李萌，李世敏，于悅，劉海洋，關(guān)麗娜，孔英君

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，哈爾濱 150001)

腫瘤的發(fā)生不僅與癌細(xì)胞本身的特性相關(guān)，癌細(xì)胞及腫瘤免疫微環(huán)境與免疫系統(tǒng)之間的相互作用也起著重要作用。自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK細(xì)胞)是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，能夠識(shí)別靶細(xì)胞、殺傷介質(zhì)。NK細(xì)胞的靶細(xì)胞主要有某些腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞、自身組織細(xì)胞、寄生蟲等，可有效殺傷腫瘤細(xì)胞，對(duì)抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和擴(kuò)散起到重要作用，是腫瘤細(xì)胞免疫治療和抗體免疫治療的基礎(chǔ)。研究表明，有NK細(xì)胞浸潤的患者腫瘤擴(kuò)散比率明顯低于無NK細(xì)胞浸潤者[1]。

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，每年新確診的肺癌患者達(dá)160萬，肺癌也是癌癥患者死亡的首要病因[2]。手術(shù)治療和放化療是既往肺癌治療的常用方法，由于大部分患者確診肺癌時(shí)已處于疾病中晚期，無法手術(shù)治療，且放化療的副作用較大，隨著研究的逐漸深入，關(guān)于肺癌免疫治療的研究取得了重大突破。腫瘤微環(huán)境中NK細(xì)胞的數(shù)量及其功能與患者的總生存率、無進(jìn)展生存率以及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)等相關(guān)[3]；明確肺癌微環(huán)境中NK細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制及其影響因素，對(duì)于肺癌未來的治療研究方向有一定的指導(dǎo)作用?，F(xiàn)就NK細(xì)胞相關(guān)肺癌微環(huán)境及免疫治療予以綜述。

1 NK細(xì)胞的功能

NK細(xì)胞指能夠殺死腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的先天免疫細(xì)胞，具有調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞和促進(jìn)組織生長(zhǎng)的作用[4]，其抗腫瘤作用已在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤中得到證實(shí)[5-6]。人類NK細(xì)胞通常被定義為CD3-CD56+細(xì)胞，根據(jù)CD56和CD16的表達(dá)水平將人類NK細(xì)胞分為兩種功能不同的亞群[7]。大多數(shù)人NK細(xì)胞表達(dá)高水平的CD16和低水平的CD56，稱為CD56[dim]NK細(xì)胞，CD56[dim]NK細(xì)胞表達(dá)大量的穿孔素和顆粒酶等細(xì)胞毒性分子，主要作用是溶解靶細(xì)胞，CD56[dim]NK細(xì)胞也通過CD16接合發(fā)揮抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)；在人類NK細(xì)胞中，CD56[bright]NK細(xì)胞亞群的數(shù)量較少，CD16缺乏或低水平表達(dá)，其主要功能是分泌細(xì)胞因子，如γ干擾素和腫瘤壞死因子-α[8]，通過免疫調(diào)節(jié)以及殺傷腫瘤細(xì)胞抑制腫瘤生長(zhǎng)。

2 肺癌微環(huán)境中NK細(xì)胞發(fā)揮作用的機(jī)制

腫瘤微環(huán)境由非造血基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞亞群等組成[9]。在正常的生理?xiàng)l件下，組織間的動(dòng)態(tài)平衡可以防止腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。在病理?xiàng)l件下，腫瘤及其微環(huán)境的相互作用可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞是惡性腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)，腫瘤微環(huán)境在免疫細(xì)胞的形成、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

肺癌患病率、死亡率均較高，已成為全球性的公共健康問題。肺癌分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌是最常見的肺癌類型。在肺癌的免疫微環(huán)境中，NK細(xì)胞在人類和小鼠肺癌中的定位相似,主要位于腫瘤病灶周圍的侵襲邊緣，很少與癌細(xì)胞直接接觸[10-11]，主要通過表達(dá)Fc受體、釋放細(xì)胞外囊泡等方式發(fā)揮抗腫瘤特性。

2.1NK細(xì)胞表達(dá)Fc受體 Fc受體指細(xì)胞膜表面能與Ig的Fc片段結(jié)合的部位，結(jié)合免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G、IgA、IgE的Fc片段的受體分別稱為FcγR、FcαR和FcεR。在腫瘤微環(huán)境中，表達(dá)Fc受體的主要細(xì)胞群體包括NK細(xì)胞、髓樣細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞[12-13]。人類NK細(xì)胞表達(dá)的主要Fc受體為FcγRⅢa，主要結(jié)合人IgG1和IgG3的Fc段(Cγ2、Cγ3功能區(qū))[14]。除直接殺死腫瘤細(xì)胞外，NK細(xì)胞還可通過結(jié)合癌細(xì)胞IgG的Fc部分介導(dǎo)ADCC，從而誘導(dǎo)激活信號(hào)并殺死靶細(xì)胞。

目前，臨床與Fc受體相關(guān)的肺癌免疫治療的主要為免疫檢查點(diǎn)抑制劑，免疫檢查點(diǎn)抑制劑攜帶一個(gè)Fc，該部分通過單獨(dú)的生物學(xué)效應(yīng)激活NK細(xì)胞表面Fc受體的表達(dá)[8,15]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑程序性細(xì)胞死亡受體1(programmed cell death 1，PD-1)/程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)單抗用于治療非小細(xì)胞肺癌已經(jīng)獲得美國食品藥品管理局批準(zhǔn)[16]。其中，PD-L1抗體Avelumab攜帶IgG1 Fc部分[16-17]，Avelumab能通過Fc受體觸發(fā)NK細(xì)胞的活化能力，誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生，并通過ADCC殺死腫瘤細(xì)胞[18]。

2.2NK細(xì)胞釋放細(xì)胞外囊泡 包括NK細(xì)胞在內(nèi)的所有細(xì)胞均可在自身周圍釋放大小不等的囊泡，稱為細(xì)胞外囊泡。根據(jù)細(xì)胞外囊泡的大小和表面標(biāo)記物的不同，將細(xì)胞外囊泡分為4種類型，包括外泌體、微泡、凋亡小體和大型脂質(zhì)體。所有類型的細(xì)胞外囊泡均可攜帶大分子物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)和核酸(編碼和非編碼DNA和RNA)[19]。然而，不同種類的囊泡具有不同的功能。NK細(xì)胞衍生的細(xì)胞外囊泡對(duì)癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，隨著細(xì)胞外囊泡濃度的增加，細(xì)胞毒性作用隨之增強(qiáng)。同時(shí)，NK細(xì)胞衍生的細(xì)胞外囊泡對(duì)正常細(xì)胞沒有毒性[20]。最近,越來越多的證據(jù)表明，即使在高度免疫抑制的腫瘤微環(huán)境中，NK細(xì)胞釋放的細(xì)胞外囊泡仍具有能夠發(fā)揮抗腫瘤作用的蛋白質(zhì)和微RNA(microRNA，miRNA/miR)[21]。miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的單鏈RNA分子，參與了動(dòng)植物轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控；miRNA的其他作用機(jī)制包括直接結(jié)合蛋白質(zhì)、阻止基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及結(jié)合受體觸發(fā)下游信號(hào)傳導(dǎo)。Fabbri[21]研究表明，miRNA參與了由NK細(xì)胞衍生的細(xì)胞外囊泡介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷過程。

3 基于NK細(xì)胞的肺癌免疫治療

在現(xiàn)有肺癌手術(shù)治療、放化療、分子靶向治療的基礎(chǔ)上，NK細(xì)胞相關(guān)的肺癌免疫治療取得了重大突破。在腫瘤微環(huán)境中，NK細(xì)胞的功能受多種因素調(diào)節(jié)，一方面，腫瘤細(xì)胞、髓樣抑制細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和血小板以接觸依賴性方式或通過分泌可溶性因子(如前列腺素E2和腺苷)引起NK細(xì)胞功能障礙[6]；另一方面，葡萄糖受限制、腫瘤衍生代謝產(chǎn)物、缺氧以及來源于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β等也可通過不同方式影響NK細(xì)胞的功能及活性[22-23]。

由于肺癌中晚期腫瘤微環(huán)境中的NK細(xì)胞出現(xiàn)功能失調(diào)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞毒性減弱、反應(yīng)性降低和活力受損，因此，Kras驅(qū)動(dòng)小鼠肺癌實(shí)驗(yàn)中的NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的強(qiáng)烈抑制作用僅限于肺癌的早期階段[24]。在非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中，NK細(xì)胞具有數(shù)量減少、γ干擾素產(chǎn)生受損和促血管生成表型表達(dá)增加等特點(diǎn)。與健康個(gè)體的外周血NK細(xì)胞相比，小細(xì)胞肺癌患者外周血NK細(xì)胞表現(xiàn)出較弱的細(xì)胞毒性，并且出現(xiàn)NK p46和穿孔素表達(dá)的下調(diào)[25]。因此，增加NK細(xì)胞數(shù)量以及上調(diào)NK細(xì)胞功能是基于NK細(xì)胞的肺癌免疫治療的關(guān)鍵。

3.1離體擴(kuò)增NK細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移療法 在實(shí)體瘤中，離體擴(kuò)增NK細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移療法已經(jīng)成為一種新的治療方法。與同種異體NK細(xì)胞療法相比，自體NK細(xì)胞療法更安全，因?yàn)橥N異體NK細(xì)胞會(huì)引起相對(duì)較多的不良反應(yīng)，重復(fù)注射后有發(fā)生免疫排斥的可能。一項(xiàng)對(duì)12例難治性非小細(xì)胞肺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，接受與熱激蛋白70(heat-shock protein 70，HSP70)一起孵育的自體NK細(xì)胞輸注治療患者的疾病穩(wěn)定期相對(duì)延長(zhǎng)[26]。HSP70是一種腫瘤選擇性識(shí)別結(jié)構(gòu)，可在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞膜上選擇性表達(dá)[27]。將HSP70的14個(gè)氨基酸序列TKDNNLLGRFELSG(TKD)作為NK細(xì)胞的腫瘤選擇性識(shí)別結(jié)構(gòu)，在體外和體內(nèi)將小劑量白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-2加入TKD孵育外周血淋巴細(xì)胞，可增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)細(xì)胞膜HSP70陽性腫瘤的溶細(xì)胞活性。當(dāng)HSP70激活的自體NK細(xì)胞治療聯(lián)合放療治療非小細(xì)胞肺癌時(shí)，患者總生存期延長(zhǎng)，且診斷后33個(gè)月內(nèi)未檢測(cè)到存活腫瘤細(xì)胞及腫瘤進(jìn)展的跡象[28-29]。Ding等[30]發(fā)現(xiàn)，在高度侵襲性小細(xì)胞肺癌患者的維持治療中，基于NK細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移療法發(fā)揮了積極的功效，可延長(zhǎng)患者的總生存期。綜上所述，將NK細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移療法與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用，可能會(huì)在控制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移方面取得積極的效果。

NK細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移療法的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在腫瘤早期的治療。在早期癌癥患者中，自體NK細(xì)胞可識(shí)別并選擇性殺死靜態(tài)癌癥干細(xì)胞，還可預(yù)防癌細(xì)胞的遷移和侵襲，有助于預(yù)防腫瘤的全身轉(zhuǎn)移[31-32]。隨著腫瘤進(jìn)展，癌癥晚期出現(xiàn)免疫抑制性微環(huán)境，在嚴(yán)重的免疫抑制微環(huán)境中，過繼轉(zhuǎn)移的免疫細(xì)胞很容易脫離，并喪失其細(xì)胞毒活性以及滲入腫瘤組織的能力。

3.2聯(lián)合細(xì)胞因子療法 采用細(xì)胞因子刺激NK細(xì)胞治療癌癥的概念由來已久。早在1982年，Rosenberg等就已證明，IL-2刺激外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(主要是激活的NK細(xì)胞)，該細(xì)胞能夠裂解自體癌細(xì)胞[33-34]。IL-2還可以刺激NK細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性活性，且IL-2激活的NK細(xì)胞可以通過細(xì)胞膜HSP70特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞。有研究證明，用IL-2體外刺激自體NK細(xì)胞，然后過繼轉(zhuǎn)移同時(shí)結(jié)合皮下注射IL-2可以改善某些晚期癌癥患者的總生存率[35]。Zhang等[36]發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用細(xì)胞因子刺激的NK細(xì)胞和T細(xì)胞聯(lián)合過繼轉(zhuǎn)移后，非小細(xì)胞肺癌患者的生存期延長(zhǎng)。此外，在接受冷凍手術(shù)和離體細(xì)胞因子刺激的NK細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移治療后，晚期非小細(xì)胞肺癌患者免疫細(xì)胞功能和生活質(zhì)量得到一定程度的改善[37]?；贗L-2的治療存在兩個(gè)主要障礙，劑量相關(guān)毒性(主要是血管滲漏)以及誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活化和擴(kuò)增，導(dǎo)致NK細(xì)胞功能受到抑制，而IL-15在維持NK細(xì)胞功能的同時(shí)并不誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的擴(kuò)增[38-39]，因此，在選擇刺激NK細(xì)胞的細(xì)胞因子時(shí)，IL-15可能是更好的選擇。

3.3針對(duì)Dickkopf相關(guān)蛋白2(dickkopf related protein 2，DKK2)抗體的NK細(xì)胞激活療法 DKK2是Wnt拮抗劑，而Wnt信號(hào)通路控制著廣泛的細(xì)胞分化過程，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的失調(diào)會(huì)引起包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病[40-41]。在非小細(xì)胞肺癌中，通常出現(xiàn)Kras基因和Apc基因突變。在Apc突變的肺癌中，DKK2表達(dá)顯著上調(diào)，DKK2增加在導(dǎo)致細(xì)胞分化失調(diào)的同時(shí)，還通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境促進(jìn)肺癌進(jìn)展。Shen等[42]使用抗DKK2抗體處理攜帶激活Kras突變和Apc缺失的小鼠肺癌模型發(fā)現(xiàn)，腫瘤明顯縮小，且腫瘤組織中NK細(xì)胞的活性增強(qiáng)，表明可以利用DKK2抗體通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境中NK細(xì)胞的活性抑制癌癥生長(zhǎng)，可為具有Apc突變的非小細(xì)胞肺癌提供了一種新的治療方法，

3.4嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK細(xì)胞療法 NK細(xì)胞可介導(dǎo)抗腫瘤作用，但無誘發(fā)移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)。CAR的基本結(jié)構(gòu)包括胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)共刺激信號(hào)結(jié)構(gòu)域[43-44]。為了提高NK細(xì)胞對(duì)耐藥癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性，人們對(duì)CAR NK細(xì)胞進(jìn)行了相應(yīng)的研究。在CAR NK細(xì)胞中，屬于腫瘤壞死因子家族的CD137通常作為共刺激分子，借助逆轉(zhuǎn)錄病毒將腫瘤特異性靶抗原和共刺激分子轉(zhuǎn)導(dǎo)至NK細(xì)胞中，從而增強(qiáng)NK細(xì)胞的抗腫瘤活性[45]。與CAR T細(xì)胞相比，CAR NK細(xì)胞存在明顯的優(yōu)勢(shì)，CAR NK細(xì)胞具有獨(dú)立的主要組織相容性復(fù)合體、較低的移植物抗宿主反應(yīng)以及有限的壽命，從而避免了自殺基因插入CAR NK細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。臨床上已經(jīng)在急性B淋巴細(xì)胞白血病的患者中測(cè)試了靶向CD19的CAR NK細(xì)胞[46]。目前，基于NK細(xì)胞治療肺癌的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。

4 小 結(jié)

免疫治療已經(jīng)成為肺癌治療的新選擇。NK細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，得到了越來越多的關(guān)注。NK細(xì)胞在直接殺死腫瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)上，通過Fc受體表達(dá)以及釋放細(xì)胞外囊泡等方式發(fā)揮其獨(dú)特的抗腫瘤功效；但在腫瘤微環(huán)境中，仍有許多不可避免的因素通過減少NK細(xì)胞數(shù)量以及減弱NK細(xì)胞功能等方式促進(jìn)肺癌的進(jìn)展，因此，增加NK細(xì)胞數(shù)量以及上調(diào)NK細(xì)胞功能是基于NK細(xì)胞的肺癌免疫治療的關(guān)鍵。目前，在離體擴(kuò)增NK細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移療法、針對(duì)DKK2抗體的NK細(xì)胞激活療法以及嵌合抗原受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK細(xì)胞療法中，NK細(xì)胞療法已顯示出可增強(qiáng)惡性腫瘤患者臨床療效的巨大潛力，并可能在肺癌等多種實(shí)體瘤的治療中發(fā)揮作用，但仍有部分患者因缺乏腫瘤特異性NK細(xì)胞應(yīng)答而無法從免疫治療中獲益。因此，NK細(xì)胞療法與其他療法聯(lián)合可使NK細(xì)胞重新活化，以獲得滿意的腫瘤治療效果。