，盧 娜，馮超麗，楊建波，郭志坤，王現(xiàn)偉

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南省醫(yī)用組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

隨著預(yù)防和治療手段的不斷提升，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的致死率逐漸降低，但其在全球范圍內(nèi)仍然嚴(yán)重威脅著人類的生命健康[1]。血液中的低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)是促進(jìn)AS發(fā)生、發(fā)展的最主要的因素之一[2]。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)是一種可溶性的分泌型絲氨酸蛋白酶，其能通過多種途徑調(diào)節(jié)LDL-C相關(guān)的生理活動(dòng)，如PCSK9可以促進(jìn)低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)的內(nèi)吞和降解，從而抑制LDLC從血液中的清除。PCSK9還能上調(diào)凝集素型氧化低密度脂蛋白受體-1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1)的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞攝取氧化型低密度脂蛋白膽固醇(oxidized LDL-C，ox-LDL-C)而形成泡沫細(xì)胞。因此，PCSK9是治療低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)介導(dǎo)的AS的重要靶標(biāo)[3-5]。目前，靶向PCSK9的抑制劑的研究和應(yīng)用已經(jīng)取得了可喜進(jìn)展，如Avelumab和Evolocumab已經(jīng)在臨床上應(yīng)用于AS的治療，此外還有多個(gè)抑制劑處在臨床前或臨床試驗(yàn)的研究中，并表現(xiàn)出強(qiáng)大的潛力[3,6-10]。本文主要綜述PCSK9的分子調(diào)節(jié)機(jī)制及其在AS中的作用，以及靶向PCSK9的抑制劑的研究現(xiàn)狀，旨在為靶向PCSK9藥物的研發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考。

1 AS的發(fā)病機(jī)制及LDL-C在AS中的作用

AS屬于慢性炎癥性疾病，是心肌梗死等心腦血管疾病的主要誘因[1]。高血脂、高血壓、高血糖和肥胖等因素均能誘導(dǎo)AS，這些因素常會(huì)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，并進(jìn)一步引起相關(guān)離子紊亂、脂質(zhì)沉積、血管平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞泡沫化等病變，從而誘發(fā)和促進(jìn)AS[11-14]。

血液中的LDL-C可以通過損傷的內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，EC)進(jìn)入血管內(nèi)膜。LDL-C被氧化成ox-LDL-C后，會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致血管EC的損傷，從而形成一個(gè)惡性循環(huán)。此外，血管EC還能分泌黏附分子，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞在受損處的聚集[15]，因此，AS病灶總是伴隨著高水平的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)樣受體家族蛋白3(NOD-like receptors family protein 3，NLRP3)。血管平滑肌細(xì)胞和免疫細(xì)胞也可以從血管腔和血管外膜側(cè)入侵血管壁。巨噬細(xì)胞通過細(xì)胞膜上的清道夫受體(scavenger receptor，SR)識(shí)別并吞噬LDL-C，從而形成泡沫細(xì)胞并合成蛋白聚糖、膠原和彈力蛋白。如果這些細(xì)胞或者細(xì)胞外基質(zhì)不能被及時(shí)清除，則會(huì)在EC下層形成脂質(zhì)紋或斑塊。而斑塊(尤其是纖維帽)的破碎是AS誘發(fā)急性心血管疾病的主要因素[13,16-18]。

2 PCSK9的作用及其活性調(diào)節(jié)機(jī)制

自從發(fā)現(xiàn)PCSK9與脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)后，PCSK9迅速成為治療AS的研究靶點(diǎn)[19-20]。PCSK9主要在肝臟內(nèi)合成并釋放至血液循環(huán)中。盡管腎臟、腸道、巨噬細(xì)胞和EC中也能合成少量的PCSK9，但這類PCSK9可能主要是用于自分泌或在細(xì)胞內(nèi)部起作用[4,21-23]。PCSK9的結(jié)構(gòu)含有信號(hào)肽、前體結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域和羧基末端結(jié)構(gòu)域。PCSK9酶原(相對(duì)分子質(zhì)量74 000)自我催化裂解并釋放出前肽(相對(duì)分子質(zhì)量14 000)，產(chǎn)生成熟的PCSK9(相對(duì)分子質(zhì)量60 000)并分泌至細(xì)胞外。PCSK9具有多種生物功能，可以調(diào)節(jié)血漿脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、肝再生、胰島素分泌、神經(jīng)發(fā)育以及腫瘤的免疫特性等?，F(xiàn)已證實(shí)，PCSK9在動(dòng)脈斑塊、心肌缺血、心肌梗死等心血管疾病中均起重要作用[10,24-25]。

PCSK9的表達(dá)受到包括炎癥因子、微RNA(microRNA,miRNA)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、線粒體DNA和非編碼RNA等多種因素的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白O3(forkhead box O3，F(xiàn)OXO3)/肝細(xì)胞核因子1α(hepatocyte nuclear factor 1α,HNF1α)、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1/2(sterol regulatory element-binding protein-1/2，SREBP-1/2)均能夠促進(jìn)PCSK9的轉(zhuǎn)錄。而miR-483-5p和成纖維細(xì)胞生長因子21(fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)可抑制PCSK9的表達(dá)[21,26-28]。

PCSK9的活性不僅依賴于其表達(dá)水平，還與其突變形式、剪切體形式以及翻譯后的修飾密切相關(guān)[19,29-31]，如PCSK9的 S127R和F216L突變?yōu)楣δ塬@得型突變，Y142X和C679X突變?yōu)槭Щ钚屯蛔僛19-29]。PCSK9還存在一種相對(duì)分子質(zhì)量為55 000的剪切體，且活性相對(duì)較低。此剪切體來源于細(xì)胞外弗林蛋白對(duì)已被分泌至細(xì)胞外的成熟的PCSK9的剪接。如果在細(xì)胞內(nèi)人為地過表達(dá)此剪切體，則其不能被分泌至細(xì)胞外，但仍能夠發(fā)揮降低LDLR的作用，其活性低于相對(duì)分子質(zhì)量為60 000的PCSK9[32]。

PCSK9的翻譯后修飾包括天冬酰胺(Asn533)的糖基化、酪氨酸(Tyr38)的硫化以及絲氨酸(Ser47/Ser688)的磷酸化等方式。PCSK9的磷酸化不僅能增強(qiáng)其與LDLR中表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)AB結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能力，還能上調(diào)PCSK9的分泌[30]。最近，有研究發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新的內(nèi)源性的能夠與PCSK9相互作用的蛋白，分別為A1AT、APOH和AMBP，其中A1AT 可能是PCSK9的內(nèi)源性抑制蛋白，而APOH和AMBP對(duì)PCSK9的作用還有待進(jìn)一步研究[33]。PCSK9還含有膜聯(lián)蛋白A2(annexin A2，AnxA2)、硫酸肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans，HSPG)和環(huán)化酶相關(guān)蛋白1(cyclase-associated protein 1，CAP1)等分子的結(jié)合位點(diǎn)。AnxA2能夠抑制PCSK9介導(dǎo)的LDLR的降解作用，HSPG結(jié)合PCSK9后能促進(jìn)PCSK9-LDLR復(fù)合體的形成，而CAP1則誘導(dǎo)PCSK9/LDLR 復(fù)合體進(jìn)入caveolae依賴的內(nèi)吞過程。因此，硫酸類肝素類似物或針對(duì)HSPG結(jié)合位點(diǎn)以及CAP1等分子結(jié)合位點(diǎn)的抑制劑都是潛在的PCSK9調(diào)節(jié)劑[31,34-35]。

3 PCSK9在AS中的作用

ABIFADEL等[19]研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9的2個(gè)功能獲得型突變(S127R和F216L)與家族性膽固醇疾病有關(guān)[19]。還有研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9的2個(gè)功能缺失型突變(Y142X和C679X)會(huì)降低血液中約40%的LDL-C[29]。LDL中的ApoB100結(jié)合LDLR形成復(fù)合物后，通過網(wǎng)格蛋白小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)化作用進(jìn)入細(xì)胞，隨后在酸性環(huán)境條件下，LDLR脫離復(fù)合物并重新返回到細(xì)胞膜上發(fā)揮作用，而LDL則在細(xì)胞內(nèi)被降解，這是LDL從血液中被肝臟清除的主要方式之一。細(xì)胞外的PCSK9可通過其C端與細(xì)胞膜上LDLR的細(xì)胞外EGF-A結(jié)構(gòu)域結(jié)合而形成復(fù)合物，通過網(wǎng)格蛋白小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)化作用進(jìn)入細(xì)胞。在酸性環(huán)境中，PCSK9與LDLR的結(jié)合作用進(jìn)一步增強(qiáng)，最終PCSK9與LDLR在溶酶體被降解。這抑制了LDLR從內(nèi)體到細(xì)胞膜的再循環(huán)過程。細(xì)胞膜上LDLR的減少導(dǎo)致肝臟清除LDL-C的能力減弱，因而血液中LDL-C水平升高。盡管PCSK9在細(xì)胞內(nèi)也能直接結(jié)合LDLR，但PCSK9主要是通過分泌至細(xì)胞外結(jié)合并促進(jìn)LDLR的降解[36-38]。此外，硫化氫能夠抑制PCSK9的表達(dá)，導(dǎo)致前體LDLR蓄積。這表明PCSK9不僅能促進(jìn)LDLR的降解，也參與了LDLR蛋白的成熟過程[39]。

PCSK9還能夠激活血小板并促進(jìn)腎上腺素誘導(dǎo)的血小板的聚集和血栓的形成[40-42]。PCSK9還可調(diào)控炎癥反應(yīng)，促進(jìn)多種促炎因子的表達(dá)，例如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-10和Arg1[33,43]。PCSK9的水平升高還能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)LDL-C的吞噬和泡沫細(xì)胞的形成，從而促進(jìn)AS的發(fā)生、發(fā)展[44]。NLRP3炎癥小體的激活能夠通過IL-1β上調(diào)AS斑塊中巨噬細(xì)胞和局部組織中PCSK9的分泌。因此，炎癥反應(yīng)和PCSK9之間形成正反饋循環(huán)，進(jìn)一步惡化AS[45-46]。

4 PCSK9抑制劑在AS中的研究進(jìn)展

由于PCSK9與LDLR的結(jié)合區(qū)域較小且平滑，導(dǎo)致靶向PCSK9抑制劑的研發(fā)難度較大。研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9酶原的成熟過程可能與其 366～383發(fā)卡結(jié)構(gòu)的開放有關(guān)，通過靶向上述發(fā)卡結(jié)構(gòu)，可以干擾PCSK9與LDLR的相互作用，從而達(dá)到降低血脂水平的效果[47]。當(dāng)處于有序狀態(tài)下，PCSK9的P′ helix被包裹在PCSK9的催化結(jié)構(gòu)域中。而P′ helix結(jié)構(gòu)域能夠從α螺旋轉(zhuǎn)換為非有序結(jié)構(gòu)，從而與化合物結(jié)合。因此，此結(jié)構(gòu)域也有望成為潛在的PCSK9抑制劑作用靶點(diǎn)[48]。早期的PCSK9抑制劑主要基于PCSK9與LDLR相互作用位點(diǎn)來設(shè)計(jì)，包括LDLR EGF-A或EGF-AB結(jié)構(gòu)域類似的蛋白或多肽、重組LDLR片段或者抗體[49]。此外，反義RNA、小干擾RNA(smal interfering RNA,siRNA)等基因干預(yù)手段和天然產(chǎn)物等也逐漸成為研究PCSK9抑制劑的熱點(diǎn)。

4.1 蛋白類抑制劑

4.1.1 單克隆抗體單克隆抗體主要是通過其結(jié)合PCSK9后干擾PCSK9與LDLR的相互結(jié)合而發(fā)揮作用，比如目前處于臨床試驗(yàn)1期的Ralpancizumab和MEDI4166[50-51]，處于臨床試驗(yàn)2期的MPSK3169A和LY3015014[52-53]，處于臨床試驗(yàn)3期的IBI306(臨床試驗(yàn)編號(hào)：NCT04031742)和AMG145[6]，以及已經(jīng)上市的Avelumab 和Evolocumab[3,8]。Avelumab和Evolocumab對(duì)沙坦類或其他類降脂藥物不敏感的患者同樣有效，且已被證實(shí)能夠有效降低心肌梗死和中風(fēng)等多種AS相關(guān)的心腦血管疾病的發(fā)病率[8]。而Bococizumab因其較強(qiáng)的免疫原性以及中和抗體的產(chǎn)生導(dǎo)致療效逐漸下降，被終止于3期臨床[54]。中國科學(xué)家研發(fā)的靶向PCSK9的單克隆抗體IBI306具有可以間隔較長時(shí)間給藥的優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)進(jìn)入2/3期臨床試驗(yàn)。此外，還有針對(duì)PCSK9的C末端結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)的抗體，在臨床前研究中也表現(xiàn)出了較好的效果，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[35]。靶向PCSK9的C端富含半胱氨酸和組氨酸的結(jié)構(gòu)域的抗體不影響PCSK9與LDLR的結(jié)合，但其可以將PCSK9滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，減少了PCSK9的分泌，從而達(dá)到降低血脂的效果[55]。

4.1.2 非抗體類蛋白藥物此類藥物包含普通肽類和類抗體支架蛋白藥物。SX-PCK9是PCSK9片段類似物，其與類抗體支架蛋白藥物BMS-962476、LIB003、Pep2-8和DS-9001a均是通過結(jié)合PCSK9而抑制PCSK9與LDLR相互作用[37,56-57]。類抗體支架蛋白藥物的作用原理類似于抗體與靶部位結(jié)合，但與傳統(tǒng)的抗體相比，其具有分子質(zhì)量更小、結(jié)構(gòu)更加簡單和更易穿透組織的特點(diǎn)[58]。BMS-962476是由相對(duì)分子質(zhì)量11 000的多肽與聚乙二醇共軛連接組成。連接聚乙二醇是為了增強(qiáng)其藥物代謝動(dòng)力學(xué)的特性[59]。LIB003是由含有PCSK9結(jié)合位點(diǎn)的類抗體與人血清白蛋白組成的融合蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量為77 000，且非常穩(wěn)定。臨床試驗(yàn)證實(shí)，LIB003在有效的劑量下比較安全且耐受性較好。目前LIB003已經(jīng)進(jìn)入3期臨床試驗(yàn)[60]。

4.1.3 疫苗由于大多數(shù)外源性單克隆抗體價(jià)格昂貴，導(dǎo)致患者的使用成本較高。為了克服上述困難，研究人員開發(fā)了針對(duì)PCSK9的疫苗，包括PCSK9Qβ-003、AT04A和AT06A[61-63]，AT04A和AT06A在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈且持久的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生靶向PCSK9的抗體，從而抑制PCSK9與LDLR的作用，且目前已經(jīng)開始1期臨床試驗(yàn)。其中AT04A表現(xiàn)出較好療效，能夠顯著降低血液中的脂質(zhì)水平、血管炎癥以及AS病灶的大小和數(shù)量，且無明顯不良反應(yīng)[61-62]。

4.2 小分子化合物抑制劑PF-06446846和PF-00932239(R-IMPP)為靶向PCSK9的口服小分子化合物，其能誘導(dǎo)80S核糖體延宕。PF-06446846能夠選擇性抑制PCSK9在核糖體的翻譯合成，達(dá)到降低血脂效應(yīng)[64-66]。PF-06815345可被羧酸酯酶1轉(zhuǎn)換為兩性離子活性藥物，通過非80S核糖體依賴性的方式導(dǎo)致PCSK9合成減少[66]。NYX-330、DRP、Nilotinib類及新近報(bào)道的一系列靶向PCSK9的環(huán)狀四聚體小分子化合物均可抑制PCSK9與LDLR之間的作用[7,10,36-37，67]。環(huán)狀四聚體小分子化合物作用于PCSK9的半數(shù)抑制濃度均小于1 nmol·L-1。但其在體內(nèi)抑制PCSK9的作用及安全性還有待進(jìn)一步研究[7]。此外，7030B-C5可以抑制PCSK9基因的轉(zhuǎn)錄，而四氫原小檗堿類化合物降低PCSK9的mRNA水平的作用機(jī)制尚有待深入研究[6,68]。

4.3 基因水平調(diào)節(jié)手段

4.3.1 反義RNA反義RNA通過與互補(bǔ)的 mRNA結(jié)合，抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄，翻譯或促進(jìn)mRNA的降解，從而抑制相應(yīng)蛋白的表達(dá)。反義RNA具有特異性強(qiáng)和應(yīng)用便捷的特點(diǎn)，因此其具有較好的應(yīng)用前景。多個(gè)研究報(bào)道顯示，靶向PCSK9的反義mRNA如ISIS 394814、BMS-844421、SPC5001和SPC4061，能夠有效抑制PCSK9的表達(dá)并升高LDLR的蛋白水平，導(dǎo)致LDL-C水平降低[69-72]。但此類藥物也存在潛在的安全性和不良反應(yīng)問題。盡管SPC5001的效果明顯優(yōu)于SPC4061，但因其會(huì)引起藥物注射部位紅疹和腎小管毒性等不良反應(yīng)而被終止了臨床試驗(yàn)[71]。目前Civi-00和ALN-PCS027(臨床試驗(yàn)編號(hào)分別為NCT04164888和NCT01437059)已經(jīng)處于1期臨床試驗(yàn)[72]。除了傳統(tǒng)的反義RNA外，剪接轉(zhuǎn)化寡聚核酸，比如hP872主要通過調(diào)節(jié)mRNA前體的不同剪切形式從而影響同一個(gè)蛋白不同剪切體的表達(dá)水平?；诓煌琍CSK9的剪切體對(duì)LDLR降解作用的差異，人為增加其非活性形式而抑制其活性剪切體的表達(dá)在臨床前研究中也表現(xiàn)出了一定的療效[73-74]。

4.3.2 小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)siRNA能夠通過降低PCSK9的mRNA水平，而抑制PCSK9的蛋白表達(dá)。1～3期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，給予靶向PCSK9的siRNA Inclisiran約2周后，PCSK9和LDL水平均明顯降低；Inclisiran 的療效還具有持續(xù)時(shí)間較長的特點(diǎn)，在注射180 d后仍表現(xiàn)出較好的抑制效果；Inclisiran的上市申請已于2019年底遞交至美國食品藥品監(jiān)督管理局[9-10],如果能夠獲得批準(zhǔn)，Inclisiran將會(huì)是首個(gè)且唯一的siRNA類降膽固醇藥物。此外，ALN-PCS02/ALN-PCS也已經(jīng)進(jìn)入1期臨床試驗(yàn)[75]。

4.3.3 CRISPR-Cas技術(shù)CRISPR-Cas技術(shù)可以從DNA水平上特異性地敲除、敲入或替換靶向序列，是改變基因表達(dá)和活性的強(qiáng)有力的工具。研究證實(shí)，以腺病毒為載體的靶向肝臟PCSK9 DNA外顯子的CRISPR-Cas9可以顯著降低小鼠血液中PCSK9的表達(dá)，升高LDLR，降低血液中LDL水平[76]。

4.4 天然產(chǎn)物多種天然產(chǎn)物具有抑制PCSK9和降低血脂的功能，且具有較好的安全性。表沒食子兒茶素沒食子酸酯、紫鉚花素和蘆薈大黃素能夠抑制SREBP-2、HNF1α或FOXO3介導(dǎo)的PCSK9的表達(dá)，導(dǎo)致LDLR升高和LDL降低[77-81]。黃連素及其同系物均能夠抑制PCSK9 mRNA的轉(zhuǎn)錄，但似乎不影響PCSK9與LDLR的結(jié)合作用[82]。而Pseurotin A不但能夠抑制PSCK9的表達(dá)和分泌，還能夠結(jié)合PCSK9ASP374，從而使其不能與LDLRHis306結(jié)合[49]。丹參酮ⅡA、姜黃素、異槲皮苷和白藜蘆醇等天然產(chǎn)物也被發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)節(jié)PCSK9的表達(dá)和分泌[83-85]。但目前大多數(shù)有關(guān)天然產(chǎn)物對(duì)PCSK9作用的確切機(jī)制還有待深入研究。

5 總結(jié)

綜上所述，PCSK9是目前公認(rèn)的治療AS的有效靶點(diǎn)。盡管現(xiàn)在已經(jīng)有多種形式的抑制劑，比如單克隆抗體、疫苗和小分子化合物通過降低PCSK9的表達(dá)或活性而發(fā)揮降低血脂的作用，并進(jìn)入臨床試驗(yàn)或臨床應(yīng)用，但目前已經(jīng)上市的靶向PCSK9的抑制劑僅有單克隆抗體，昂貴的價(jià)格和非口服的給藥方式嚴(yán)重制約著其進(jìn)一步的廣泛應(yīng)用；此外，潛在的耐藥性也會(huì)降低其臨床治療效果。因此，繼續(xù)研制價(jià)格低廉、易于口服、毒副作用小、半衰期長的PCSK9抑制劑，具有非常重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。此外，從天然產(chǎn)物中尋找特異性干擾PCSK9的表達(dá)或功能的化合物或開發(fā)特異性PCSK9的基因藥物和疫苗，也均有廣闊的潛在應(yīng)用前景。之前因?yàn)閷?duì)PCSK9的結(jié)構(gòu)和功能了解有限，所以研發(fā)直接靶向干擾PCSK9與LDLR相互作用的小分子抑制劑的難度較大。目前，越來越多的靶向PCSK9的位點(diǎn)被報(bào)道，為小分子抑制劑的研發(fā)提供了更多的潛在位點(diǎn)。但關(guān)于PCSK9的結(jié)構(gòu)和活性調(diào)節(jié)及其與LDLR的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，這將為靶向PCSK9抑制劑的研發(fā)提供新的靶點(diǎn)和思路。