林 鏞 彭子明 馮 逢 張建玲 龍富立， 毛德文 韋艾凌，3

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，南寧市 530200，電子郵箱：243560015@qq.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病二區(qū)，南寧市 530023；3 廣西中醫(yī)藥大學(xué)成人教育學(xué)院，南寧市 530001)

【提要】 急性肝衰竭是一種嚴(yán)重而復(fù)雜的肝損傷，短時(shí)間可迅速危及生命，患者生存預(yù)后差，短期死亡率高。建立合適的動(dòng)物模型，對(duì)于疾病機(jī)制和治療策略的研究具有重要意義。目前，我國中醫(yī)藥在急性肝衰竭的治療方面表現(xiàn)出巨大潛力。本文對(duì)近年來常用的藥物性急性肝衰竭動(dòng)物模型及其在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用做一綜述，為急性肝衰竭的深入研究提供模型選擇及評(píng)價(jià)參考。

急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是由多種因素引起的短時(shí)間內(nèi)發(fā)生的肝功能損害、凝血功能異常，進(jìn)而出現(xiàn)肝臟解毒、代謝和合成等功能嚴(yán)重障礙和多器官功能衰竭。病理上表現(xiàn)為肝臟大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞壞死，病情進(jìn)展十分迅速，病死率高達(dá)70%～80%[1-2]。目前，藥物保守治療是ALF最主要的治療方法，但尚缺乏特效的藥物。研究表明[3]，在西醫(yī)治療基礎(chǔ)上配合中醫(yī)藥治療能有效改善ALF患者的預(yù)后、減少并發(fā)癥發(fā)生、縮短住院時(shí)間。本文針對(duì)目前國內(nèi)外常見的藥物性ALF動(dòng)物模型的制備方法和評(píng)價(jià)指標(biāo)等方面進(jìn)行了總結(jié)，并介紹藥物性ALF動(dòng)物模型在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

目前應(yīng)用于ALF造模的動(dòng)物有大鼠、小鼠、兔子、犬、豬、非人靈長(zhǎng)類(恒河猴、食蟹猴)[4-5]等，雌雄均有。

1.1 嚙齒 嚙齒動(dòng)物在ALF模型制備中應(yīng)用最為廣泛，常用于藥物性ALF模型的建立，大鼠品系一般以 Wistar 和 SD 為主[6-8]；小鼠以 ICR、C57BL/6j、KM在研究實(shí)驗(yàn)中最為多見[9-11]，也有研究用其他品系小鼠，ALF造模對(duì)小鼠品系無嚴(yán)格要求。

1.2 兔 可用于建造ALF模型的兔品系比較多，造模方式以手術(shù)和藥物為主。手術(shù)造?？梢暂^為直觀地觀察體內(nèi)情況，因此是研究肝臟外科疾病的首選動(dòng)物模型，適合人工肝支持系統(tǒng)在ALF中的應(yīng)用研究[12]。

1.3 豬、犬 豬、犬ALF的造模方式以手術(shù)、化學(xué)藥物為主。豬、犬作為哺乳動(dòng)物在遺傳和生理上與人類存在高度相似性，被越來越多的實(shí)驗(yàn)所采用。手術(shù)模型多用于測(cè)試各種生物型人工肝系統(tǒng)，化學(xué)藥物模型常用于研究ALF臨床機(jī)制、生化、組織病理變化等[13-16]。

1.4 猴 研究表明，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物肝臟發(fā)育、內(nèi)環(huán)境變化與人類極其相似，其ALF模型在臨床上與患者的臨床特征、肝臟指標(biāo)、組織病理學(xué)、影像學(xué)和壽命表現(xiàn)出相似的變化[17]。所以非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物ALF模型常用于研究引發(fā)ALF的誘因或潛在的機(jī)制及新型病毒基因型試驗(yàn)[4-5]。

2 建模方法

常見的藥物性ALF動(dòng)物模型主要使用肝毒性藥物建模，藥物包括對(duì)乙酰氨基酚(N-acetyl-p-aminophenol,APAP)、D-氨基半乳糖胺(D-galactosamine,D-GalN)、硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)、四氯化碳、刀豆球蛋白A(concanavalin A,ConA)、卡介苗等。不同的建模方法涉及不同的實(shí)驗(yàn)程序，每種動(dòng)物模型各有優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)存在一定的不足。

2.1 ALF模型的建模方法

2.1.1 APAP：(1)APAP制備模型原理。APAP是一種肝毒性很強(qiáng)的藥物，其誘導(dǎo)肝衰竭機(jī)制與氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、肝細(xì)胞壞死等有關(guān)[18]。線粒體功能障礙是APAP誘導(dǎo) ALF 模型成功的主要機(jī)制，中毒劑量的APAP 可選擇性地使三磷酸腺苷酶復(fù)合體中的高親和力位點(diǎn)失活，從而抑制三磷酸腺苷酶活性并損傷線粒體超微結(jié)構(gòu)，引起肝衰竭[19]。(2)造模方法。①嚙齒動(dòng)物：以750 mg/kg APAP對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，約12 h造模完成[9]。②犬類：Ortega等[13]將雜種犬禁食12 h后，每90 min靜脈注射500 mg/kg一次，注射后24～48 h內(nèi)可發(fā)現(xiàn)犬出現(xiàn)廣泛肝損傷，48 h后出現(xiàn)大量肝壞死，76 h犬的死亡率為100%。趙世峰等[14]采用皮下注射APAP法對(duì)雜種家犬進(jìn)行干預(yù)，首次劑量為750 mg/kg，注射后9 h和24 h分別再以200 mg/kg APAP行第2、3次注射。結(jié)果顯示，該方法ALF模型成功率為76.7%。③豬類：選取雌性長(zhǎng)白豬，按250 mg/kg劑量經(jīng)十二指腸給予APAP，以0.5～4 g/h的維持量將APAP血清濃度維持在300 mg/L以上，直至各指標(biāo)符合ALF[15]。目前采用APAP制備非人靈長(zhǎng)類ALF模型尚未見報(bào)道。以上文獻(xiàn)顯示APAP可用于多種動(dòng)物ALF模型的建造，但中大型動(dòng)物模型的建模成功率欠佳，小型動(dòng)物模型的制備較為常見。

2.1.2 D-GalN：(1)D-GalN制備模型原理。D-GalN 可快速結(jié)合并消耗體內(nèi)大量尿苷酸，使肝臟核酸、糖蛋白、脂糖等物質(zhì)合成受抑制，進(jìn)而導(dǎo)致酶的合成和補(bǔ)充受到限制，細(xì)胞器生成受阻，對(duì)肝細(xì)胞組織造成不可逆的損傷。脂多糖能刺激肝臟巨噬細(xì)胞、枯氏細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)，進(jìn)而破壞血管內(nèi)皮的完整性，導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡和壞死[20-21]。D-GalN又能加強(qiáng)脂多糖的急性毒性，所以無論單一使用D-GalN或與脂多糖共同作用均可誘導(dǎo)ALF模型。(2)造模方法。① D-GalN與脂多糖共同作用造模。a小鼠：吳小紅等[22]給予C57BL/6j小鼠腹腔注射200 μL 含脂多糖(2.5 mg/kg)和D-GalN(0.3 g/kg)的生理鹽水溶液一次成膜。Lin 等[10]給予C57BL/6j小鼠腹腔注射脂多糖(50 μg/kg)和D-GalN(800 mg/kg)，1 次/d，連續(xù)3 d后完成造模。b大鼠：龍富立等[11]予無特定病原體級(jí)大鼠腹腔注射脂多糖(20 μg/kg)/D-GalN(600 mg/kg)，一次成模，時(shí)間為48 h；Kitazawa等[23]給予Wistar大鼠腹腔注射D-GalN(500 mg/kg)/脂多糖(50 μg/kg)3 h 后，即可建成ALF模型。c豬類：彭承宏等[16]對(duì)雌性家豬經(jīng)門靜脈注射0.5 g/kg D-Ga lN和1 μg/kg脂多糖一次建立豬ALF模型，4 d死亡率為83%。② D-GalN單獨(dú)作用造模。a大鼠：劉芳等[24]、Zhang等[25]研究均證實(shí)按1.4 g/kg的劑量給予大鼠腹腔注射D-GalN一次后可制備成大鼠ALF模型，該模型在生化學(xué)、組織學(xué)、臨床表現(xiàn)等方面與人類相似。b豬類：?jiǎn)塘岬萚26]采用中國實(shí)驗(yàn)小型豬、郭健文等[27]采用五指山系小豬，分別經(jīng)頸外靜脈和耳靜脈一次性按1.2 g/kg體重量D-GalN腹腔注射制備ALF模型，結(jié)果提示兩種注射方法均獲得滿意的豬ALF模型。Wei等[28]同樣通過耳靜脈注射D-GalN構(gòu)建豬ALF模型，但其D-GalN劑量則為1.5 g/kg。c犬類：Patzer等[29]報(bào)道使用異氟醚麻醉后經(jīng)靜脈給予雄性獵犬注射1.5 g/kg D-GalN可成功建立犬ALF模型，犬平均生存時(shí)間為43.7 h。d非人靈長(zhǎng)類：Feng等[30]以食蟹猴為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，按0.25 g/kg經(jīng)小隱靜脈注射D-GalN誘導(dǎo)食蟹猴ALF模型，一次成模，約72 h后其臨床表現(xiàn)、生存時(shí)間、病理變化等方面都可呈現(xiàn)ALF特點(diǎn)。D-GalN制備模型涉及動(dòng)物種類較廣，制備方式多為一次成膜且其成模后動(dòng)物表現(xiàn)與臨床符合程度較高，為目前較為常用的ALF造模藥物，造模方式有腹腔注射、頸靜脈、耳靜脈等。

2.1.3 TAA：(1)TAA制備模型原理。TAA誘導(dǎo)肝損傷的特點(diǎn)是使細(xì)胞氧化應(yīng)激增加和抗氧化防御能力受損，活性氧升高促進(jìn)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的積累，導(dǎo)致細(xì)胞壞死和肝損傷；其次是TAA可以使生物體釋放大量促炎性介質(zhì)[白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β等]使肝損傷進(jìn)一步加重[31-32]。(2)造模方法。嚙齒動(dòng)物：①小鼠。楊天翼[33]按200 mg/kg給予C57BL/6j小鼠腹腔注射TAA，一次成膜，ALF小鼠的病理、血液生化、死亡率均與患者相似。②大鼠。毛德文等[6]按6 mL/kg對(duì)無特定病原體級(jí)Wistar大鼠皮下注射10%TAA，24 h后重復(fù)注射同等劑量，48 h后ALF模型造模成功。張美華等[34]按200 mg/(kg·d)、250 mg/(kg·d)、350 mg/(kg·d)的劑量對(duì)無特定病原體級(jí)雄性大鼠行腹腔內(nèi)注射TAA 2 d,1次/d,發(fā)現(xiàn)TAA致雄性大鼠ALF及其相關(guān)并發(fā)癥(肝性腦病、高內(nèi)毒素等)具有濃度依賴性。之后的大量研究顯示，腹腔注射100 mg/kg[35]、400 mg/kg[36]、600 mg/kg[37]劑量的TAA均可誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)ALF，但須掌握注射的次數(shù)。TAA多用于制備齲齒類動(dòng)物ALF模型，尚未發(fā)現(xiàn)在中大型動(dòng)物及非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中應(yīng)用的相關(guān)研究報(bào)告。其造模劑量從100～600 mg/kg均有報(bào)告，考慮與不同品系鼠類和注射次數(shù)有關(guān)，其造模劑量差異較大也導(dǎo)致該造模方法較少使用。

2.1.4 四氯化碳：(1)四氯化碳制備模型原理。四氯化碳進(jìn)入機(jī)體經(jīng)細(xì)胞色素P450激活后攻擊細(xì)胞膜上的磷脂分子，并與肝細(xì)胞膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，進(jìn)而破壞肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，影響蛋白質(zhì)代謝和Ca2+內(nèi)流增加，引起肝功能損害和生化血液學(xué)指標(biāo)改變[38]。(2)造模方法。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，常通過灌胃、腹腔注射、皮下注射等給藥方式給予四氯化碳制備動(dòng)物ALF模型，其中腹腔注射法可以使藥物直接經(jīng)門靜脈作用于肝臟，因此較為常用。嚙齒動(dòng)物：有學(xué)者按4 mL/kg劑量給SD大鼠灌胃30%四氯化碳一次誘導(dǎo)ALF模型，結(jié)果顯示ALF大鼠的血清生化學(xué)、病理學(xué)、病死率等方面都與患者ALF相似[7-8]。豬類：Nardo等[39]對(duì)體重為28～35 kg的白色大型雌豬，按450 mg/kg劑量腹腔注射四氯化碳一次建立ALF模型，研究體外門靜脈氧合作用。犬類：張日平等[40]將純四氯化碳與大豆油按體積比1 ∶1.5配制，按0.25 mL/kg于清晨空腹注入雜種犬腹腔，前2周每周注射 1次，后5周每 4 d注射1次，7周可完成造模。還有學(xué)者采用四氯化碳聯(lián)合其他藥物或聯(lián)合肝缺血制備ALF模型。如張慧蕓等[41]采用四氯化碳聯(lián)合D-GalN和脂多糖制備BALB/C小鼠慢加ALF模型；Yuasa等[42]在經(jīng)門靜脈注射四氯化碳的同時(shí)聯(lián)合肝缺血建立長(zhǎng)白雌豬ALF模型。四氯化碳構(gòu)建ALF動(dòng)物模型的方法已較為成熟，其可單獨(dú)誘導(dǎo)也可聯(lián)合其他藥物共同誘導(dǎo)ALF，考慮到時(shí)效性和模型相似性，目前主要以小型動(dòng)物造模為主。

2.1.5 ConA：(1)ConA制備模型原理。ConA是一種T細(xì)胞絲裂原，能激活T淋巴細(xì)胞。注射ConA后動(dòng)物肝實(shí)質(zhì)可見大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，主要以CD4+、TNF-α、IL-6為主，而后導(dǎo)致肝組織壞死，門靜脈充血及凝血。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常用ConA誘導(dǎo)建立肝臟疾病模型，該方法能較好地模擬人類病毒性肝炎、免疫性肝病等[43]。(2)造模方法。王友強(qiáng)[44]和Guo等[45]經(jīng)C57BL/6j小鼠尾靜脈注射20 mg/kg ConA一次，約6 h內(nèi)可觀察到肝損害及炎癥反應(yīng)，符合ALF表現(xiàn)；朱鏐孌等[46]也發(fā)現(xiàn)一次性靜脈注射15 mg/kg ConA 10 h后可建成C57BL/6j小鼠ALF相似模型；Li等[47]在研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17時(shí)發(fā)現(xiàn)，采用12 mg/kg劑量的ConA建立的C57BL/6j成年小鼠ALF模型也同樣符合ALF臨床表現(xiàn)癥狀。

2.1.6 卡介苗：(1)卡介苗制備模型原理。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，卡介苗常與脂多糖聯(lián)合誘導(dǎo)ALF模型，機(jī)制是卡介苗可使庫普弗細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等單核細(xì)胞浸潤(rùn)，而脂多糖可以激活單核細(xì)胞引起炎癥反應(yīng)，兩者共同作用可以導(dǎo)致急性大面積肝壞死[48]。(2)造模方法。Yang等[49]先經(jīng)尾靜脈給予雄性昆明品系小鼠注射卡介苗 2.5 mg(活菌，卡介苗溶于2 mL生理鹽水中)，使小鼠致敏，10 d后再經(jīng)尾靜脈注射10 mg/只脂多糖，約2 h后可誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)ALF。

2.2 ALF模型評(píng)價(jià) Terblanche等[50]于1991年提出，理想的ALF動(dòng)物模型應(yīng)具備以下特點(diǎn)：(1)有可逆性；(2)模型有可重復(fù)性；(3)動(dòng)物死于ALF；(4)有適當(dāng)治療窗口期；(5)如是大型動(dòng)物應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)和建立體外循環(huán)，以方便指導(dǎo)臨床應(yīng)用和效果評(píng)價(jià)；(6)對(duì)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)人員危害最小。2000年Fourneau等[51]和Newsome等[52]又做了三點(diǎn)補(bǔ)充：(1)動(dòng)物模型須有意識(shí)，可評(píng)估肝性腦?。?2)生理代謝與人相似；(3)符合倫理道德要求。實(shí)際研究中，良好的ALF模型其生理、病理、血清等指標(biāo)需符合Terblanche和 Hickman標(biāo)準(zhǔn)[53]。但目前的動(dòng)物研究中，均符合上述標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物模型較少見，每種模型都有各自優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)及局限性。如動(dòng)物種類的選擇上，嚙齒類小型ALF動(dòng)物模型具有造模方式簡(jiǎn)便、重復(fù)性高、費(fèi)用低等優(yōu)勢(shì)，能很好地復(fù)制臨床ALF癥狀，但其生理代謝與患者存在差異，但行為意識(shí)難以評(píng)估，常用于疾病機(jī)制及藥物治療的研究；兔、犬、豬中大型動(dòng)物模型與ALF患者的相似程度更高，成膜有較長(zhǎng)的治療窗口期，具有一定的神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，能夠連續(xù)監(jiān)測(cè)和建立體外循環(huán)，常用于檢驗(yàn)新型生物人工肝功能或新藥或新治療方法的療效評(píng)估，但其價(jià)格較高，建模的條件要求較為嚴(yán)格；非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物較少用于建立ALF模型。藥物的選擇上，以D-GalN單獨(dú)造模、D-GalN聯(lián)合脂多糖造模、四氯化碳單獨(dú)造模最為常見，這些藥物致ALF的原理與臨床ALF發(fā)病機(jī)制相似，而且成膜用時(shí)較短，用藥方法簡(jiǎn)單易行且重復(fù)性較高。而隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，藥物結(jié)合手術(shù)造模、ConA造模等新型造模方式相繼出現(xiàn)，在不久的將來，ALF的動(dòng)物模型將更加貼近臨床。

3 藥物誘導(dǎo)ALF動(dòng)物模型在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

ALF起病急，病情兇險(xiǎn)，病死率高達(dá)80%，但ALF的發(fā)病機(jī)制尚未明確，尚缺乏特效的治療手段，藥物保守治療及人工肝治療仍是目前治療ALF的主要方法。研究表明在西醫(yī)治療基礎(chǔ)上配合中醫(yī)療法治療可以有效改善患者的臨床癥狀和預(yù)后[54]。在ALF動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，探討中醫(yī)的治療方案可為中醫(yī)治療ALF的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究顯示，單味中藥、復(fù)方藥及中成藥等對(duì)各種ALF動(dòng)物模型均有治療作用[55-56]。治療機(jī)制涉及代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、腸道菌群、免疫等各方面。還有研究顯示，穴位注射可通過刺激經(jīng)絡(luò)腧穴達(dá)到利膽退黃、增強(qiáng)免疫作用，從而促進(jìn)肝功能的恢復(fù)，穴位可選用調(diào)節(jié)肝膽、脾胃經(jīng)的腧穴，如肝俞、中都、日月、脾俞、足三里、期門等[57]。同樣的還有中藥提取物和中藥化合物，例如黃旭等[58]所采用的石見穿多糖能有效保護(hù)由內(nèi)毒素/D-GalN誘導(dǎo)的ALF小鼠肝細(xì)胞損害，降低肝氧化應(yīng)激和抑制肝炎癥反應(yīng)；寇小妮等[59]發(fā)現(xiàn)臭牡丹大黃提取素可以減輕ALF小鼠肝細(xì)胞壞死和凋亡，其機(jī)制可能與抑制小鼠ERS信號(hào)分子有關(guān)；毛云等[60]則是通過人參皂苷化合物誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化合成從而改善ALF大鼠肝功能,機(jī)制可能與加速肝臟再生有關(guān)。

4 小 結(jié)

ALF的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，良好的ALF動(dòng)物模型可為ALF的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但目前各種肝損傷模型還存在缺陷，尚難以完全復(fù)制人體肝損傷的病理生理過程。制備更全面、更完善的ALF動(dòng)物模型仍是將來研究的重點(diǎn)，今后可考慮多種造模方法聯(lián)合應(yīng)用，揚(yáng)長(zhǎng)避短，建立穩(wěn)定且符合貼近臨床的動(dòng)物模型。同時(shí)，中醫(yī)治療ALF的研究尚處于起步階段，治療方法及療效的評(píng)估尚未規(guī)范統(tǒng)一，今后仍需充分利用ALF動(dòng)物模型，從“證候”角度研究中醫(yī)辨證治療ALF的機(jī)制，為中西醫(yī)結(jié)合治療ALF提供新的思路。