姚帆，孫鐵 綜述 邵毅 審校

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，南昌 330006)

干眼(dry eye，DE)是眼表的一種多因素疾病，特征是淚膜穩(wěn)態(tài)的喪失并伴有眼表癥狀，其病因包括淚膜不穩(wěn)定、淚液高滲性、眼表炎癥與損傷和神經(jīng)感覺異常[1]。DE作為眼科的常見疾病，血源性滴眼液的治療方法的方式已經(jīng)成為趨勢。但由于多種因素的限制，不同專家或不同地區(qū)對血源性滴眼液的來源、制備、儲存等存在不同的見解。本文對多種來源的血源性滴眼液進(jìn)行闡述，總結(jié)了其制備方法、儲存及安全性達(dá)成的共識，旨在通過更多的臨床指南為患者提供個體化、高質(zhì)量及有效的治療策略。

1 血源性滴眼液

眼表是眼部一種特殊的組織結(jié)構(gòu)，包括從上下眼瞼皮膚和黏膜移行處到上下瞼、球結(jié)膜返折處再到角鞏膜緣和角膜的所有組織[2]。20世紀(jì)70年代，人們首次發(fā)現(xiàn)自體血清可用于治療眼部化學(xué)性燒傷[3]，而后沿用至治療干燥綜合征相關(guān)性DE患者[4]，并逐漸在眼科治療中流行，并且有研究總結(jié)這些血液制品的來源包括自體和供體，而供體來源又包括同種異體外周血血清和成人臍帶血，并以血清、富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)、富生長因子血漿(grow factor-rich plasma，PRGF)和血小板裂解液(platelet lysate，PL)的形式制備[5]，近幾十年來，血源性滴眼液已被廣泛應(yīng)用于各種眼表疾病的治療，主要包括DE、持續(xù)性角膜上皮缺損(persistent epithelial defect，PED)、無菌性角膜潰瘍、眼表燒傷、復(fù)發(fā)性角膜侵蝕(recurrent corneal erosion，RCE)、眼部移植物抗宿主病(ocular graft-versus-host disease，oGVHD)和角膜緣干細(xì)胞缺乏癥(limbal stem-cell deficiency，LSTD)[6]。血源性產(chǎn)品未來可根據(jù)每個患者和眼表疾病的不同選擇合適的生長因子及細(xì)胞因子含量，從而引入特制的血源性滴眼液(serum-derived eye drops，SED)[6]，它是通過在眼表提供生長因子和細(xì)胞因子的活性混合物來刺激細(xì)胞增殖和遷移，從而模仿天然淚液所發(fā)揮的功能[6]。

SED是包含碳水化合物、脂質(zhì)、各種電解質(zhì)、比淚液總濃度高十倍的蛋白質(zhì)，以及凝血過程中血小板α顆粒脫顆粒釋放的上皮營養(yǎng)生長因子的一種混合物[7-8]。由于這些特性，SED才被看作是一種有效且不良反應(yīng)少的治療方法。不僅如此，SED還是英國唯一一種營養(yǎng)淚膜替代品，具有生物學(xué)特性，可幫助提供促進(jìn)上皮細(xì)胞更新和恢復(fù)穩(wěn)態(tài)的眼表環(huán)境[9]。

2 自體血清滴眼液

自體血清滴眼液(autologous serum eye drop，auto-SED)顧名思義，是由自體血清而制成的滴眼液，而這種滴眼液比傳統(tǒng)療法有潛在的優(yōu)勢，因?yàn)樗粌H可以作為淚腺的替代品提供潤滑，而且包含其他生化成分，使其更接近天然淚液[10]。有研究[11]結(jié)果表明：auto-SED被認(rèn)為是安全、有效且可用于治療各種眼表疾病的方法，包括原發(fā)性和繼發(fā)性干燥綜合征(Sj?gren syndrome，SS)引起的DE。

2.1 制備

血清是全血凝固后殘留的成分，它包含存在于淚液中的許多成分。自體血清是從患者自身的外周血清中獲得的。生產(chǎn)方法需考慮凝血時間、離心參數(shù)、稀釋、儲存時間和溫度等因素，這些因素決定了最終產(chǎn)品的質(zhì)量和特點(diǎn)。由于制備過程需要考慮的這些因素過于繁雜以及精細(xì)，迄今為止，尚未就制備auto-SED的技術(shù)細(xì)節(jié)達(dá)成共識。因此，用于治療DE的SED的配方在很大程度上取決于國家或地區(qū)血液機(jī)構(gòu)建立的獨(dú)立血液中心的經(jīng)驗(yàn)，以下是與生物醫(yī)學(xué)卓越安全輸血(biomedical excellence for safer transfusion，BEST)合作進(jìn)行的一項(xiàng)最新調(diào)查發(fā)現(xiàn)的制備SED的方法[12]。簡單地說，從患者身上取50～100 mL的全血，室溫靜置 2 h。然后，以3 000 g離心15 min將血清與固體成分完全分離。接下來，將平衡鹽溶液(balanced salt solution，BSS)或等滲液加入到上清液即血清中，直到達(dá)到所需的濃度，最終即制備完成。自體血清必須在?20 ℃下儲存且最多儲存3個月，它必須避光保存，以避免維生素A的退化[13]。

2.2 稀釋

BEST調(diào)查報告[14]顯示：近一半的血液中心配藥前稀釋血清目的是降低潛在的抗增殖因子的生理濃度水平，如轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)。事實(shí)上，這項(xiàng)調(diào)查已經(jīng)表明當(dāng)角膜損傷后，在愈合時，TGF-β在肌成纖維細(xì)胞的成熟過程中起主要作用，它產(chǎn)生雜亂無章的細(xì)胞外基質(zhì)，且該基質(zhì)會導(dǎo)致透明度的損失。已知TGF-β具有劑量依賴性的抗增殖特性，其平均水平通常比天然淚液高5倍，所以通常將其稀釋20%使用，避免帶來影響上皮損傷愈合的潛在危害[15]。然而，血清的稀釋會導(dǎo)致營養(yǎng)因子的水平下降，這也潛在地限制了它的療效。等滲性滴眼液在眼表的應(yīng)用能避免由于滲透壓的波動引起眼表損傷的發(fā)生，這是一個特別的發(fā)現(xiàn)，即高滲透壓(＞308 mOsm/L)在重度DE的病理生理學(xué)中，被認(rèn)為是關(guān)鍵的致病因素以及DE惡性循環(huán)的致病因素[16-17]。有了上述證據(jù)，就不能排除可能根據(jù)所治療的疾病或其程度調(diào)整制劑的情況。

2.3 儲存

血清制劑的建議最長保存時間存在顯著的差異，部分是由于國際法律法規(guī)的差異。冷凍保存血清瓶以保持上皮營養(yǎng)因子的活性尤為重要，目前有研究表明血清制品可在?20 ℃保存6個月[18]。

2.4 安全性

應(yīng)避免接觸受污染的auto-SED，尤其是DE患者，原因是這些患者由于存在眼表的病變而具有更高的感染風(fēng)險。SED通常在開放式系統(tǒng)中制備，但在制備過程中仍然有潛在的污染風(fēng)險。文獻(xiàn)[19]已經(jīng)報道了與污染有關(guān)的不良反應(yīng)。

為提高安全性，市場上已經(jīng)提出了密封的制備系統(tǒng)(將滴眼液包裝進(jìn)小瓶中或長管中，然后將其熱封以生產(chǎn)一次性設(shè)備)[20-22]，但是在許多血液中心，財務(wù)和物流障礙仍然難以克服。由于血清溶液環(huán)境有利于微生物的生長，在制備過程中必須謹(jǐn)慎，以確保滴眼液是在無菌狀態(tài)下制備，且必須遵循適當(dāng)?shù)谋４婧褪褂谜f明[23]。

auto-SED的其他缺點(diǎn)是經(jīng)常抽血不方便，因?yàn)橛行┤伺蚂o脈穿刺且治療時間長。綜上所述，auto-SED雖然在原理上可以作為一種有效的DE治療方法，但不論是制備、稀釋、儲存還是安全性方面都有許多需要特別注意的因素，對自體血清治療眼表損傷進(jìn)行探索仍充滿挑戰(zhàn)。因?yàn)檠宀皇莻鹘y(tǒng)的血液產(chǎn)品，關(guān)于應(yīng)將SED視為血液產(chǎn)品還是一種藥物仍然存在爭論[24]。

3 同種異體血清滴眼液

同種異體血清滴眼液(allogeneic serum eye drop，allo-SED)就是使用供體來源制備的SED，據(jù)報道，SS和oGVHD代表2種可導(dǎo)致嚴(yán)重DE最常見的原因，這些患者的血清中可能含有高濃度的促炎性介質(zhì)，對眼表具有潛在的傷害[25]。這種SED使用的適應(yīng)證包括：患者自體血清不適合、無法使用或無法進(jìn)行重復(fù)采血，包括病毒感染、敗血癥、嚴(yán)重貧血患者和多系統(tǒng)疾病的老年患 者[26]。因此，使用allo-SED時我們要確認(rèn)患者是否可用、有無禁忌證。另外，當(dāng)?shù)窝垡簛碜怨w時，必須執(zhí)行ABO血型匹配的程序，以確保供體和受體之間血型匹配。有一種選擇是從AB血型獻(xiàn)血者處獲得，以保持單一的血型來源[27]。

allo-SED的制備方法與auto-SED相同。血液被采集并室溫儲存到凝固。然后，將血清以3 000 g 離心15 min，過濾，稀釋至20%濃度[28]。因此，從健康供體獲得的allo-SED已被引入作為一種可能的替代方案。

4 同種異體臍帶血血清滴眼液

相對于allo-SED，臍帶血血清(umbilical cord blood serum，UCBS)也有使用的適應(yīng)證，它代表了針對全身性疾病或其他由于自身血清中存在炎癥介質(zhì)而可能禁止使用自體血清滴眼液的患者的可能療法。它的優(yōu)勢之一在于可以從臍靜脈收集大量血液，因此可以同時為多位患者準(zhǔn)備[29-30]。與其他血液來源的制劑相比，UCBS的生長因子(grow factor，GF)濃度較高，例如表皮細(xì)胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)、TGF-β、神經(jīng)生長因子(nerve grow factor，NGF)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)[31]。另外由于UCBS含有抗菌成分如免疫球蛋白G、溶菌酶和補(bǔ)體，因此具有抑菌效果[32]。研究[33]表明:從年輕母親(＜30歲)采集的血液樣本具有較高的EGF濃度，分娩時間越長(＞6 h)，CD34+細(xì)胞含量越高，這種預(yù)選擇可能有助于在EGF中獲得理想濃度的UCBS，無需達(dá)到GF實(shí)驗(yàn)室劑量即可治愈角膜傷口。每一種GF都有選擇性地調(diào)節(jié)角膜愈合過程中涉及的細(xì)胞過程，因此可根據(jù)角膜病變的類型和嚴(yán)重程度，針對性地提供特定的GF[34]。

在順產(chǎn)和剖宮產(chǎn)時收集母親的臍帶血血清。從分娩后的臍靜脈收集10～ 20 mL的臍帶血。血液在室溫下凝固2 h，3 000 g離心15 min后，在無菌條件下，在層流罩中仔細(xì)分離血清。然后，用BSS稀釋達(dá)到20%的濃度。將血清注入無菌的 1 mL小瓶中，用紫外線燈照射保護(hù)。

為避免血源性疾病的傳播，必須配制前必須進(jìn)行HCV(丙型肝炎病毒)、HBV(乙型肝炎病毒)、HIV(人類免疫缺陷病毒)、梅毒、弓形蟲和CMV(巨細(xì)胞病毒)的檢測?？梢?，來源于USBS的SED也可作為一種DE的治療方法。

5 血小板源性滴眼液

血小板在凝血過程中發(fā)揮重要作用，在傷口愈合過程中起主要作用，因?yàn)樗鼈兊摩令w粒中含有高濃度的GF和凝血因子，例如血小板來源生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)、TGF-β、EGF[35]。最近已經(jīng)引入了各種制劑(即由來源于PRP、PRGF和血小板裂解產(chǎn)物的制劑)作為不同眼表疾病的可能療法。在血小板源滴眼液中，自體來源的血液產(chǎn)品仍然為DE患者使用最多的，而針對其他應(yīng)用領(lǐng)域開發(fā)的作為滴眼液治療的同種異體PRP仍處于起步階段。

5.1 PRP

富血小板血漿是從血小板濃度超過1×106/mL的血漿中獲得的。第1次低力離心(200～600 g，10 min)將全血分成三層，將上層和淺層表皮層轉(zhuǎn)移到另一個無菌試管中，以更高的速度進(jìn)行第二個離心步驟(700～2 300 g，10 min)，以濃縮血小板。將上2/3的體積丟棄，而將下1/3勻漿，通過輕輕搖動試管以產(chǎn)生PRP。該產(chǎn)品可以未經(jīng)稀釋或在BSS中稀釋使用，密封在小瓶中，在4 ℃最多保存1周，而在20℃可保存更長時間[36]。

5.2 PRGF

在Endoret系統(tǒng)離心機(jī)中，將收集的血液在室溫下以580 g離心8 min。離心后，使用Endoret眼科試劑盒收集PRGF，避開含有白細(xì)胞的層次。PRGF滴眼液在37 ℃下孵育1 h；將獲得的上清液在56 ℃下熱處理60 min，以消除補(bǔ)體和其他免疫學(xué)成分，并獲得所謂的“免疫安全PRGF”。最后，將血漿上清液過濾，等分并保存在?20 ℃。PRGF滴眼液在?20 ℃保質(zhì)期為3個月[37]。在一項(xiàng)研究[38]中，所有分析的GF水平在每次不同儲存條件下都保持不變。在任何研究時間或溫度下，使用PRGF滴眼液后，均未觀察到角化細(xì)胞增殖活性的差異。最后，PRGF滴眼液中沒有微生物污染。

5.3 血小板裂解產(chǎn)物

從每位患者中收集60 mL抗凝的外周血，然后離心以獲得自體血小板濃縮物。將濃縮液冷凍并融化以裂解血小板并釋放GF。然后將裂解物用無菌平衡鹽溶液稀釋，并分裝成30份備用的無菌劑量。在制備時會采集用于微生物學(xué)研究的樣品。最終應(yīng)在?20 ℃冰箱中冷凍存放，最長保存45 d[39-40]。

通過上述研究，我們可以了解到血小板源性滴眼液有多種形式，其制備方法、儲存方式等不盡相同，使用者們可以根據(jù)自己的需求以及適應(yīng)證來選擇合適的滴眼液。

6 結(jié)語

SED能提供活性物質(zhì)比如谷胱甘肽和細(xì)胞因子等眼淚中的活性成分，模擬淚液的功能，可作為治療DE等眼表疾病的一種新興治療選擇。目前多項(xiàng)指南皆建議SED對急性和慢性嚴(yán)重眼表疾病的患者(包括嚴(yán)重DE患者、持續(xù)性和復(fù)發(fā)性角膜上皮缺損患者、神經(jīng)營養(yǎng)性角膜病變患者)以及需要手術(shù)支持治療的患者治療有所幫助?，F(xiàn)如今，自體來源的血清制品相較于異體來源使用更廣且技術(shù)更成熟，但異體來源的產(chǎn)品正在逐漸進(jìn)步。對于SED的應(yīng)用前的制備參數(shù)、保存條件、臨床治療策略等的選擇和評估尤為重要。目前，我們?nèi)孕韪嗟碾S機(jī)臨床試驗(yàn)來為國際公認(rèn)的統(tǒng)一指南標(biāo)準(zhǔn)提供更多的證據(jù)，從而確定血清成分中的生物物種可變性以提高最終的血清眼藥水的質(zhì)量，進(jìn)一步確定檢測有效性的生物標(biāo)志物，以及確定每種適應(yīng)癥SED治療的最佳頻率、計量和持續(xù)時間，以確定治療的有效性，使得血液療法能夠廣泛而成熟地運(yùn)用于眼科疾病的治療。