陳子龍，管斯琪，李海松，董雷，王彬

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院男科，北京 100700； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100006；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029)

隨著中國經(jīng)濟的持續(xù)增長，環(huán)境污染問題伴隨而來，其中大氣污染尤為嚴重。目前，大氣污染已經(jīng)是一個全球性的問題，大氣中包含各種工業(yè)排放物氣體及顆粒、汽車尾氣、生活廢氣等。諸多研究表明，大氣污染對于人體的心血管系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)均有明顯的損害作用[1-4]。其中，霧霾已成為最重要的大氣污染形式之一，也是最受關(guān)注的大氣污染研究對象。霧霾是霧和霾的統(tǒng)稱，其主要成分和起主要污染致病作用的均為霾，而霾的主要成分為大氣細顆粒物(particulate matter 2.5，PM2.5)。近年來，男性不育癥的發(fā)病率不斷升高，發(fā)病的危險因素多種多樣，由于學(xué)科發(fā)展相對較晚以及生殖系統(tǒng)本身的特性，有關(guān)PM2.5對男性生殖系統(tǒng)危害作用的報道較少，人們對PM2.5的生殖毒性作用知之甚少，但越來越多的流行病學(xué)調(diào)查和動物實驗證實了PM2.5對雄性生殖功能的影響[5-7]，并已從多個方面探索了其中可能的作用機制。同時，研究發(fā)現(xiàn)暴露于PM2.5是男性精液質(zhì)量惡化的一個危險因素[8-9]?，F(xiàn)就PM2.5的組成及概念、對男性生殖功能的危害作用及目前可能的作用機制的相關(guān)研究予以綜述，以為防治男性不育癥提供新思路。

1 PM2.5概念及成分

懸浮顆粒物(particulate matter，PM)是大氣污染物中的一個重要成分，近幾年全國各地霧霾天氣的增多，空氣能見度的下降均與PM有關(guān)，根據(jù)空氣動力學(xué)直徑其可以劃分為以下4種：PM10(直徑≤10 μm的顆粒物)、PM2.5(直徑≤2.5 μm的顆粒物)、PM1(直徑≤1 μm的顆粒物)和PM0.1(直徑≤100 nm的顆粒物)。2010年以前，國際上大多數(shù)國家還只是對PM10進行常規(guī)監(jiān)測，但隨著對空氣細顆粒物研究的不斷深入，科學(xué)家們了解到空氣動力學(xué)直徑<2.5 μm的顆粒物，因其特殊的物理特性可能危害更大，故更需要作為常規(guī)空氣監(jiān)測項目。

PM2.5的成分復(fù)雜多樣，具有地域差異性和時間差異性，即不同地域、時間、季節(jié)的空氣中PM2.5成分相差較大。PM2.5是一種復(fù)雜的混合物，具有很強的聚集效應(yīng)，可作為多種有害物質(zhì)的載體，如多環(huán)芳烴、硫酸鹽、硝酸鹽、銨、顆粒結(jié)合水、無機離子和有機元素碳[10]。雖然大氣中PM2.5含量極低，但由于其粒徑小、比表面積大，更容易攜帶空氣中的有毒有害物質(zhì)，在空氣中懸浮時間長，播散距離遠，因此較大顆粒物產(chǎn)生更嚴重的危害，吸入人體內(nèi)更容易穿透人體的保護屏障，進入呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等。長期暴露于PM2.5環(huán)境中，動脈粥樣硬化和缺血性心臟病及死亡的發(fā)生風(fēng)險增加[11]，PM2.5甚至可以通過破壞血睪屏障(blood-testis barrier，BTB)的完整性進入生殖系統(tǒng)，進而影響精子質(zhì)量，這是目前關(guān)于PM2.5的生殖毒性機制的一個重要研究方向。

2 PM2.5對生殖系統(tǒng)的影響

PM2.5暴露對男性生殖功能的影響全面而直觀，睪丸、附睪等精子產(chǎn)生、儲存和成熟的器官目前被證實會因PM2.5的暴露而出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)的水腫、萎縮甚至細胞凋亡等嚴重后果，同時下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamus-pituitary-gonadal axis，HPG軸)也會受到較大影響，繼而使男性內(nèi)分泌激素(如睪酮)水平出現(xiàn)不同程度的下降。睪酮是男性體內(nèi)最重要的激素之一，參與了精子形成的調(diào)控過程。PM2.5不僅可以通過影響睪丸、附睪和HPG軸的功能影響生殖功能，甚至可以直接作用于精子本身而導(dǎo)致精子細胞損害。

PM2.5暴露對生殖功能最重要的影響為破壞BTB的完整性。BTB是哺乳動物中最緊密的血液組織屏障之一，主要由相鄰的支持細胞與周圍結(jié)構(gòu)相互作用組成，是精子產(chǎn)生過程中各種信號通路、精子形態(tài)和細胞極性維持的基礎(chǔ)。它由緊密連接、黏附連接、縫隙連接構(gòu)成。BTB的完整性對于男性生殖系統(tǒng)的保護作用至關(guān)重要，可以防止環(huán)境毒物和機體自身產(chǎn)生的內(nèi)源性毒素進入睪丸組織，保護精子的形成和成熟過程。Cao等[12-13]的研究已發(fā)現(xiàn)，PM2.5的暴露可以導(dǎo)致睪丸Sertoli細胞的凋亡損傷及破壞BTB的完整性。

PM2.5暴露對精子質(zhì)量的影響也被不少研究證實。Cao等[13]的研究顯示，高劑量PM2.5暴露下早幼粒細胞白血病鋅指基因、Stra8(stimulated by retinoic acid gene 8)、減數(shù)分裂同源蛋白DMC1(dosage suppressor of mck1)和聯(lián)會復(fù)合體蛋白3四種重要的生精標(biāo)志物在大鼠睪丸中的表達均顯著下調(diào)，說明PM2.5暴露干擾了精子產(chǎn)生。另有研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露對于精子濃度和活力均有不同程度影響[14]。Radwan等[15]的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PM2.5、PM10、二氧化硫等空氣污染物暴露與男性精子形態(tài)異常具有顯著相關(guān)性，且增加了含有不成熟染色質(zhì)細胞的百分比。上述研究結(jié)果提示，PM2.5的長期暴露主要影響精子的數(shù)量、濃度及精子細胞的活力，甚至?xí)弋惓＞雍筒怀墒炀拥陌俜直取?/p>

此外，PM2.5暴露還可能會影響HPG軸的功能[16-17]。下丘腦弓狀核肽能神經(jīng)元分泌的促性腺激素釋放激素直接作用于腺垂體，促進促性腺細胞合成與分泌卵泡刺激素和黃體生成素，進而促進睪丸分泌睪酮，當(dāng)血中睪酮濃度達到一定水平后，睪丸又通過負反饋機制抑制促性腺激素釋放激素和卵泡刺激素、黃體生成素的分泌。HPG軸的功能失衡可導(dǎo)致睪酮分泌的紊亂，而睪酮水平的維持是精子產(chǎn)生的一個重要條件，所以PM2.5通過影響HPG軸的功能間接損害精子的產(chǎn)生。Radwan等[15]的研究顯示，包括PM2.5在內(nèi)的空氣污染物的暴露與男性睪酮水平呈負相關(guān)。

在更微觀層面，PM2.5不僅可以損傷生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)和精子細胞，還可能損傷精子DNA[14]。PM2.5的長期暴露可能會引起男性精子DNA碎片化，精子DNA碎片化異常與不育、流產(chǎn)及后代發(fā)育不良之間的密切關(guān)系被越來越多的研究證實。這可能是很多不明原因男性不育的潛在因素，也是今后研究的一個重要方向。

3 PM2.5生殖毒性的機制研究

PM2.5生殖毒性的機制研究目前仍處于起步階段，相關(guān)的BTB、細胞線粒體破壞等學(xué)說均是建立在氧化應(yīng)激基礎(chǔ)上，可能與體內(nèi)氧化與抗氧化平衡被打破有關(guān)。

3.1氧化應(yīng)激 氧化應(yīng)激是一種組織和細胞內(nèi)大量氧化中間產(chǎn)物[如活性氧類(reactive oxygen species，ROS)]與體內(nèi)抗氧化劑(如超氧化物歧化酶)之間的平衡失調(diào)狀態(tài)。ROS是指生物體在有氧代謝條件下產(chǎn)生的含氧自由基。在正常狀態(tài)下，ROS和抗氧化物質(zhì)在體內(nèi)處于一個動態(tài)平衡的狀態(tài)，但在病理條件下，如人體長期暴露于一定濃度的PM2.5環(huán)境中，機體就會產(chǎn)生大量的ROS，當(dāng)體內(nèi)ROS含量超過機體抗氧化防御能力時，平衡被打破，導(dǎo)致機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激狀態(tài)。

很多研究證明，PM2.5暴露是氧化應(yīng)激狀態(tài)形成的一個重要影響因素[18-20]。氧化應(yīng)激狀態(tài)對于細胞的損害作用巨大，是觸發(fā)細胞病理過程的主要因素，引起細胞炎癥反應(yīng)、導(dǎo)致細胞凋亡等，這與氧化還原敏感信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān)[21-22]。研究顯示，ROS在一定范圍內(nèi)的升高會激活抗氧化系統(tǒng)，提高包括超氧化物歧化酶在內(nèi)的抗氧化酶水平[23]，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶及過氧化氫酶等抗氧化酶水平應(yīng)激性升高，可抵消ROS水平升高產(chǎn)生的不利影響[24]，但是隨著ROS水平不斷升高，抗氧化物酶會被耗盡，進而導(dǎo)致正常細胞和組織的氧化損傷[25]。一方面，睪丸中的高水平氧化應(yīng)激可使得脂質(zhì)過氧化物、異前列烷不斷累積，抗氧化酶以及睪丸谷胱甘肽的消耗增加，生精細胞凋亡率升高，影響精子的產(chǎn)生。另一方面，睪丸間質(zhì)細胞凋亡，雄激素合成與分泌減少，可影響生殖器官的正常發(fā)育和精子的生成。

3.2破壞BTB完整性 基于體內(nèi)氧化應(yīng)激的狀態(tài)，可繼發(fā)相關(guān)生殖系統(tǒng)細胞損傷甚至凋亡以及精子細胞本身的損傷，其中對于BTB完整性的破壞作用最先出現(xiàn)。

BTB是血管與輸精管之間的重要屏障，在保護生殖細胞免受外界有害物質(zhì)侵害方面起著至關(guān)重要的作用，從而保護精子生成和男性生殖功能[26]。持續(xù)嚴重的氧化應(yīng)激可引起細胞凋亡或壞死，從而進一步導(dǎo)致BTB完整性的破壞，已被證明是男性生殖功能損傷的重要原因[27]。其機制為過量PM2.5刺激睪丸組織產(chǎn)生大量ROS，形成局部氧化應(yīng)激狀態(tài)，睪丸組織過氧化，進而損傷BTB的緊密連接以及睪丸Sertoli細胞黏附功能，破壞BTB的完整性，使BTB原有的屏障功能喪失，毒性物質(zhì)易于進入睪丸影響精子的正常生成，造成生殖功能下降。

另外，檢測BTB連接結(jié)構(gòu)的相關(guān)蛋白表達水平也能證實PM2.5暴露對BTB的損傷作用。Occludin蛋白是BTB緊密連接的重要組成部分[28-29]，緊密連接蛋白1與Occludin蛋白共同定位于生精小管基部，形成緊密連接，是維持BTB完整性的重要物質(zhì)[28,30]。大鼠睪丸細胞黏附復(fù)合體的重要成分β聯(lián)蛋白[31]可作為黏附連接的代表蛋白。連接蛋白43是縫隙連接的代表蛋白[32]。研究發(fā)現(xiàn)，暴露于PM2.5后，BTB超微結(jié)構(gòu)改變，Occludin蛋白、緊密連接蛋白1、β聯(lián)蛋白和連接蛋白43四種連接蛋白在睪丸中的水平均顯著降低，表明PM2.5暴露后，BTB的緊密連接、黏附連接和縫隙連接的完整性受到破壞[33]。

3.3損傷細胞線粒體 過量的ROS不僅可以影響生精微環(huán)境，也可以直接作用于精子細胞，導(dǎo)致生殖功能下降。細胞最直接的能量供體是線粒體，ATP水平直接反映線粒體功能狀態(tài)[34]。研究顯示，ROS可誘導(dǎo)線粒體功能障礙，導(dǎo)致ATP耗盡，最終導(dǎo)致細胞死亡[35]。文獻報道，吸入PM2.5可通過破壞三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化導(dǎo)致線粒體損傷，減少ATP的產(chǎn)生[36-37]。Zhang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于PM2.5 24 h后可觀察到小鼠精母細胞系(GC-2spd)的超微結(jié)構(gòu)，GC-2spd細胞胞質(zhì)內(nèi)可見明顯的液泡變細和線粒體腫脹。線粒體結(jié)構(gòu)受損會影響細胞能量的產(chǎn)生，而能量不足影響精子的成熟[38]。因此，氧化應(yīng)激引起線粒體損傷導(dǎo)致的能量代謝障礙可能是PM2.5導(dǎo)致精子活力降低的原因之一。臨床基于這一原理使用左卡尼汀治療弱精子癥，為精子細胞線粒體供能，提升精子活力。

3.4損傷精子質(zhì)膜和核內(nèi)DNA 精子質(zhì)膜中高濃度的多不飽和脂肪酸極易受到氧化損傷，導(dǎo)致精子細胞膜完整性破壞[39]。氧化應(yīng)激作用降解脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，破壞細胞膜完整性，引起不可逆的變化，而白細胞和未成熟精子產(chǎn)生的過量ROS則會損害精子細胞核DNA的完整性[40]。Simon和Carrell[41]的研究也顯示，精子細胞核對氧化應(yīng)激缺乏抵抗力，容易受到氧化應(yīng)激引起的DNA損傷。因此，氧化應(yīng)激可能在PM2.5誘導(dǎo)的雄性精子損傷中起重要作用，既會損傷精子細胞的線粒體，導(dǎo)致線粒體供能障礙，也能直接損傷細胞膜和細胞核DNA。

4 PM2.5生殖毒性機制相關(guān)通路研究

在分子水平上，與PM2.5誘導(dǎo)的生殖毒性相關(guān)的分子和通路研究較少，其中研究較多的為磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路和轉(zhuǎn)化生長因子-β3(transforming growth factor-β3，TGF-β3)/p38促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路。

4.1PI3K/Akt信號通路 PI3K/Akt信號通路在機體細胞生長過程中起重要作用，參與維持細胞的生物學(xué)特性，是目前研究最多，也是公認的與PM2.5誘導(dǎo)細胞凋亡相關(guān)的信號通路。PI3K/Akt通路是一個調(diào)節(jié)細胞生存和死亡的重要通路，營養(yǎng)不足、缺氧、外界壓力等應(yīng)激條件均會抑制PI3K的活性，從而使下游Akt活化減少，抑制細胞增殖，細胞自噬水平上調(diào)，最終導(dǎo)致細胞死亡[42]。體外研究發(fā)現(xiàn)，ROS可通過PI3K/Akt信號通路產(chǎn)生，磷酸化的Akt具有促進ROS產(chǎn)生的作用[43-44]。PM2.5暴露后PI3K和磷酸化的Akt的表達水平顯著升高，而磷酸化的Akt主要位于Sertoli細胞中。PM2.5誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激被認為是PM2.5介導(dǎo)的細胞毒性的關(guān)鍵分子機制[45]。由此推斷，PM2.5通過上調(diào)PI3K/Akt信號通路，升高體內(nèi)ROS水平，引起Sertoli細胞氧化應(yīng)激[36]或細胞過度自噬，破壞精子生成的過程。

4.2TGF-β3/p38 MAPK信號通路 TGF-β3/p38 MAPK信號通路在PM2.5誘導(dǎo)過程中也發(fā)揮重要作用。TGF-β3在睪丸Sertoli細胞的重構(gòu)中起重要作用[46-47]。有研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露后大鼠睪丸中TGF-β3的水平明顯升高[48]，表明TGF-β3可能是PM2.5大鼠睪丸損傷的重要介質(zhì)，介導(dǎo)睪丸損傷的MAPK信號通路主要包括p38 MAPK、c-Jun氨基端激酶和胞外信號調(diào)節(jié)激酶三個信號分子[49-50]，同時p38 MAPK是細胞因子TGF-β3的下游分子[51-52]。研究發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露后，p38 MAPK蛋白水平和磷酸化的p38/p38 MAPK比例均升高，Bcl-2相關(guān)X蛋白/Bcl-2蛋白比例也增加，從而促進了細胞凋亡[48]。所以推測，PM2.5暴露通過產(chǎn)生ROS激活TGF-β3/p38 MAPK信號通路介導(dǎo)的睪丸損傷，導(dǎo)致BTB完整性破壞和細胞凋亡增加，造成生殖損傷。

5 小 結(jié)

PM2.5是當(dāng)今世界面臨的不可忽視的大氣污染問題，嚴重危害人類健康。國內(nèi)外研究明確顯示，PM2.5暴露能夠引起男性精子質(zhì)量損害[8,53]，然而其機制仍不十分明確。PM2.5暴露引起睪丸組織氧化應(yīng)激，睪丸內(nèi)細胞發(fā)生氧化損傷，支持細胞、生精細胞和間質(zhì)細胞等凋亡增加，BTB完整性破壞，生精微環(huán)境破壞，精子質(zhì)量下降，導(dǎo)致男性不育。由于精子發(fā)生是一個相當(dāng)復(fù)雜的過程，而目前國內(nèi)外對PM2.5的生殖毒性的研究尚處于起步階段，相關(guān)研究尚不夠充分，對于PM2.5暴露破壞BTB完整性后如何造成生精損傷的具體機制有待進一步研究。