陳君霞 王運(yùn)根 章英 孫麗萍

子宮腺肌病是一種良性子宮疾病，其定義為子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)存在于子宮肌層內(nèi)[1]，臨床表現(xiàn)為痛經(jīng)、子宮異常出血、月經(jīng)過多、不孕、流產(chǎn)等。在子宮腺肌病發(fā)展過程中，子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)的植入需要細(xì)胞增殖和血管生成共同完成。另外，有研究發(fā)現(xiàn)腺肌病病灶神經(jīng)纖維分布異?？赡茉谧訉m腺肌病疼痛發(fā)生機(jī)制中起重要作用[2-3]，子宮腺肌病患者疼痛的嚴(yán)重程度與子宮內(nèi)膜和肌層神經(jīng)纖維的增加密切相關(guān)，而與病變的程度無關(guān)[3]。目前普遍認(rèn)為子宮腺肌病和子宮內(nèi)膜異位癥有類似的發(fā)病機(jī)制，受相同的類固醇激素影響。短效口服避孕藥或孕激素治療均可明顯緩解子宮內(nèi)膜異位癥患者的盆腔疼痛，且已證實(shí)這兩類藥物均可顯著降低子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜和子宮肌層的神經(jīng)纖維密度[4-5]。促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRHa）為人工合成的十肽類化合物，對(duì)促性腺激素釋放激素（GnRH）受體的親和力較天然GnRH高百倍，可持續(xù)抑制垂體分泌促性腺激素，導(dǎo)致卵巢激素水平明顯下降，是臨床上治療子宮腺肌病和子宮內(nèi)膜異位癥的常用藥物。本研究探討GnRHa對(duì)子宮腺肌病患者子宮腺肌病病灶及子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖、血管增殖、神經(jīng)生長因子及神經(jīng)纖維密度的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2014年1月至2020年6月紹興市人民醫(yī)院收治的因子宮腺肌病行經(jīng)腹或腹腔鏡下子宮全切術(shù)的患者68例，患者年齡32～50（45.68±3.39）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者年齡30～50歲，存在重度痛經(jīng)[視覺模擬評(píng)分法（VAS）評(píng)分7～9分]，伴或不伴有月經(jīng)量過多；（2）經(jīng)臨床表現(xiàn)及陰道超聲檢查明確診斷為子宮腺肌?。唬?）所有患者既往均無腹部手術(shù)史、盆腔炎性疾病史、神經(jīng)性疼痛病史或內(nèi)分泌疾病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：就診前半年內(nèi)接受過任何激素治療。68例患者中，有36例同時(shí)存在月經(jīng)過多。在接受子宮切除術(shù)前，所有患者均被告知可選擇GnRHa預(yù)處理及相關(guān)的受益（縮小子宮體積有利于手術(shù)，緩解痛經(jīng)，暫時(shí)性閉經(jīng)改善貧血等）和可能出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)（低雌激素相關(guān)癥狀等）。權(quán)衡利弊后，其中36例患者選擇術(shù)前GnRHa預(yù)處理作為GnRHa治療組，另外32例患者選擇直接手術(shù)治療作為對(duì)照組。兩組患者年齡、孕次、產(chǎn)次、月經(jīng)過多發(fā)生率等方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表 1。

表1 兩組患者一般資料比較

GnRHa治療組患者于月經(jīng)第1天給予皮下注射醋酸亮丙瑞林針3.75 mg（天津武田藥品有限公司，規(guī)格：3.75 mg/支），此后每隔4周注射1次，共3個(gè)周期，末次注射后1個(gè)月內(nèi)接受子宮全切術(shù)；對(duì)照組患者術(shù)前不作處理。兩組患者行子宮全切除術(shù)后，迅速將切下子宮剖開，于子宮肌層尋找并切取子宮腺肌病病灶，同時(shí)切取子宮內(nèi)膜組織，并將組織標(biāo)本置于4%中性緩沖甲醛溶液中固定，4℃保存。子宮內(nèi)膜為基底層子宮內(nèi)膜，即距離內(nèi)膜-肌層交界處300 μm以內(nèi)的內(nèi)膜組織。

1.2 方法

1.2.1 VAS評(píng)分評(píng)價(jià)疼痛程度 采用VAS評(píng)分評(píng)價(jià)子宮腺肌病患者痛經(jīng)程度。VAS評(píng)分：0分為無痛；＞0分為疼痛，其中＞0分且＜7分為輕中度痛，≥7分為重度痛。

1.2.2 增殖細(xì)胞相關(guān)核抗原-67（Ki-67）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、神經(jīng)生長因子（NGF）、蛋白基因產(chǎn)物-9.5（PGP-9.5）表達(dá)情況檢測(cè) 采用免疫組化法。Ki-67：固定后的組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，二甲苯和梯度乙醇常規(guī)脫蠟，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中進(jìn)行煮沸抗原修復(fù)，0.3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。將鼠抗人Ki-67單克隆抗體（M7240，中國上?；蛏锟萍加邢薰?，規(guī)格：0.2 ml，批號(hào)：GT209429，1∶200稀釋）滴加在組織玻片上，4 ℃孵育過夜。放大顯色系統(tǒng)采用EnVision試劑盒（丹麥DAKO公司，批號(hào)：20059650），操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。3,3'-二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染。常規(guī)脫水，透明，干燥，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

VEGF：固定及抗原修復(fù)步驟同上，滴加鼠抗人VEGF單克隆抗體（VG1，中國上?；蛏锟萍加邢薰荆?guī)格：4 ml，批號(hào)：GT217004），操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。復(fù)染及脫水、干燥等步驟同上。光學(xué)顯微鏡下觀察。

NGF：固定及抗原修復(fù)步驟同上，滴加單克隆兔抗人NGF抗體（EP1320Y，中國上?；蛏锟萍加邢薰荆?guī)格：0.2 ml，批號(hào)：GR226375-44，1∶500 稀釋），操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。復(fù)染及脫水、干燥等步驟同上。光學(xué)顯微鏡下觀察。

PGP-9.5：固定及抗原修復(fù)步驟同上，滴加兔抗人PGP-9.5多克隆抗體（Z5116，丹麥DAKO公司，規(guī)格：0.2 ml，批號(hào)：GZ511629，1∶500 稀釋），操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。復(fù)染及脫水、干燥等步驟同上。光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3 檢測(cè)方法 Ki-67和VEGF染色評(píng)價(jià)：隨機(jī)選取3個(gè)視野，高倍鏡下（×400）計(jì)數(shù)陽性染色細(xì)胞個(gè)數(shù)及總細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例，取其平均值。

NGF的染色評(píng)價(jià)：低倍鏡（×100）下選取NGF陽性高表達(dá)區(qū)，再轉(zhuǎn)換成高倍鏡（×400），通過免疫反應(yīng)性（IR）評(píng)分評(píng)價(jià)，其中染色強(qiáng)度評(píng)分0分即陰性，1分即弱陽性，2分即中度染色，3分即強(qiáng)陽性；陽性染色細(xì)胞的百分比評(píng)分0分即0%細(xì)胞陽性染色，1分即≤10%細(xì)胞陽性染色，2分即11%～50%細(xì)胞陽性染色，3分即51%～80%細(xì)胞陽性染色，4分即≥81%細(xì)胞陽性染色。IR評(píng)分=染色強(qiáng)度評(píng)分×陽性染色細(xì)胞的百分比評(píng)分。

PGP-9.5陽性神經(jīng)纖維密度計(jì)算：參考Tokushige等[6]的方法并加以改進(jìn)。采用德國萊卡公司生產(chǎn)的顯微激光切割系統(tǒng)（型號(hào)：Leica DM3000）進(jìn)行計(jì)數(shù)并拍片。神經(jīng)纖維密度計(jì)算方法為：低倍鏡（×100）下選取PGP-9.5陽性高表達(dá)區(qū)，再轉(zhuǎn)換成高倍鏡（×400），進(jìn)行圖像采集，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野下PGP-9.5陽性神經(jīng)纖維數(shù)，計(jì)算其平均值。每張片子由兩位互盲且對(duì)該病例臨床資料并不了解的課題組成員計(jì)數(shù)PGP-9.5陽性神經(jīng)纖維個(gè)數(shù)，要求兩者計(jì)數(shù)結(jié)果差別＜5%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者子宮不同組織Ki-67陽性細(xì)胞比例比較 GnRHa治療組和對(duì)照組患者子宮腺肌病病灶組織 Ki-67陽性細(xì)胞比例分別為（9.56±3.48）%和（44.53±10.02）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組子宮內(nèi)膜組織Ki-67陽性染色細(xì)胞比例分別為（7.56±2.27）%和（43.66±9.87）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 1（插頁）。

圖1 兩組患者子宮不同組織增殖細(xì)胞相關(guān)核抗原（Ki-67）免疫組化染色圖[a、b、c、d為子宮腺肌病病灶，e、f、g、h為子宮內(nèi)膜組織；a、b、e、f為對(duì)照組，c、d、g、h 為促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRHa）治療組；a、c、e、g為 100 倍鏡下觀，b、d、f、h 為 400 倍鏡下觀]

2.2 兩組患者子宮不同組織VEGF陽性細(xì)胞比例比較 GnRHa治療組和對(duì)照組患者子宮腺肌病病灶組織VEGF陽性細(xì)胞比例分別為（6.06±1.71）%和（10.09±2.43）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組子宮內(nèi)膜組織VEGF陽性染色細(xì)胞比例分別為（6.86±2.28）%和（7.69±2.84）%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖 2（插頁）。

圖2 兩組患者子宮不同組織血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）免疫組化染色圖[a、b、c、d為子宮腺肌病病灶，e、f、g、h為子宮內(nèi)膜組織；a、b、e、f為對(duì)照組，c、d、g、h 為促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRHa）治療組；a、c、e、g為 100 倍鏡下觀，b、d、f、h 為 400 倍鏡下觀]

2.3 兩組患者子宮不同組織NGF表達(dá)的IR評(píng)分比較 GnRHa治療組和對(duì)照組患者子宮腺肌病病灶組織IR評(píng)分比例分別為3.92±1.20和6.84±2.68，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在子宮內(nèi)膜部位，兩組IR評(píng)分比例分別為2.78±1.57和5.66±2.81，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 3（插頁）。

圖3 兩組患者子宮不同組織神經(jīng)生長因子（NGF）免疫組化染色圖[a、b、c、d 為子宮腺肌病病灶，e、f、g、h 為子宮內(nèi)膜組織；a、b、e、f為對(duì)照組，c、d、g、h 為促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRHa）治療組；a、c、e、g 為 100 倍鏡下觀，b、d、f、h 為 400 倍鏡下觀]

2.4 兩組患者子宮不同組織PGP-9.5陽性神經(jīng)纖維密度比較 GnRHa治療組和對(duì)照組患者子宮腺肌病病灶組織PGP-9.5陽性神經(jīng)纖維密度分別為1（1，2）和 3（2，4），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組子宮內(nèi)膜組織PGP-9.5陽性神經(jīng)纖維密度分別為 1（1，2）和 2（1，3），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 4（插頁）。

圖4 兩組患者子宮不同組織蛋白基因產(chǎn)物-9.5（PGP-9.5）免疫組化染色圖[a、b、c、d為子宮腺肌病病灶，e、f、g、h為子宮內(nèi)膜組織；a、b、e、f為對(duì)照組，c、d、g、h 為促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRHa）治療組；a、c、e、g 為 100 倍鏡下觀，b、d、f、h 為 400 倍鏡下觀]

3 討論

臨床研究表明，目前在各種藥物保守治療方法中，GnRHa在緩解子宮腺肌病患者痛經(jīng)、減少子宮腺肌病病灶體積、減少月經(jīng)量等方面的療效最強(qiáng)[7]。一般認(rèn)為，GnRHa的作用是通過競爭性下調(diào)垂體GnRH受體，抑制卵巢功能導(dǎo)致低雌激素狀態(tài)，從而緩解疼痛，縮減病灶大小。然而，越來越多的證據(jù)表明GnRHa對(duì)子宮腺肌病或子宮內(nèi)膜異位癥患者的病灶和子宮內(nèi)膜組織均存在直接的作用[8-11]，而本研究進(jìn)一步證實(shí)了GnRHa在人體內(nèi)對(duì)子宮腺肌病病灶部位和子宮內(nèi)膜組織學(xué)的影響。

Ki-67與細(xì)胞增殖有關(guān)，體外研究表明，GnRHa可降低子宮腺肌病患者子宮肌層中Ki-67的表達(dá)[9]。VEGF是病理生理?xiàng)l件下血管生成的主要促進(jìn)因子，也是內(nèi)皮細(xì)胞的生存因子[12]。VEGF的釋放與子宮腺肌病的發(fā)生有關(guān)，而體外研究發(fā)現(xiàn)GnRHa可通過減少VEGF的釋放直接抑制異位子宮內(nèi)膜的存活和生長[13]，因此筆者推測(cè)在體內(nèi)也有類似的結(jié)果。PGP-9.5是一個(gè)泛神經(jīng)纖維標(biāo)志物，可標(biāo)記有髓和無髓鞘的神經(jīng)纖維[14]。依據(jù)以往的研究[4-5]，筆者假設(shè)GnRHa可以抑制細(xì)胞增殖，減少血管生成，并減少病變組織和子宮內(nèi)膜的神經(jīng)纖維密度。在本研究中，筆者使用Ki-67、VEGF、NGF、PGP-9.5 進(jìn)行免疫組化染色，分析GnRHa作用下子宮腺肌病患者病灶部位和子宮內(nèi)膜的細(xì)胞增殖、血管增殖及神經(jīng)纖維密度變化。

本研究結(jié)果顯示，GnRHa治療組患者子宮腺肌病病灶和子宮內(nèi)膜組織Ki-67陽性細(xì)胞比例均較對(duì)照組顯著降低，說明GnRHa可降低子宮腺肌病患者子宮組織中細(xì)胞的增殖，這解釋了GnRHa在減少子宮腺肌病患者子宮體積方面的顯著作用。而新生血管生成受抑制或許也是GnRHa治療縮小子宮腺肌病子宮體積的原因。根據(jù)以往的研究，VEGF在血管和神經(jīng)發(fā)生過程中起重要作用，其在子宮腺肌病患者的在位和異位子宮內(nèi)膜中均有強(qiáng)烈表達(dá)[15]。外源性VEGF-A可促進(jìn)接受過去神經(jīng)手術(shù)成年大鼠交感神經(jīng)突的生長[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，GnRHa治療組的子宮腺肌病病灶VEGF表達(dá)明顯低于對(duì)照組，提示GnRHa治療可顯著抑制子宮腺肌病病灶血管增殖，從而抑制該部位異位內(nèi)膜的生長。雖然GnRHa治療組的子宮內(nèi)膜組織VEGF表達(dá)較對(duì)照組降低并不顯著，但筆者仍然推測(cè)GnRHa可以減少該部位的新生血管形成，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的原因可能是本研究中Gn－RHa治療組沒有經(jīng)過足夠的周期治療，本研究Gn－RHa治療組在子宮切除前僅用GnRHa治療了3個(gè)周期。關(guān)于GnRHa對(duì)子宮腺肌病組織血管再生的影響，還需要進(jìn)行更多的研究。

GnRHa治療組組織中NGF表達(dá)及PGP-9.5陽性神經(jīng)纖維密度均顯著低于對(duì)照組，這些發(fā)現(xiàn)可能揭示了GnRHa控制腺肌癥相關(guān)疼痛的機(jī)制。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，神經(jīng)重塑和神經(jīng)纖維分布改變可能是導(dǎo)致子宮腺肌病相關(guān)疼痛的原因，而NGF在神經(jīng)重塑和神經(jīng)纖維分布中起重要作用[17]。據(jù)報(bào)道，在子宮內(nèi)膜異位病灶中，NGF表達(dá)異常增高[18-19]，并且在子宮內(nèi)膜異位病灶中，疼痛組患者的PGP-9.5陽性神經(jīng)纖維明顯高于無痛組[20]。既往研究顯示地諾孕素可降低子宮內(nèi)膜異位病灶的NGF表達(dá)強(qiáng)度，同時(shí)減少病灶神經(jīng)纖維密度[5]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，GnRHa治療組子宮腺肌病病灶及子宮內(nèi)膜中NGF的IR評(píng)分及PGP-9.5陽性神經(jīng)纖維密度均明顯降低，這可能是GnRHa減輕子宮腺肌病相關(guān)疼痛癥狀的機(jī)制之一，提示GnRHa可能直接作用于子宮腺肌病病灶內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)。

總之，本研究結(jié)果表明，GnRHa治療后子宮腺肌病病灶和子宮內(nèi)膜具有顯著的組織學(xué)特征，包括細(xì)胞增殖和血管增生減少，NGF的IR評(píng)分比例降低以及PGP-9.5陽性神經(jīng)纖維密度降低。當(dāng)然，對(duì)于GnRHa對(duì)子宮腺肌病中血管生成的影響，還需要更多的周期研究。事實(shí)上，GnRH受體在子宮內(nèi)膜異位、子宮腺肌病和子宮肌瘤等外周組織中均有表達(dá)[9，21]。體外實(shí)驗(yàn)顯示GnRHa可抑制子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞增殖，提示GnRHa可能對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥病灶有直接作用[10]。除了雌激素抑制的間接作用之外，GnRHa對(duì)子宮腺肌病病灶及子宮內(nèi)膜組織是否存在直接作用，本研究所顯示的這些變化究竟是GnRHa的直接影響，還是雌激素的繼發(fā)性改變，亦或兼而有之，目前尚不清楚，需要進(jìn)一步的前瞻性研究來克服這些局限性。