鄒俊康，鮑宗必，楊啟煒，張治國(guó)，任其龍，楊亦文

（1 浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，生物質(zhì)化工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310027；2 浙江大學(xué)衢州研究院，浙江 衢州 324000）

甘油磷酰膽堿的全名為L(zhǎng)-α-甘油磷酰膽堿（L-α-glycerylphosphorylcholine，GPC），是人體內(nèi)卵磷脂分子上的兩條脂肪酸鏈水解后的產(chǎn)物[1]。早在1945 年Schmidt 等[2]便從牛的胰臟中提取出了GPC 粗品，第一次確認(rèn)了GPC 的結(jié)構(gòu)。由于其結(jié)構(gòu)特性，GPC有助于細(xì)胞膜磷脂的合成，從而增強(qiáng)細(xì)胞膜的流動(dòng)性，同時(shí)還會(huì)對(duì)脂質(zhì)代謝產(chǎn)生積極影響[3]。

GPC能夠穿過(guò)血腦屏障，為神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的合成提供原料，從而提高海馬體中乙酰膽堿的水平，有效地改善人體膽堿狀態(tài)[4]，并且通過(guò)增加神經(jīng)細(xì)胞的形成、減少神經(jīng)元的死亡來(lái)支持大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的功能[5-6]，提升大腦認(rèn)知能力[7]。此外，GPC能提高基因的表達(dá)水平，預(yù)防由衰老造成的認(rèn)知功能下降[8]，這也使得GPC 在治療阿爾茲海默癥[9-10]、健忘癥[11]、腦缺血型中風(fēng)[12]等精神性疾病上有明顯的效果。Strifler等[13]證實(shí)GPC是一種靶向線粒體的化合物，能夠減少嚙齒動(dòng)物體內(nèi)自由基含量，減輕缺血再灌注引起的損傷和炎癥反應(yīng)[3,14]，具有改善心血管疾病的作用[15]。Szabó等[16]發(fā)現(xiàn)GPC能降低輻射誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)損傷和致死性，顯示出防輻射的作用。Izu 等[17]發(fā)現(xiàn)GPC 與S-腺苷蛋氨酸同時(shí)使用能夠降低糖尿病模型小鼠的血糖，顯示出治愈糖尿病的可能性。

GPC被認(rèn)為是無(wú)毒且安全的化合物[18]，不僅具備治愈各種疾病的潛力，還被廣泛應(yīng)用于食品、保健品和化妝品等行業(yè)，展現(xiàn)出良好的市場(chǎng)前景[19]。但是，國(guó)內(nèi)高純度藥用GPC 幾乎全部依賴進(jìn)口。為進(jìn)一步促進(jìn)GPC 相關(guān)產(chǎn)品的研究，本文綜述了最近幾年來(lái)GPC 的研究現(xiàn)狀，重點(diǎn)介紹了GPC 的分析、制備和純化技術(shù)的研究進(jìn)展。

1 GPC的分析方法

早在1990 年，意大利就有GPC 上市，波蘭、阿根廷、韓國(guó)、俄羅斯等國(guó)家也陸續(xù)上市了該藥品。但在國(guó)內(nèi)，GPC作為一種三類新藥，還沒(méi)有上市。在研究GPC 及其相關(guān)產(chǎn)品時(shí)，建立全面的分析檢測(cè)方法至關(guān)重要。趙艷艷[20]采用核磁共振波譜（NMR）、質(zhì)譜（MS）、紅外光譜（IR）、紫外光譜（UV）等光譜學(xué)技術(shù)系統(tǒng)地測(cè)定了GPC的光譜學(xué)數(shù)據(jù)，確定了GPC 的結(jié)構(gòu)及化學(xué)位移歸屬（圖1）。這些傳統(tǒng)方法能定性分析GPC 的存在與否，但無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)出GPC 的含量。分析檢測(cè)得到GPC 濃度和純度對(duì)于探究其產(chǎn)品的質(zhì)量更為重要，因此，下面將從薄層色譜法、核磁共振譜法、滴定法和液相色譜法來(lái)綜述GPC的定量分析方法。

圖1 GPC的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其化學(xué)位移歸屬[20]

1.1 薄層色譜法

薄層色譜由于其操作簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，通常被用作一種定性檢測(cè)方法，用于判斷待測(cè)物是否存在。為測(cè)定磷酰膽堿酯交換反應(yīng)所制備的GPC 含量，杜旭佳[21]用硅膠粉和甲基纖維素鈉混合物作為固定相，用5mol/L 的氨水和正丙醇的混合液作為展開(kāi)劑，按照正丙醇、氨水體積比13∶7配制。經(jīng)過(guò)點(diǎn)樣、展開(kāi)和染色后使用Adobe Photoshop 軟件對(duì)斑點(diǎn)的表面積進(jìn)行計(jì)算，以GPC濃度為橫坐標(biāo)，斑點(diǎn)面積為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而測(cè)定GPC的濃度。但此方法對(duì)斑點(diǎn)表面積的計(jì)算誤差大，使所測(cè)得GPC 的濃度不準(zhǔn)確，可作為中控方法，判斷反應(yīng)過(guò)程中是否有GPC的生成。

1.2 核磁共振譜法

核磁共振譜法是對(duì)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性分析的強(qiáng)有力工具，Billadello等[22]利用核磁共振磷譜定量分析了組織中的GPC 含量，此方法可以有效測(cè)定組織中GPC 的含量，且回收率較高，但此方法檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)太大，導(dǎo)致所測(cè)得含量誤差大。為準(zhǔn)確分析大豆卵磷脂水解產(chǎn)物中各雜質(zhì)的含量，杜章斌等[23]利用核磁共振氫譜法準(zhǔn)確定位了GPC、卵磷脂（PC）和溶血磷脂（LPC）的特征質(zhì)子峰，并根據(jù)每個(gè)特征性質(zhì)子峰的相對(duì)面積與物質(zhì)的量的對(duì)應(yīng)關(guān)系計(jì)算出三種物質(zhì)的相對(duì)含量，此方法可有效避免樣品中水分對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，使測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確。但核磁共振氫譜的圖譜較為復(fù)雜，并且測(cè)量特征性質(zhì)子峰的峰面積存在誤差，使得所測(cè)量的GPC含量不夠準(zhǔn)確。為提高測(cè)量的準(zhǔn)確率，黎玲玲等[24]成功建立核磁共振磷譜定量法，以磷酸三苯酯為內(nèi)標(biāo)，以MEOD-d4作溶劑，以（樣品/內(nèi)標(biāo)）的質(zhì)量比為橫坐標(biāo)，NMR 峰面積比為縱坐標(biāo)，建立零截距標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而測(cè)定藥品中GPC 的絕對(duì)含量。該方法簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確可靠，物質(zhì)鑒定和定量分析可以同步完成。

GPC作為一種手性藥物，其兩種對(duì)映異構(gòu)體的生物利用度、代謝率，代謝產(chǎn)物以及毒性可能存在顯著差異，所以測(cè)定GPC 產(chǎn)品的光學(xué)純度是至關(guān)重要的。De Ferra 等[25]將GPC 的對(duì)映異構(gòu)體與手性硼酸在二甲基亞砜中進(jìn)行反應(yīng)（圖2），形成兩種都含有兩個(gè)手性中心的非對(duì)映體硼酸酯，通過(guò)1H NMR 光譜觀察到這兩種非對(duì)映體硼酸酯的膽堿甲基和芐甲基所對(duì)應(yīng)的化學(xué)位移不同，從而根據(jù)相應(yīng)特征峰面積大小計(jì)算出L-α-GPC 對(duì)映體的光學(xué)純度。核磁共振譜法可用于GPC 的鑒定，也可用于測(cè)定最終得到的GPC產(chǎn)品的光學(xué)純度。

圖2 手性硼酸與外消旋GPC的反應(yīng)[25]

1.3 滴定法

《美國(guó)藥典2019》[26]采用直接滴定法來(lái)檢測(cè)從PC中提純的GPC，0.1mol/L高氯酸的乙酸溶液作為滴定劑，采用電位法判斷滴定終點(diǎn)，并計(jì)算消耗的滴定劑體積，用式(1)計(jì)算GPC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)P。

式中，VS為GPC 樣品滴定達(dá)到終點(diǎn)時(shí)消耗滴定劑的體積，mL；VB為空白滴定終點(diǎn)消耗滴定劑的體積，mL；NA為滴定劑的標(biāo)準(zhǔn)濃度，mEq/mL；F為等效系數(shù)，257.2mg/mEq；W為樣品質(zhì)量，mg。并規(guī)定計(jì)算值在98%～102%為GPC的合格標(biāo)準(zhǔn)。

劉丹等[27]采用非水電位滴定法，將高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液作為滴定劑，對(duì)GPC 樣品進(jìn)行滴定，計(jì)算滴加滴定劑的體積V和所測(cè)量的電壓E，將一系列V、E值進(jìn)行二級(jí)微商處理，用式(2)所示的內(nèi)插法計(jì)算滴定劑的用量。

式中，Vφ為滴定終點(diǎn)時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量，mL；Va為二級(jí)微商為a時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量，mL；a為二級(jí)微商為零前的二級(jí)微商值；b為二級(jí)微商為零后的二級(jí)微商值；ΔV為二級(jí)微商為a至二級(jí)微商為b所加標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL。

采用二級(jí)微商法計(jì)算滴定劑的體積更為準(zhǔn)確，求出的GPC 含量更為準(zhǔn)確，但是此方法在制備GPC樣品時(shí)用到了乙酸汞。黃祥元等[28]用乙酸代替乙酸汞溶液加入到GPC 樣品中，這樣既避免使用汞鹽，所得到的滴定突躍現(xiàn)象也更明顯。滴定法測(cè)量精度高，常用于提純得到的GPC 產(chǎn)品含量的測(cè)定，但是其檢測(cè)成本高、操作復(fù)雜，樣品中少量的酸性物質(zhì)也會(huì)引起誤差。

1.4 液相色譜法

在定量分析GPC 含量時(shí)，高效液相色譜法是最常用的一種方法。劉狄等[29]采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法（HPLC-ELSD），采用硅膠上鍵合1,2-二羥基丙基官能團(tuán)的Diol 正相硅膠柱為分析柱，甲醇-水為流動(dòng)相，檢測(cè)了不同磷脂中PC 和GPC 的含量。但此方法的流動(dòng)相中含有極性強(qiáng)的水，長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)Diol正相柱造成損害，降低色譜柱的柱效，對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響。杜章斌等[30]采用Alltech Silica色譜柱，甲醇為流動(dòng)相，檢測(cè)了PC水解液中的GPC 含量，此方法避免了極性強(qiáng)的水對(duì)色譜柱的傷害，增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

Kielbowicz等[31]開(kāi)發(fā)了一種高效液相色譜-電噴霧檢測(cè)器（HPLC-CAD）的檢測(cè)方法，采用硅烷基配體官能化的球形硅膠作為固定相，乙腈-甲醇-10mmol/L 乙酸銨溶液作為流動(dòng)相，此方法有效檢測(cè)了PC、LPC 和GPC 的含量，但CAD 檢測(cè)器的基線不平穩(wěn)，雜峰很多，檢測(cè)結(jié)果誤差大。

為更準(zhǔn)確檢測(cè)PC 水解產(chǎn)物中GPC 及相關(guān)雜質(zhì)的含量，《美國(guó)藥典2019》[26]采用液相-示差折光法（LC-RID）和LC-ELSD 聯(lián)用來(lái)檢測(cè)提純物中雜質(zhì)的含量。LC-RID 是為了檢測(cè)GPC 提取物中甘油的含量，色譜柱為L(zhǎng)14 柱（10μm 硅膠化學(xué)鍵合強(qiáng)堿性季銨鹽陰離子交換固定相），流動(dòng)相為乙腈-水，測(cè)得甘油和GPC 的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.6 和1.0，并且規(guī)定甘油含量小于0.5%為合格。LC-ELSD 法是為了檢測(cè)GPC 提取物中的其余有機(jī)雜質(zhì)，流動(dòng)相按照以下方法配制，并按照表1中的時(shí)間進(jìn)行梯度洗脫，可有效檢測(cè)出GPC 提取物中各有機(jī)雜質(zhì)的含量。

表1 流動(dòng)相比例及其洗脫時(shí)間

為檢測(cè)化學(xué)合成的GPC 及相關(guān)雜質(zhì)的含量，傅超婷等[32]采用二元梯度洗脫程序，選取蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，以甲酸銨的乙腈溶液作為流動(dòng)相對(duì)GPC待測(cè)樣品進(jìn)行第一液相色譜檢測(cè)，用陽(yáng)離子交換色譜柱，檢測(cè)出雜質(zhì)甘油磷酰肌醇（GPI）、氯化膽堿和甘油的含量；以乙腈-水為流動(dòng)相對(duì)GPC待測(cè)樣品進(jìn)行第二液相色譜檢測(cè)，用氨基鍵合硅膠色譜柱，檢測(cè)出雜質(zhì)甘油磷酰乙醇胺（GPE）的含量。這種方法能全面有效地檢測(cè)GPC 樣品中雜質(zhì)的含量，能夠更好地控制GPC 產(chǎn)品的質(zhì)量。但此方法操作較為麻煩，需要切換兩次色譜柱和兩次流動(dòng)相。陳東英等[33]利用極性硅膠柱作為色譜柱，甲醇-乙腈-緩沖鹽溶液為流動(dòng)相，采用示差折光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器或質(zhì)譜檢測(cè)器，能很好地檢測(cè)出磷脂、膽堿、氯化磷酰膽堿（PC-Cl）和GPC的含量，并且各有關(guān)物質(zhì)的分離度均大于1.5，峰形良好。液相色譜法是最常用的定量分析方法，可測(cè)定反應(yīng)液中GPC 及其相關(guān)雜質(zhì)的含量，還可以測(cè)定提純后得到的GPC產(chǎn)品的純度。

目前國(guó)內(nèi)沒(méi)有GPC 相關(guān)藥物、保健品、食品和化妝品的生產(chǎn)，只有生產(chǎn)GPC 原料藥的廠家，所以國(guó)內(nèi)沒(méi)有對(duì)GPC 的質(zhì)量規(guī)定。國(guó)際市場(chǎng)上，用于藥品、食品和保健品中的GPC 都是高純度的GPC，其質(zhì)量要求可參考美國(guó)藥典?；瘖y品中添加的GPC暫時(shí)沒(méi)有相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

《美國(guó)藥典》對(duì)GPC 的質(zhì)量要求如下：①滴定法計(jì)算得到GPC 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在98%～102%之間；②乙酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.1%，氯化物質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.02%，硫酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.02%，磷酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.005%、甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.5%。松醇、β-GPC、蔗糖、絲氨酸、GPE的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都小于0.1%；③0.1g/mL 的GPC 溶液的旋光度在-2.4～-2.8 之間；④細(xì)菌總數(shù)不超過(guò)1000cfu/g，霉菌和酵母菌的總數(shù)不超過(guò)100cfu/g；⑤8.5g/100mL 或10g/100mL 的GPC 溶 液 的pH 在5.0～7.0 之 間；⑥GPC 固體水分含量小于1.0%，GPC 水溶液的水含量為14%～16%。

對(duì)各種分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了比較分析，如表2所示。在反應(yīng)過(guò)程中，可將薄層色譜法作為中控方法快速判斷反應(yīng)中是否有GPC 生成；進(jìn)行定量分析時(shí)，液相色譜法是最常用的方法，可測(cè)定反應(yīng)液中GPC 的濃度，從而計(jì)算反應(yīng)收率。在分析提純所得GPC 產(chǎn)品的質(zhì)量時(shí)，其含量可用高精度的滴定法來(lái)測(cè)定，其相關(guān)雜質(zhì)的含量可用液相色譜法測(cè)定。但沒(méi)有一種檢測(cè)器能檢測(cè)出GPC 產(chǎn)品相關(guān)的全部雜質(zhì)，對(duì)于縮水甘油、氯甘油這類有機(jī)雜質(zhì)，需要RID 檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)；對(duì)于GPE、GPI 這類雜質(zhì)，需要ELSD檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)。所以，多種檢測(cè)器聯(lián)用才能有效測(cè)定GPC 中相關(guān)雜質(zhì)的含量，進(jìn)一步判斷GPC的質(zhì)量是否符合要求。

表2 不同分析方法的比較

2 GPC的制備方法

GPC天然存在于生物物質(zhì)中，所以早期是通過(guò)分離純化技術(shù)從生物物質(zhì)中提取GPC 的。1945 年Schmidt 等[2]便從牛的胰臟中萃取、純化得到了GPC，并確定其結(jié)構(gòu)由膽堿和α-甘油磷酸組成的。但是生物物質(zhì)中GPC 含量極低，直接提取非常困難，產(chǎn)量很低。目前制備GPC 主要有水解磷脂類化合物和全化學(xué)合成兩種方法。

2.1 水解磷脂類化合物

工業(yè)上采用水解法制備GPC 的原料為大豆磷脂粉末或蛋黃粉，兩者的主要成分都是PC，PC的sn-1 脂肪酸?；凰獾玫絪n-2-溶血磷酰膽堿（sn-2-LPC），再經(jīng)過(guò)酰基自動(dòng)轉(zhuǎn)移得到sn-1-溶血磷酰膽堿（sn-1-LPC），最后水解掉剩余的脂肪酸?；傻玫紾PC，其反應(yīng)如圖3。

圖3 PC水解的反應(yīng)過(guò)程[34]

2.1.1 化學(xué)催化水解法

水解PC 常用的化學(xué)催化劑有金屬鈉、醇鈉[35-36]，化學(xué)催化水解的制備工藝簡(jiǎn)單，容易規(guī)?；a(chǎn)，但GPC 的收率很低。PC 在離子交換樹(shù)脂[37]的催化下醇解的效果較好，但離子交換樹(shù)脂再生困難，并產(chǎn)生大量廢水，不適合工業(yè)應(yīng)用。為解決這些問(wèn)題，Li等[38]考察了12種低沸點(diǎn)胺類催化劑的催化效果，發(fā)現(xiàn)在叔丁胺的催化下，PC 的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到98%以上，并且這類低沸點(diǎn)催化劑可以在旋蒸回收甲醇時(shí)被同步回收，可實(shí)現(xiàn)重復(fù)利用。

但是，這些化學(xué)催化劑毒性較大，最終得到的GPC 產(chǎn)品中仍然會(huì)有少量殘留，使得GPC 產(chǎn)物的安全性存在問(wèn)題。為了找到更好的催化劑，Li等[39]采用400℃下煅燒的硅酸鈉作為催化劑，在甲醇中催化PC 的水解，PC 最高轉(zhuǎn)化率能達(dá)到99.5%。由于硅酸鈉無(wú)毒，易于從人體排泄，所以可以作為生產(chǎn)GPC的良性催化劑。

2.1.2 生物酶水解法

與化學(xué)催化劑相比，生物酶的毒性更小，也更安全，具備用量少、催化效率高和易于回收等特點(diǎn)。此方法得到的GPC 適合用于藥物、食品和保健品等口服產(chǎn)品中，是PC水解反應(yīng)中研究的熱點(diǎn)。

Zhang 等[40]用磷脂酶A1（PLA1）作催化劑并加入輔助因子CaCl2增強(qiáng)PLA1的活性，GPC 的產(chǎn)率能達(dá)到94.5%。為進(jìn)一步提高產(chǎn)率，Zhang 等[41]繼續(xù)用Thermo4S-3 作為生物催化劑，并用響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳反應(yīng)條件，將GPC 的最大產(chǎn)率提高到96.8%。但是，在水相體系中，PC的溶解度非常有限，導(dǎo)致GPC 的生產(chǎn)效率很低，難以在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用。為解決上述問(wèn)題，Lu 等[34]使用Tween 20作為表面活性劑來(lái)改善PC 在水相中的溶解度和分散性，大大縮短了反應(yīng)時(shí)間并提高了GPC的產(chǎn)量。

由于PC 在雙相介質(zhì)中的溶解度比在水中大得多，Bang 等[42]則考慮用雙相介質(zhì)來(lái)提高PC 的溶解度，以PLA1為生物催化劑在水-己烷的雙相介質(zhì)中催化PC 水解，使得GPC 的生產(chǎn)效率得到提高。但是，此方法的反應(yīng)時(shí)間為30h，反應(yīng)進(jìn)行過(guò)于緩慢，不適用于工業(yè)生產(chǎn)。Kielbowicz等[31]研究發(fā)現(xiàn)，堿性pH 環(huán)境可以同時(shí)促進(jìn)?；w移和水解過(guò)程，為了進(jìn)一步提高PLA1的催化效率，Li等[43]成功開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單的共沉淀方法將PLA1封裝在金屬表面活性劑納米復(fù)合材料（MSNC）中，并利用堿性的2-甲基咪唑（2-Melm）對(duì)這種材料進(jìn)行改性，得到催化活性增強(qiáng)的2-Melm@PLA1/MSNC 催化劑（圖4）。這種復(fù)合材料具有堿性和兩親性，能夠使?；D(zhuǎn)移和酶水解在水-己烷的雙相體系中高效有序地進(jìn)行，并且具備良好的穩(wěn)定性，重復(fù)利用不會(huì)影響其活性。

圖4 2-Melm@PLA1/MSNCPC的合成及催化過(guò)程[42]

為了使GPC 的品質(zhì)滿足食品添加劑的要求，Kim 等[44]將大豆卵磷脂置于食品級(jí)萃取溶劑正己烷-水的雙相介質(zhì)中，選擇Novozym435（諾維信脂肪酶435）催化其水解，過(guò)濾除去酶后所得濾液，通過(guò)雙相介質(zhì)的簡(jiǎn)單相分離即可得到純度為98.6%的食品級(jí)GPC水溶液。

2.2 全化學(xué)合成法

縮水甘油或氯甘油與磷酰膽堿的鹽反應(yīng)生成GPC 的收率高（達(dá)到90%以上），反應(yīng)工藝簡(jiǎn)單，是目前工業(yè)上最主流的合成路線。Park 等[19]以R-縮水甘油為原料，開(kāi)發(fā)了兩種合成GPC 的反應(yīng)路線。路線1：R-縮水甘油先與苯甲醇進(jìn)行開(kāi)環(huán)反應(yīng)，后經(jīng)乙酰化、氫化，再與甲基苯磺酸膽堿和吡啶反應(yīng)生成乙酰甘油磷酰膽堿，最后脫去乙?；吹肎PC。路線2：S-縮水甘油與甲基苯磺酸膽堿直接磷酸化得S-縮水甘油磷酰膽堿，再經(jīng)過(guò)開(kāi)環(huán)反應(yīng)即得GPC。路線2 是在路線1 的基礎(chǔ)上進(jìn)行的改進(jìn)，反應(yīng)路線更短，操作更簡(jiǎn)單。

Song 等[45]利用環(huán)氧開(kāi)環(huán)的原理，將R-縮水甘油與PC-Cl 在異丙胺的存在下進(jìn)行親核加成制備GPC，此方法制備工藝簡(jiǎn)單，但反應(yīng)收率偏低，而且反應(yīng)原料R-縮水甘油極不穩(wěn)定，保存條件苛刻，增加了生產(chǎn)成本。Lee等[46]在此基礎(chǔ)上，以R-氯甘油為原料，在低溫條件下與NaOH的醇溶液反應(yīng)生成R-縮水甘油，并立即將所制備的R-縮水甘油與PC-Cl以2∶1的物料比在50～60℃下反應(yīng)制備GPC，將反應(yīng)收率提高到70%～92%。Hwang等[47]利用此工藝路線，將450mmol PC-Cl溶解于甲醇中，依次加入900mmol 的KOH 和900mmol 的R-氯甘油，用一鍋法制備出GPC，反應(yīng)最大收率達(dá)到97%。此方法操作簡(jiǎn)單，中間產(chǎn)物少，適用于工業(yè)生產(chǎn)。PC-Cl的價(jià)格較為昂貴，通常不作為工業(yè)生產(chǎn)的原料。劉振等[48]則利用磷酰膽堿鈣鹽（PC-Ca）與碳酸鉀水溶液反應(yīng)制備磷酰膽堿鉀鹽（PC-K），將PC-K 與R-氯甘油反應(yīng)制備GPC 粗品，此方法也避免用到不穩(wěn)定的R-縮水甘油，原料的穩(wěn)定性好且價(jià)格低，但是工藝操作比較復(fù)雜。尤家棟[49]利用R-氯甘油與NaOH 在乙醇中低溫制備R-縮水甘油，過(guò)濾掉析出的鹽后加入PC-Cl高溫回流反應(yīng)制備GPC，也具備很高的收率。

對(duì)各種制備方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了比較分析，如表3所示。全化學(xué)合成法制備GPC具備收率高、產(chǎn)品純度高、制備工藝完善的優(yōu)點(diǎn)；但起始原料昂貴，最終得到的GPC 產(chǎn)品中也會(huì)殘留一些基因毒性雜質(zhì)，對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)有嚴(yán)重影響。利用化學(xué)催化水解PC 同樣存在這些問(wèn)題，化學(xué)催化劑是毒性物質(zhì)會(huì)影響產(chǎn)品在食品和藥物中的應(yīng)用。生物酶通常無(wú)毒無(wú)害，用生物酶水解PC 是制備食品級(jí)GPC 最好的方法，但此方法收率低，產(chǎn)品純度低，對(duì)除雜的要求很高，規(guī)?；a(chǎn)難度大。

表3 不同制備方法的比較

3 GPC的純化方法

目前，市場(chǎng)要求GPC 產(chǎn)品的RID 純度達(dá)到99.65%，旋光度在-2.4～-2.72，且單一雜質(zhì)含量不能超過(guò)0.1%。但是，化學(xué)制備法會(huì)產(chǎn)生磷酰膽堿鹽、縮水甘油、氯甘油和甘油等雜質(zhì)，水解法會(huì)產(chǎn)生甘油磷酰乙醇胺（GPE）、甘油磷酰絲氨酸（GPS）、甘油磷酰肌醇（GPI） 等雜質(zhì)。因此，GPC的純化一直是一個(gè)難點(diǎn)。目前常用的純化方法就是溶劑萃取法、結(jié)晶法和柱色譜法。

對(duì)于化學(xué)法制備的GPC粗品，劉振等[48]先用活性炭脫色，再用丙酮萃取除去其中的有機(jī)溶劑，最后用D001 大孔強(qiáng)酸性樹(shù)脂和711 大孔強(qiáng)堿性樹(shù)脂混床柱脫鹽，可得到純度為99.8%的GPC產(chǎn)物。丁建飛[50]采用GPC在無(wú)水乙醇中結(jié)晶的方法除去GPC中的有機(jī)雜質(zhì)，得到的GPC純度能達(dá)到99.5%。于振鵬等[51]考察了醇類、酯類、酮類和乙腈的結(jié)晶除雜效果，所得GPC 晶體的純度都達(dá)到了99.5%以上。尤家棟[52]將反應(yīng)液用丙酮萃取，然后用陰性離子交換樹(shù)脂柱除去萃取液中的鹽分，最后在無(wú)水乙醇中結(jié)晶得到精制GPC。

對(duì)于水解PC 得到的GPC 粗品，周麗等[53]采用D113 吸附樹(shù)脂，將GPE 和鹽類雜質(zhì)除去，所得GPC純度達(dá)到97%。Bang等[42]先將濾液用乙醚萃取三次以除去游離脂肪酸（FFA），接著用硅膠柱除去殘留的FFA 和PC-Cl，從而得到純化的GPC。Zhang 等[54]使用D001 陽(yáng)離子和D301-111 陰離子交換樹(shù)脂柱色譜法成功地將GPC 和GPE 分開(kāi)，得到的GPC 純度為98.8%。王志強(qiáng)等[55]將水解的PC 反應(yīng)液直接進(jìn)行氧化鋁柱層析，再用D001 大孔離子交換樹(shù)脂除去鹽分，所得GPC純度可達(dá)99%以上。

對(duì)各種純化方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了比較分析，如表4所示。在GPC的純化中，目前最重要的還是結(jié)晶法和柱色譜法，結(jié)晶法收率低，操作較為復(fù)雜，可作為產(chǎn)品純化的最終步驟；柱色譜法除雜效果好，但在除雜過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量“三廢”，純化周期長(zhǎng)，工業(yè)應(yīng)用成本高。因此，開(kāi)發(fā)適用于工業(yè)生產(chǎn)的除雜方法非常重要。

表4 不同純化方法的比較

4 結(jié)語(yǔ)

人口老齡化是當(dāng)今世界發(fā)展的一個(gè)重要趨勢(shì)，老年人的精神健康問(wèn)題也是全世界研究的熱點(diǎn)，GPC能提高海馬體中的乙酰膽堿水平，支持大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的功能，預(yù)防衰老造成的認(rèn)知功能的下降，在中國(guó)這樣的老齡化社會(huì)中具備良好的市場(chǎng)前景。

在目前的分析方法中，液相色譜法是GPC 的定量分析最常用的方法，液相色譜配合多種檢測(cè)器聯(lián)用還能檢測(cè)各雜質(zhì)的含量。薄層色譜法可作為中控方法，判斷反應(yīng)過(guò)程中是否有GPC 的生成。核磁共振譜法可用于GPC 的鑒定，也可用于測(cè)定最終得到的GPC 產(chǎn)品的光學(xué)純度。滴定法測(cè)量精度高，常用于最終得到的GPC產(chǎn)品含量的測(cè)定。

在目前的制備方法中，全化學(xué)合成法制備GPC具備收率高、產(chǎn)品純度高、制備工藝完善的優(yōu)點(diǎn)；但起始原料昂貴，最終得到的GPC 產(chǎn)品中也會(huì)殘留一些基因毒性雜質(zhì)，對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)有嚴(yán)重影響。利用化學(xué)催化水解PC 同樣存在這些問(wèn)題，這些化學(xué)催化劑同樣是毒性物質(zhì)，也會(huì)影響產(chǎn)品在食品上的應(yīng)用。生物酶通常無(wú)毒無(wú)害，用生物酶水解PC是制備食品級(jí)GPC最好的方法，但此方法收率低，產(chǎn)品純度低，對(duì)除雜的要求很高，規(guī)模化生產(chǎn)難度大。

在目前的純化方法中，最常用的還是結(jié)晶法和柱色譜法：結(jié)晶法收率低，操作也較為復(fù)雜，可作為產(chǎn)品純化的最終步驟；柱色譜法除雜效果好，但在除雜過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量“三廢”，純化周期長(zhǎng)，工業(yè)應(yīng)用成本高。

在社會(huì)老齡化的背景下，GPC具有良好的市場(chǎng)前景。開(kāi)發(fā)能規(guī)?；a(chǎn)GPC 的工藝路線，適用于工業(yè)生產(chǎn)的除雜方法是其關(guān)鍵和難點(diǎn)。