張 豐，蔣潤民，張 超（腫瘤生物學國家重點實驗室，空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院病理科暨基礎醫(yī)學院病理學教研室，陜西 西安 700；空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院胸外科，陜西 西安 7008；中國人民解放軍聯勤保障部隊第904醫(yī)院泌尿外科，江蘇 無錫 4000）

近年來，每年全球癌癥患者新增發(fā)病1 800萬，死亡960萬[1]。我國每年癌癥患者新增430萬，死亡290萬[2]。在我國，引起患者死亡最常見的癌癥類型是肺癌、胃癌、食道癌、肝癌和結腸癌等[2]。20世紀30年代，Ewing[3]提出腫瘤是一種自主性過度增生的組織，1961年Willis[4]將腫瘤定義為一種生長和周圍正常組織不一致、而且在缺乏誘發(fā)刺激時仍能存留和生長的腫塊。雖然腫瘤被認為是一種細胞異常增生的疾病。但是，在臨床實踐中，區(qū)分腫瘤和非腫瘤主要依賴形態(tài)結構和含水量兩個特點而不是增生指標。其中最常用也最準確的是形態(tài)結構特點，百年來病理學家根據腫瘤和正常組織細胞的形態(tài)結構差異，幾乎可以100%診斷腫瘤[5]。近50年來，影像學家通過磁共振發(fā)現，腫瘤組織相比正常組織含水百分比增加，且越惡性的腫瘤，含水比例越高[6-9]。拉曼光譜（Raman spectroscopy）儀能精確地檢測組織含水量，其可以99%敏感度區(qū)分癌與癌旁健康組織，被外科醫(yī)生用來確定腫瘤邊緣[10-12]。依據以上事實，我們推斷形態(tài)結構和含水量異常背后可能隱含癌變機制的本質，但是，至今鮮有這方面的研究報道。

目前關于癌變機制仍存在爭議和分歧[13-14]，主要存在基因突變（gene mutation）假說[15]、非整倍體（aneuploidy）假說[16]和組織場理論（tissue organization field theory）假說[13]。判斷假說好壞不能只看假說自身的解釋能力，更應重視假說的臨床應用能力。除簡要介紹以上假說外，結合本實驗室研究與獨立臨床觀察，我們還提出了另外一種全新的癌變機制假說。

1 目前流行的癌變機制假說

1.1 基因突變假說

大約一個世紀前，Hansemann等提出腫瘤是體細胞遺傳物質發(fā)生“突變”的結果[16-17]。上世紀70～80年代，Varmus和Bishop在逆轉錄病毒和癌變關系的研究過程中發(fā)現原癌基因（protooncogene），提出癌基因（oncogeng）假說[18-20]。同期，Knudson[21]根據流行病學結果提出抑癌基因突變的“二次打擊假說”，隨后抑癌基因被發(fā)現并被克隆[22]。由于大部分致癌劑可以導致基因突變[23]，因此，基因突變積累的癌變假說（基因突變假說）被提出[24]。隨后，該假說獲得了大量的實驗證據支持，典型的例子有：90年代初Fearon等[25]提出結腸癌多步癌變模式；1999年Weinberg實驗室用三個不同的突變基因首次將人類健康細胞轉變?yōu)榘┘毎鸞26]；近二三十年來轉基因和基因剔除動物癌變率升高，多基因突變導致動物惡性腫瘤發(fā)生率升高[27]；動物腫瘤細胞內癌基因信號被阻斷可抑制癌細胞增殖[15,28]；近年來，針對癌基因突變的藥物已應用于臨床治療，一些藥物取得顯著療效，例如靶向BCR-ABL融合癌基因治療慢性粒細胞白血病的格列衛(wèi)。

雖然基因突變假說取得重大進展，但是該學說依然存在如下問題：①幾乎所有實體腫瘤細胞都是非整倍體核型，即除了基因突變，腫瘤細胞總存在染色體結構和數目的改變[29-31]。②上世紀70～80年代，基因突變假說認為一個癌基因或抑癌基因改變就可以導致癌變[18,21]，也有人推測腫瘤發(fā)生需要3～7個基因突變[32]，至今，癌癥基因組計劃發(fā)現腫瘤細胞存在成百上千基因突變[33-34]，增加了癌癥研究的復雜度和難度。③目前沒有一個或一組突變基因可以用來區(qū)分癌與非癌細胞[13]，而且，即使同一類型腫瘤，不同個體的腫瘤突變也不一樣[33,35]，導致分子診斷和靶向治療趨向復雜化。④靶向突變基因的治療只適用于一小部分癌癥患者[33,36-38]。

1.2 非整倍體假說

100多年前，Boveri發(fā)現海膽卵子與兩個精子形成的三倍體細胞在發(fā)育過程中丟失的某些染色體，形成的非整倍體海膽細胞形態(tài)上類似惡性腫瘤，因此Boveri提出非整倍體導致癌變的假說[16-17]。該假說在隨后幾十年沒有引起研究人員的重視，直到上世紀90年代Duesberg等重新提出的非整倍體假說，認為癌變的主要原因是非整倍體導致細胞內正?；虮磉_比例失衡，而不是個別少數基因突變[30]。該假說的主要依據是：①幾乎所有的實體腫瘤都是非整倍體核型[16-17,30,39]。②非整倍體不一定是基因突變的結果，因為端粒縮短核致癌因素都可直接導致非整倍體產生[40-41]。③非整倍體在癌前病變細胞就已經出現，非整倍體程度與腫瘤的惡性程度成正比[16]。④Duesberg等證實Weinberg實驗室用三個突變基因體外制造的腫瘤細胞是非整倍體核型[26,30]。

非整倍體假說存在如下問題：①二倍體腫瘤是否還存在爭議[31,42-44]。②非整倍體與癌變之間是否存在因果關系未能證明。③非整倍體在癌前病變和臨床診斷方面具有價值，但至今沒有開發(fā)出針對非整倍體的癌癥治療方法[45]。

1.3 組織結構場假說

早期研究人員發(fā)現化學方法誘發(fā)的腫瘤，如果停止使用促癌劑，相當一部分腫瘤會重新分化而自發(fā)消失[46]。Jaffe[47]發(fā)現卵巢細胞移植到脾臟可以自發(fā)癌變。King和McKinnell等[48-49]將青蛙的腎癌細胞核轉移到正常卵細胞中，發(fā)現這種卵細胞依然可以發(fā)育成正常的蝌蚪。Mintz和Illmensee等[50-51]將畸胎瘤細胞移植至正常同系動物的胚泡內，結果產生不長腫瘤的嵌合型小鼠。Howell和Hurris等[52-53]發(fā)現腫瘤和正常細胞的融合細胞失去惡性表型。Gootwine等[54]將白血病細胞向同系動物的早期胚胎移植，發(fā)現白血病細胞可參與正常動物血液系統(tǒng)的發(fā)育，動物發(fā)育成熟后各系血液細胞均可發(fā)現白血病細胞的基因標記。McCullough等[55]將肝癌細胞向同系成年動物肝組織移植，發(fā)現癌細胞可參與正常肝臟細胞的更新；致癌劑作用于間質細胞卻可以產生實質細胞腫瘤[56]，根據這些實驗結果，Sonnenschein和Soto提出癌變的組織場理論（tissue organization field theory , TOFT）假說，該假說認為細胞的默認狀態(tài)（default state）是增殖和移動，細胞間的相互作用可以限制細胞增殖和移動，細胞間相互作用的損壞導致細胞異常增殖、癌變和轉移，該假說認為基因突變和非整倍體都是伴隨現象[13,57-59]。

TOFT假說存在下列問題：①逆轉腫瘤只是少數現象，需要苛刻的條件。②TOFT假說至今沒有在癌癥、預防、診斷或治療方面提供有效的幫助。

2 癌變機制新假說——細胞內滲透壓失控假說

理解增生的本質，是深入理解癌變機制的基礎。細胞增生的動力來自哪里？長期以來，該問題很少受到研究人員的重視。傳統(tǒng)觀點認為生長因子、細胞內原癌基因和細胞周期調節(jié)基因激活促進細胞增生[15]，但是，生長因子、原癌基因和細胞周期調節(jié)基因顯然不是細胞增生的動力，最可能只是細胞增生的調節(jié)因子。

2.1 哺乳動物細胞內外滲透壓并不相等

細胞膜為脂質雙分子層，具有半透膜的特性，水分子可以自由通過，而離子和有機大分子不可以自由通過[60-61]。細胞內的離子和有機大分子的摩爾濃度一般大于細胞周圍環(huán)境中這些物質的摩爾濃度，因此細胞內的滲透壓一般大于細胞外的滲透壓。實際上，細菌、真菌和植物細胞內的滲透壓常常達到3～7個大氣壓水平[62-64]。雖然傳統(tǒng)觀點認為哺乳動物細胞內外滲透壓相等，但是，一些常見的現象提示我們，哺乳動物細胞內外的滲透壓并不天然相等，比如，短時間缺血缺氧，細胞會水腫脹大；稍長時間，細胞會腫脹壞死。因此，哺乳動物細胞內外滲透壓并不相等，我們習慣性認為細胞內外滲透壓相等其實是細胞對細胞內外滲透壓調節(jié)的結果，一旦調節(jié)機制失靈，細胞可能很快被脹破死亡。

2.2 細胞分裂的動力來自細胞內滲透壓

細菌、真菌和植物細胞依賴細胞壁對抗細胞內滲透壓，哺乳動物細胞主要依賴細胞骨架和鈉鉀泵控制細胞內滲透壓。細胞骨架主要由微管、微絲和中間絲構成，其中微絲和鈉鉀泵對于細胞內滲透壓調節(jié)具有重要作用[65-66]，由于微絲和鈉鉀泵工作需要消耗大量ATP[65,67-68]，體外實驗表明細胞產生的能量20%～70%被微絲和鈉鉀泵消耗[67-68]，因此，哺乳動物控制細胞內滲透壓需要消耗大量的能量。為了補充能量消耗，細胞需要從環(huán)境中吸收糖、脂肪和蛋白質等營養(yǎng)物質，營養(yǎng)物質進入細胞會引起細胞內滲透壓增加和細胞體積增大，細胞體積超出細胞骨架構建最大結構極限的時候，局部受力最大部位的細胞骨架可能因“損傷”而過度修復和重構，形成收縮環(huán)（contractile ring），收縮環(huán)克服細胞內滲透壓，將細胞一分為二，完成細胞分裂。因此，本文認為細胞增生的動力來自細胞內滲透壓，細胞周期性分裂的目的在于周期性地降低細胞內滲透壓，地球上各種生命的細胞其實只是水“吹起的泡泡”而已[69]。

很多自然現象和實驗證據支持細胞內滲透壓是細胞分裂的動力。地球上水多的地方，生命繁茂，而水少的地方，生命稀少。人胚胎細胞含水量達到90%，兒童細胞含水量可達80%，成年人細胞含水量約70%，老年人細胞含水量約60%[70-71]。具有分裂能力的皮膚細胞居于基底層或真皮層的毛囊部位，皮膚表層細胞容易脫水失去增生能力而分化和角化[72]。間充質干細胞向軟骨細胞分化時，軟骨細胞首先發(fā)生在距離血管最遠的間充質干細胞核心聚集的無血管區(qū)[73]。在動物體內，干細胞一般聚集在毛細血管周圍，而分化的細胞遠離血管[74]。上述現象提示細胞含水量下降，細胞增生速度下降或分化。細菌、真菌和植物細胞都先體積脹大才開始DNA復制和細胞分裂，而脹大的力量來自滲透壓[62,64,75-77]。哺乳動物細胞分裂過程中體積首先會不斷增大，該過程依然依賴滲透壓[65,78-79]。沒有滲透壓引起的向外的脹力，細胞核會因為細胞骨架和核基質而回縮，比如，早期凋亡的細胞表現為細胞核固縮。由于真核細胞的核內空間有限，細胞核致密且具有很強的韌性，如果沒有多余的空間，DNA無法復制[80-83]，因此，滲透壓推動細胞體積脹大的同時，通過細胞骨架牽拉細胞核膜，促進細胞核體積增大，為DNA復制提供空間，促進DNA復制。類似道理，牽拉皮膚促進細胞分裂，可用于擴大植皮面積[84-85]。體外細胞培養(yǎng)實驗表明，低滲環(huán)境促進細胞增殖[86]，但是高滲環(huán)境不但抑制細胞增殖[87]而且促進細胞分化或凋亡[72,88-90]。原子力顯微鏡實驗證實細胞分裂時細胞內壓力不斷增大，從G1期開始上升，到M期時到達最高點，隨著細胞分裂，壓力迅速下降[65]。Huang等[91]將M期的細胞浸泡在低滲溶液中，正在分裂的細胞迅速退出M期，再次把退出M期的細胞放回等滲溶液，細胞又重新進入M期，并最終完成細胞分裂過程，該實驗證明M期細胞分裂需要克服細胞內的滲透壓。M期細胞分裂依賴收縮環(huán)的收縮力克服細胞內的滲透壓，收縮環(huán)主要由微絲和肌動蛋白構成[92]，細胞松弛素可以抑制微絲組裝，其處理細胞可以導致細胞收縮環(huán)組裝異常而無法分裂，產生雙核或多核巨細胞[93]。低滲應激可迅速激活生長因子（EGFP等）和原癌基因（Src和Ras等）信號通路[94-95]。以上事實均支持細胞分裂動力來自細胞內滲透壓。

如果細胞內滲透壓是細胞分裂的動力，那么調節(jié)細胞內滲透壓可以改變細胞分裂速度。哺乳動物細胞內的滲透壓調節(jié)主要依賴細胞骨架和鈉鉀泵。大量實驗表明生長因子（EGFP等）和原癌基因（Src和Ras等）信號在G1期抑制微絲組裝，導致細胞對抗細胞內滲透壓的力量下降，水進入細胞，細胞體積增大15%～30%左右，細胞內的大分子被稀釋，合成代謝激活，細胞進入S期[96-97]，但是在M期癌基因信號（Ras等）又促進微絲重構和細胞分裂[92,98]，因此，生長因子和原癌基因信號可通過調節(jié)細胞骨架變構從而調節(jié)細胞分裂。除了細胞骨架，鈉鉀泵對于細胞內滲透壓的調節(jié)也具有重要作用，鈉鉀泵每次排出3個鈉離子和2個鉀離子以降低細胞內的離子滲透壓，從而降低細胞內整體滲透壓。細胞靜息膜電位的產生源于鈉鉀泵工作導致細胞內外離子濃度差異，靜息膜電位的高低可以間接反映鈉鉀泵的功能。有研究表明經常處于分裂狀態(tài)不穩(wěn)定細胞的靜息膜電位較低（10～30 mV），而不經常分裂的穩(wěn)定細胞（肝細胞等）的靜息膜電位中等（40～50 mV），永久性不分裂的細胞（神經元和肌肉細胞）的靜息膜電位最高（70～90 mV）[99-100]。神經元和肌肉細胞的靜息膜電位最高，說明鈉鉀泵對這些細胞的滲透壓調節(jié)最強，所以這些細胞不再增殖。與該推測一致，用哇巴因抑制鈉鉀泵，升高細胞內滲透壓，神經元細胞竟然開始DNA復制[101]。

2.3 細胞內滲透壓失控導致癌變發(fā)生

調控細胞內滲透壓可以調節(jié)細胞分裂速度。如果細胞過度控制細胞內的滲透壓，細胞可能分化或衰老；如果控制機制損壞，不能有效控制細胞內滲透壓的升高速度，細胞可能異常增生和癌變。因此，我們認為癌變是細胞內滲透壓失控的結果[69,102-103]。

2.3.1 腫瘤細胞內含水量增加腫瘤細胞的細胞骨架損壞[5,104-120]和鈉鉀泵功能下降[99,121-125]，對抗腫瘤細胞內滲透壓的能力下降，會導致更多的水進入細胞內。事實上，幾十年來磁共振反復證實腫瘤組織含水百分比增加，而且越惡性的腫瘤，含水比例越高[6-9]。近年來利用拉曼光譜儀再次證明腫瘤組織含水量增加[10-12]。

2.3.2 腫瘤細胞的細胞骨架異常臨床上病理學家一直根據腫瘤和正常組織細胞的形態(tài)結構差異診斷腫瘤[5]，組織和細胞的形態(tài)結構主要由細胞骨架決定，研究發(fā)現腫瘤細胞的細胞骨架明顯異常。首先，腫瘤細胞分化障礙，細胞分化主要與細胞骨架中間絲表達有關，中間絲包括角蛋白和神經纖維等。癌細胞分化障礙說明中間絲表達異常，典型的例子有化學誘導皮膚癌變后，癌細胞不再表達皮膚終末分化標志角蛋白K10和K1[104]。而且，角蛋白突變導致皮膚上皮細胞耐受低滲應激能力下降[126]。其次，微絲而不是微管主要參與細胞內滲透壓調節(jié)[65,127]，研究發(fā)現癌細胞的微絲組裝明顯異常，而且異常程度與惡性程度成正比[105-117]。最后，大量實驗表明癌基因Src和Ras等蛋白產物可以直接抑制微絲的組裝，降低細胞骨架微絲對抗細胞內滲透壓的能力[118-120]。

2.3.3 腫瘤細胞鈉鉀泵功能異常事實上，腫瘤細胞的靜息膜電位低于正常細胞[99,121-123]，而且多方研究表明，腫瘤細胞內的鈉濃度高于正常細胞2～5倍[123-125]，這些均提示腫瘤細胞的鈉鉀泵功能下降。

2.3.4 癌細胞存在大量基因突變和非整倍體細胞控制滲透壓的目的是協(xié)調DNA復制與細胞分裂之間的關系。癌變因素導致細胞對抗細胞內滲透壓能力下降，引起細胞提前分裂，導致DNA提前復制，甚至在沒有修復或合成完成時就發(fā)生分配，引發(fā)基因組不穩(wěn)定，基因突變率升高，核型非整倍體化。事實上，大量研究表明腫瘤細胞內DNA復制起始位點顯著增多，明顯處于提前啟動DNA復制的狀態(tài)[128-132]，而且癌癥基因組測序和核型分析證明癌細胞擁有大量的基因突變和異常核型（非整倍體）[16-17,30,33-34,39]。

2.3.5 非整倍體具有促癌作用非整倍體與癌變的關系一直存在爭議，比如，非整倍體假說認為非整倍體促進癌變[30]，但是基因突變和TOFT假說認為非整倍體只是伴隨現象[13,15]。本文認為非整倍體在同等時間內不但產生更多的RNA和蛋白質，甚至產生很多無用的RNA和蛋白質分子，因此，在相同的時間內，非整倍體導致腫瘤細胞比正常細胞滲透壓升高速度更快，從而提前啟動細胞分裂和DNA復制過程[69]，該推測得到最近的實驗支持[133]。

2.3.6 惡性腫瘤組織中，雙核或多核瘤巨細胞增多事實上，在臨床病理診斷中經?？吹诫S著腫瘤惡性度升高，雙核或多核瘤巨細胞比例增多，典型的例子有膠質瘤和腎癌[134-136]。這是由于滲透壓推動細胞走向分裂，但是細胞要一分為二，還需要微絲收縮環(huán)對抗細胞內滲透壓[91,137]，將細胞一分為二[91]。由于腫瘤細胞微絲異常，而且，越惡性的腫瘤，微絲功能受損越嚴重[105-112]，導致部分腫瘤細胞的微絲收縮環(huán)不能對抗腫瘤細胞內的滲透壓，引起細胞無法分裂，雙核和多核瘤巨細胞比列增加。

2.3.7 惡性腫瘤發(fā)生去分化惡性腫瘤存在去分化現象[5]，但是機制不清楚。劉勁松[5,135]認為惡性腫瘤去分化是癌變初期多倍體瘤細胞通過“巨細胞周期”引起基因組重編程的結果。我們認為惡性腫瘤去分化是腫瘤細胞對抗細胞內滲透壓能力下降，導致滲透壓引起向外的脹力通過細胞骨架拉伸細胞核，引起細胞核重編程的結果，支持該假說的實驗證據有低滲應激可以改變細胞核結構、染色質狀態(tài)、表觀遺傳修飾以及基因表達改變，促進細胞逆分化或轉分化[138-143]。

2.3.8 腫瘤侵襲與轉移惡性腫瘤具有侵襲和轉移的能力，但是基因測序沒有發(fā)現專職負責侵襲和轉移的突變基因[33,37]。按照TOFT假說，單細胞默認狀態(tài)是增殖和移動，細胞之間的黏附喪失導致癌變和轉移，但是，TOFT假說不能合理解釋黏附喪失的機制[13]。其實，在低滲狀液體中黏附細胞最大的表現就是在幾分鐘之內失去黏附貼壁能力而變圓，最后脹破死亡，因此，低滲應激能迅速破壞細胞的黏附能力。由于惡性腫瘤的細胞內滲透壓控制機制損壞，導致其對抗細胞內滲透壓能力下降，過多的水進入細胞，引起類似低滲應激狀態(tài)，從而失去黏附能力，因此，惡性腫瘤獲得侵襲和轉移能力。

2.3.9 在低滲環(huán)境下腫瘤細胞比正常細胞更脆弱在低滲環(huán)境下腫瘤細胞比正常細胞更脆弱，而且越惡性的腫瘤越脆弱。事實上，脆性實驗檢測發(fā)現來自白血病患者的白細胞比正常白細胞脆性更大[144-145]。雖然目前很少有人直接比較實體腫瘤細胞與正常細胞對低滲的耐受情況，但是手術后應用蒸餾水灌洗胸腔和腹腔，能明顯降低腫瘤的播散轉移，提高患者生存率[146-147]。小鼠腹腔接種胃癌后，采用腹腔注射蒸餾水方式比注射生理鹽水明顯提高小鼠生存時間[148]。

2.3.10 靶向滲透壓調控分子可以治療惡性腫瘤青霉素通過抑制細胞壁合成，借助細菌內強大的滲透壓殺死細菌[62,149]，筆者認為類似方法也可用于惡性腫瘤治療。相比正常細胞，腫瘤細胞對抗細胞內滲透壓的能力下降，而且，越惡性的腫瘤，對抗細胞內滲透壓的能力越差。由于抑制鈉鉀泵可快速升高細胞內滲透壓，因此鈉鉀泵具有抗腫瘤特性。事實上，近年來多次抗腫瘤藥物篩選實驗證明地高辛等具有明顯的抗腫瘤作用[150-152]。抑制細胞骨架可降低細胞對抗細胞內滲透壓的能力，因此細胞骨架抑制劑具有強大的抗腫瘤作用，實際上，多種細胞骨架抑制劑已在臨床應用多年[153-162]。最后，我們推測，鈉鉀泵和細胞骨架（特別是微絲）抑制劑組合可能具有協(xié)同殺死腫瘤細胞的能力，而且，新的細胞滲透壓調節(jié)分子可能成為廣譜治療惡性腫瘤的新靶點。

3 結語

本文簡要介紹了目前流行的癌變機制假說。雖然基因突變假說已經被大部分研究人員接受，該假說指引的方向已經在癌癥預防、診斷和治療方面取得了重要進展，但是，由于基因突變假說指引的方向趨于復雜化，是否有更簡單的方法用于癌癥治療是我們目前面臨的一個重要課題。非整倍體假說和TOFT假說雖然可以解釋很多癌變現象，但是這兩個假說所指引的方向沒能提供癌癥治療新方法。我們實驗室提出細胞內滲透壓失控假說，認為細胞內滲透壓失控將導致癌變發(fā)生，治療癌癥應該采取類似青霉素殺死細菌的方法，也就是借助細胞內的滲透壓殺死腫瘤細胞，并認為越惡性的腫瘤，越容易被滲透壓調節(jié)方法殺死，該方法不再考慮惡性腫瘤基因突變的異質性，因此可能成為一種簡單和廣譜的癌癥治療方法。