李薔薇,雷 瑩,劉 婧,李 維*,李 強(qiáng)

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)院 四川抗菌素工業(yè)研究所 抗生素研究與再評(píng)價(jià)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610052;2.國(guó)藥集團(tuán)川抗制藥有限公司,成都 610052)

硫酸特布他林,化學(xué)名為[(叔丁氨基)甲基]-3,5-二羥基苯甲醇硫酸鹽(2∶1),又名博利康尼,其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。硫酸特布他林為白色或類白色結(jié)晶性粉末,無(wú)臭,或微有乙酸味,遇光逐漸變色,在水中易溶,在甲醇中微溶,在三氯甲烷中幾乎不溶[1]。硫酸特布他林對(duì)腎上腺素β2受體具有高度選擇性,適用于支氣管哮喘、慢性支氣管炎、肺氣腫和其他伴有支氣管痙攣的肺部疾病的治療,在國(guó)內(nèi)外已得到廣泛的應(yīng)用[2]。

硫酸特布他林目前常見(jiàn)的劑型是霧化液和片劑,但其生物利用度較低。本課題組前期采用硫酸特布他林原料和大豆磷脂制備了一種生物利用度較高的磷脂復(fù)合物,該復(fù)合物可增加藥物分子的親脂性,促進(jìn)藥物吸收,從而提高了磷酸特布他林的生物利用度。

目前,磷酸特布他林的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[1-7]和紫外-可見(jiàn)分光光度法(UVVis)[8]。UV-Vis簡(jiǎn)單快捷,但選擇性和靈敏度較差,不能將硫酸特布他林與大豆磷脂及其他物質(zhì)有效分離,具有一定的局限性;HPLC選擇性和靈敏度高,可將硫酸特布他林與大豆磷脂及其他物質(zhì)較好地分離,并測(cè)定其含量[8]。本工作在前期制備好的硫酸特布他林磷脂復(fù)合物的基礎(chǔ)上,參考《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版,通過(guò)優(yōu)化色譜條件,建立了HPLC測(cè)定磷脂復(fù)合物中硫酸特布他林含量的方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1200型高效液相色譜儀,配紫外吸收檢測(cè)器;UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì);XSE105 Dual-Range型電子天平;FE28型p H計(jì);DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器;Rotavapor R-114型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

辛烷磺酸鈉溶液:6.5 mmol·L－1,稱取辛烷磺酸鈉1.522 9 g,用水溶解并定容至1 L容量瓶中,配制成濃度為6.5 mmol·L－1的辛烷磺酸鈉溶液。

硫酸特布他林對(duì)照品儲(chǔ)備溶液:1.042 9 g·L－1,稱取硫酸特布他林對(duì)照品10.429 mg,加入1 mL水溶解,再用體積比為35∶65的乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸鈉溶液的混合液(p H 3.4)定容至10 mL容量瓶中,搖勻,避光保存。

硫酸特布他林對(duì)照品溶液:104.3 mg·L－1,移取1 mL硫酸特布他林對(duì)照品儲(chǔ)備溶液于10 mL容量瓶中,用體積比為35∶65的乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸鈉溶液的混合液(p H 3.4)稀釋至刻度,搖勻,避光保存。

大豆磷脂溶液:2.0 g·L－1,稱取大豆磷脂200 mg于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,再移取上述溶液1 mL于10 mL容量瓶中,用體積比為35∶65的乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸鈉溶液的混合液(p H 3.4)稀釋至刻度,搖勻,避光保存。

硫酸特布他林對(duì)照品溶液系列:分別移取0.5,1.0,2.5,5.0,10.0,25.0,50.0 mL硫酸特布他林對(duì)照品儲(chǔ)備溶液,用體積比為35∶65的乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸鈉溶液的混合液(p H 3.4)稀釋,并定容至100 mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度為 5.2,10.4,26.1,52.1,104.3,260.7,521.4 mg·L－1的硫酸特布他林對(duì)照品溶液系列。

硫酸特布他林對(duì)照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%;硫酸特布他林原料的純度為99.2%;辛烷磺酸鈉為分析純;乙腈、甲醇為色譜純;大豆磷脂為化學(xué)純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

AQUASIL?-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱溫30℃;流量1.0 mL·min－1;進(jìn)樣量20μL;流動(dòng)相為體積比為35∶65的乙腈-6.5 mmol·L－1辛 烷 磺 酸 鈉 溶 液 的 混 合 液(p H 3.4),等度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取自制的硫酸特布他林磷脂復(fù)合物210 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,搖勻,再移取上述溶液1 mL于10 mL容量瓶中,用體積比為35∶65的乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸鈉溶液的混合液(p H 3.4)稀釋至刻度,搖勻,避光保存,得到硫酸特布他林供試品溶液,按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定[4-10],外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),在檢測(cè)波長(zhǎng)190～400 nm內(nèi)對(duì)硫酸特布他林對(duì)照品溶液、硫酸特布他林供試品溶液和大豆磷脂溶液進(jìn)行掃描,以確定硫酸特布他林磷脂復(fù)合物的最大吸收波長(zhǎng),結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectrum

由圖2可知,大豆磷脂溶液在210～220 nm內(nèi)有干擾,并且211 nm附近屬于末端吸收,容易產(chǎn)生雜峰;硫酸特布他林對(duì)照品溶液和硫酸特布他林供試品溶液在280 nm處均有紫外吸收,而大豆磷脂溶液在280 nm處無(wú)紫外吸收,因此試驗(yàn)選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

2.2 流動(dòng)相的選擇

當(dāng)流動(dòng)相p H大于4.4時(shí),目標(biāo)物開(kāi)始出現(xiàn)肩峰,可能是硫酸特布他林在堿性條件下被氧化所致;當(dāng)流動(dòng)相p H調(diào)整至3.4時(shí),目標(biāo)物的肩峰消失。因此,試驗(yàn)選擇流動(dòng)相p H為3.4。

由于流動(dòng)相的酸度與辛烷磺酸鈉濃度的變化對(duì)磷酸特布他林保留時(shí)間的影響較小,而乙腈用量變化1%則會(huì)引起硫酸特布他林保留時(shí)間變化約10%[3],進(jìn)而影響硫酸特布他林與大豆磷脂的分離,因此在流動(dòng)相p H 3.4條件下,試驗(yàn)考察了不同體積比(10∶90,15∶85,20∶80,25∶75,30∶70,35∶65)的乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸鈉溶液的混合液對(duì)硫酸特布他林分離效果的影響。結(jié)果顯示,當(dāng)乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸鈉溶液的混合液體積比為35∶65時(shí),硫酸特布他林的峰形較好,與大豆磷脂的分離度較高,因此試驗(yàn)選擇流動(dòng)相體積比為35∶65。

2.3 專屬性試驗(yàn)

按照儀器工作條件對(duì)硫酸特布他林供試品溶液、硫酸特布他林對(duì)照品溶液、大豆磷脂溶液和流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定,所得色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 專屬性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of specificity test

由圖3可知,大豆磷脂溶液和流動(dòng)相對(duì)硫酸特布他林色譜峰均無(wú)干擾,說(shuō)明該方法的專屬性較好。大豆磷脂和硫酸特布他林的保留時(shí)間分別為3.150,5.798 min,分離度為4.6,硫酸特布他林的峰形較好,理論塔板數(shù)大于3 000。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

按照儀器工作條件對(duì)硫酸特布他林對(duì)照品溶液系列進(jìn)行測(cè)定,以硫酸特布他林的質(zhì)量為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,硫酸特布他林的質(zhì)量在0.104 3～10.429 0μg內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y＝392.6 x,相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比計(jì)算方法的檢出限(3S/N)和測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果得硫酸特布他林的檢出限為1.565 9 ng,測(cè)定下限為5.219 7 ng。

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)質(zhì)量濃度為104.3 mg·L－1的硫酸特布他林對(duì)照品溶液連續(xù)測(cè)定5次,計(jì)算得峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.18%,表明該方法精密度良好。

配制3個(gè)濃度水平的硫酸特布他林供試品加標(biāo)溶液,并將其稀釋至線性范圍內(nèi),按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照儀器工作條件對(duì)硫酸特布他林供試品溶液重復(fù)測(cè)定5次,記錄色譜峰,計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果顯示,峰面積RSD為0.91%,表明本方法重復(fù)性良好。

按照儀器工作條件對(duì)放置0,1,2,4,24 h的硫酸特布他林對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明,24 h內(nèi)硫酸特布他林對(duì)照品溶液和硫酸特布他林磷供試品溶液的峰面積RSD分別為0.52%,1.27%,說(shuō)明上述兩種溶液在24 h內(nèi)均較穩(wěn)定。

2.7 耐用性試驗(yàn)

采用UltiMate 3000型高效液相色譜儀(配VWD-3100型紫外檢測(cè)器)和PLATISILTMODS色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)對(duì)硫酸特布他林供試品溶液進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖4。

結(jié)果顯示,在該系統(tǒng)下大豆磷脂和硫酸特布他林的保留時(shí)間分別為2.891,5.110 min,分離度為4.8,與本試驗(yàn)分離度無(wú)明顯差別,并且硫酸特布他林的峰形較好,理論塔板數(shù)大于3 000,表明方法耐用,可靠性高。

2.8 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)自制的3種硫酸特布他林磷脂復(fù)合物SPC-1、SPC-2、SPC-3進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)公式(復(fù)合率＝硫酸特布他林的測(cè)定值/硫酸特布他林原料的投料量×100%)計(jì)算樣品的復(fù)合率,結(jié)果見(jiàn)表2。

復(fù)合率是反映母體藥物(硫酸特布他林)與大豆磷脂結(jié)合率的指標(biāo),一般復(fù)合率越高說(shuō)明藥物與大豆磷脂結(jié)合越多,游離藥物越少。由表2可知,自制的3種硫酸特布他林磷脂復(fù)合物的復(fù)合率均較好。

本工作建立了HPLC測(cè)定自制硫酸特布他林磷脂復(fù)合物中硫酸特布他林含量的方法。該方法分離度好、回收率高、檢出限低,可高效、準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)對(duì)硫酸特布他林磷脂復(fù)合物中硫酸特布他林的測(cè)定,為硫酸特布他林磷脂復(fù)合物的質(zhì)量控制提供了一定的參考。