張 權(quán),劉利亞,吳玉田,李 磊,劉文政,郭 華,陳慶園

(貴州省疾病預(yù)防控制中心 實驗中心,貴陽 550004)

五氯酚及其鈉鹽作為一種重要的防腐劑、抗菌劑、除草劑,能阻止真菌的生長、抑制細菌的腐蝕,常被用于皮革品和木材的防霉[1-2]。同時,五氯酚也是環(huán)境持久性有機污染物之一,不易降解,一旦進入人體會影響機體的免疫功能,阻礙生殖發(fā)育[3]。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn),五氯酚通常是人為添加到木材中,添加方式及添加劑量目前無準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。將含有五氯酚的木材經(jīng)過加工制作成竹木砧板,而被五氯酚污染的竹木砧板與食品接觸后,五氯酚經(jīng)食品攝入到人體的風(fēng)險較高。目前我國缺少竹木砧板的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),國家標(biāo)準(zhǔn)《竹砧板》征求意見稿雖然基本全部涵蓋了竹木制品常用的殺菌防霉劑(噻苯咪唑、鄰苯基苯酚、抑霉唑、聯(lián)苯、五氯酚和三氯苯酚),但仍未發(fā)布,而其他的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),如制造團體標(biāo)準(zhǔn)T/ZZB 0412－2018《竹砧板》、地方標(biāo)準(zhǔn)DB 35/T 1211－2019《竹菜板通用技術(shù)條件》中都未涵蓋五氯酚指標(biāo),這就缺少了竹木砧板產(chǎn)品的質(zhì)量保障,存在一定的風(fēng)險隱患,因此建立竹木砧板中五氯酚殘留量的測定方法迫在眉睫。

目前五氯酚及其鈉鹽的常用測定方法主要有高效液相色譜法[4-5]、氣相色譜法[6-7]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8-9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-12]等。雖然測定方法較多,但是適用性主要針對環(huán)境樣品[13]和動物源性食品[14]等,而對竹木制品中五氯酚準(zhǔn)確定量的方法比較局限。

本工作在參考《國家食品污染和有害因素風(fēng)險監(jiān)測工作手冊》的基礎(chǔ)上,針對非法添加的五氯酚在竹木砧板分布不均勻、取樣缺乏代表性等問題,優(yōu)化樣本制備過程和前處理條件,采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS),利用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式對我省80份市售竹木砧板中五氯酚殘留水平進行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)其未知風(fēng)險隱患,力求對竹木制品中五氯酚殘留的篩查和確證、溯源分析、風(fēng)險評估以及標(biāo)準(zhǔn)制定等提供數(shù)據(jù)支撐。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Scion-TQ型三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀;Milli-Q型去離子水發(fā)生器;HGC-36A型氮吹儀;HWS-28型電熱恒溫水浴鍋;SLC固相萃取柱(500 mg/6 mL)。

五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液:1 g·L－1,使用時用丙酮稀釋至所需質(zhì)量濃度。

2,4,6-三溴酚內(nèi)標(biāo)儲備溶液:稱取2,4,6-三溴酚10 mg,用丙酮溶解并定容至10 mL,制得1.00 g·L－1的2,4,6-三溴酚內(nèi)標(biāo)儲備溶液。

2,4,6-三溴酚內(nèi)標(biāo)溶液:10.0 mg·L－1,移取2,4,6-三溴酚內(nèi)標(biāo)儲備溶液適量,用丙酮稀釋制得。

2,4,6-三溴酚,純度為99.57%;無水硫酸鈉、氯化鈉為優(yōu)級純;無水碳酸鉀、三氯乙酸、乙酸酐和吡啶為分析純;乙酸乙酯、正己烷和甲醇為色譜純。

竹木砧板為貴州省市州疾控中心采集的食品安全風(fēng)險監(jiān)測樣品,購于某超市或農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Agilent J&W DB-5MS石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);載氣為氦氣,純度不小于99.999%;碰撞氣為氬氣;不分流進樣;進樣口溫度260℃;流量1 mL·min－1;進樣量1.0μL;溶劑延遲時間10.0 min。柱升溫程序:初始溫度80℃,保持2 min;以10℃·min－1速率升溫至250℃;再以50℃·min－1速率升溫至300℃,保持5 min。

2)質(zhì)譜條件 電子轟擊離子(EI)源;電離能量70 eV;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;離子源溫度230℃,傳輸線溫度280℃。五氯酚衍生物及內(nèi)標(biāo)衍生物的二級質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“*”為定量離子對。

表1 五氯酚衍生物及內(nèi)標(biāo)衍生物的二級質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS/MS parameters of pentachlorophenol derivative and internal standard derivative

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

表面取樣法:取砧板,下面放錫箔紙,用電刨在砧板表層從左至右依次刨削,刨削深度為砧板表層下2～3 mm,對砧板表層(雙面)要全部覆蓋,如圖1(a)所示。

九點式布點法:采用正、反梅花形九點式布點,如圖1(b)所示。用電鉆鉆孔取木屑,收集所有木屑于錫箔紙上,用粉碎機在低轉(zhuǎn)速下進一步粉碎均勻,粉碎后裝入聚乙烯塑料袋中,試樣量不少于20 g,貼好試樣編號,室溫干燥處保存,備用。

1.3.2 樣品前處理

稱取2.00 g制備好的試樣放入50 mL塑料離心管中,加入10.0 mg·L－1的2,4,6-三溴酚內(nèi)標(biāo)溶液50μL和水20 mL,于60℃超聲提取10 min,再加入5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯乙酸溶液5 mL,進一步超聲提取5 min。取出冷卻后,加入體積比1∶9的乙酸乙酯-正己烷混合液10 mL,振蕩提取2 min,以轉(zhuǎn)速10 000 r·min－1離心4 min,取上層有機相于50℃水浴中氮吹至干,加入乙腈1 mL,超聲溶解2 min,以轉(zhuǎn)速10 000 r·min－1離心2 min,上層乙腈相待凈化。

取SLC固相萃取柱,加入1.0 g無水硫酸鈉,用4 mL乙腈活化柱子,然后移取上述乙腈相至柱子上并收集,再用4 mL乙腈洗脫,收集洗脫液于60℃氮吹至1.0 mL,然后加入0.3 mL衍生試劑(體積比1∶1的乙酸酐-吡啶混合液),密封,于60℃水浴反應(yīng)15 min。取出冷卻,加入1 mL正己烷和0.2 mol·L－1碳酸鉀溶液2.0 mL,充分混勻,以轉(zhuǎn)速10 000 r·min－1離心2 min,取上層有機相,按儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品制備條件的優(yōu)化

在竹木砧板樣品制備過程中,因材質(zhì)較硬通常不易將整塊砧板粉粹,大多采用布點法收集樣品。而試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),竹木砧板中五氯酚屬于人為添加的物質(zhì),存在分布不均勻問題,如果按照常規(guī)布點法制備樣品,取樣隨機性較大,特別是在復(fù)檢樣品的二次制備時,會在原來砧板采樣孔附近鉆空取樣,這樣就會由于樣品制備問題導(dǎo)致與初檢結(jié)果相差過大,甚至?xí)霈F(xiàn)漏檢情況;而且只有砧板的雙面表層是與食物接觸的,其他的夾層未能接觸食品。因此,試驗中采用表層取樣法與正、反梅花形九點式布點法[圖1(b),粗細線分別代表正、反面]聯(lián)合制備樣品,然后對刨削及鉆孔后的樣品進一步粉粹,直到樣品均勻為止。需要注意的是,刨削時要避免每次刨削深度過深(建議1 mm以內(nèi)),需要進行多次刨削,每個樣品刨削完畢后,要仔細檢查電刨刀片處是否夾有木削,避免樣品交叉污染,應(yīng)用此法可減少取樣的隨機性,使樣品中目標(biāo)物更均勻;同時,該樣品制備方法可為今后竹木砧板中五氯酚在各種食品中的遷移量研究提供參考。

圖1 長方形砧板表面取樣法及九點式布點法采樣示意圖Fig.1 Schematic diagrams of surface sampling method and nine-point layout sampling method for rectangular wooden chopping board

2.2 提取條件的優(yōu)化

根據(jù)“相似相溶”原理,五氯酚的常用提取劑主要有乙酸乙酯-環(huán)己烷混合液、乙腈、丙酮、乙酸乙酯-正己烷混合液等。在GC-MS/MS檢測后的空白竹木基質(zhì)中添加含50 ng五氯酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液,提取劑分別為體積比1∶9的乙酸乙酯-環(huán)己烷混合液、乙腈、丙酮、體積比1∶9的乙酸乙酯-正己烷混合液,提取劑體積均為10 mL,考察了上述提取劑對五氯酚提取率的影響。結(jié)果表明:4種提取劑的提取率依次為91.2%,75.6%,61.2%,92.5%,當(dāng)以體積比1∶9的乙酸乙酯-正己烷混合液為提取劑時,五氯酚的提取率較高。

在其他操作條件相同條件下,進一步比較了不同體積比的乙酸乙酯-正己烷混合液(1∶9,2∶8,3∶7)及提取劑用量(5,10,15 mL)對五氯酚提取率的影響。結(jié)果顯示,當(dāng)乙酸乙酯-正己烷混合液的體積比為1∶9時,五氯酚的提取率較高,并且提取劑體積為5 mL時的提取率要低于10,15 mL的。因此,試驗選擇以體積比1∶9的乙酸乙酯-正己烷混合液為提取劑,用量為10 mL。

2.3 凈化方式及衍生條件的優(yōu)化

目前五氯酚的凈化方式主要有固相萃取法[15]、硫酸磺化法[16]及QuEChERS法[17]等。雖然硫酸磺化法操作較為簡單,但是凈化效果一般,后續(xù)的衍生化反應(yīng)干擾較為嚴(yán)重;也有研究報道在動物源食品基質(zhì)中利用Qu ECh ERS法凈化,但該凈化方法不僅要通過大量的試驗來篩選分散劑的種類及最佳配比,還要考察共流出干擾物帶來的基質(zhì)效應(yīng)。而固相萃取法的凈化效果較好,是基質(zhì)凈化的首選方法,因此試驗采用固相萃取法進行基質(zhì)凈化,通過凈化效果和添加回收率的比較,最終選擇SLC固相萃取柱作為凈化柱。

五氯酚極性較強,其色譜行為保留較弱,直接進樣分析后色譜峰拖尾嚴(yán)重,響應(yīng)較低。為了改善色譜保留行為以及提高靈敏度,需要進行衍生化反應(yīng),因此選擇合適的衍生試劑就顯得尤為重要。一般對于酚類物質(zhì)的衍生試劑主要有重氮甲烷、五氟芐基溴、乙酸酐、N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)等[18],其中重氮甲烷有毒性,需謹(jǐn)慎操作;BSTFA衍生試劑應(yīng)用在簡單基質(zhì)中五氯酚檢測時衍生效果較好,靈敏度較高,但在復(fù)雜基質(zhì)衍生后雜質(zhì)峰較多,干擾嚴(yán)重,而且該試劑一旦遇水會造成衍生化反應(yīng)失敗,不易操作;五氟芐基溴屬于催淚物質(zhì),有強烈的腐蝕性,也不易采用;乙酸酐可以將五氯酚衍生成五氯苯乙酸酯,衍生條件簡單,衍生化效率較高。因此,試驗以乙酸酐為衍生試劑,于60℃水浴反應(yīng)15 min,同時加入吡啶提供堿性環(huán)境,保證衍生化效率,衍生化反應(yīng)后需加入0.2 mol·L－1碳酸鉀溶液2.0 mL以去除未參與反應(yīng)的衍生試劑。

2.4 色譜行為

在上述優(yōu)化的前處理條件下,于空白樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后依次進行處理,按儀器工作條件分析。五氯苯乙酸酯(50μg·L－1)與2,4,6-三溴苯乙酸酯(500μg·L－1)的總離子流色譜圖及二級質(zhì)譜圖見圖2。

圖2 五氯苯乙酸酯(50μg·L－1)與2,4,6-三溴苯乙酸酯(500μg·L－1)的總離子流色譜圖及二級質(zhì)譜圖Fig.2 Total ion chromatogram and MS/MS spectra of pentachlorophenyl acetate(50μg·L－1)and 2,4,6-tribromophenyl acetate(500μg·L－1)

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

取6個15 mL具塞刻度離心管,分別加入25,50,100,200,500,800μL質(zhì)量濃度為1.0 mg·L－1的五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液,再各加入10.0 mg·L－12,4,6-三溴酚內(nèi)標(biāo)溶液50μL,用乙腈稀釋至1 mL,配制成五氯酚質(zhì)量濃度分別為25,50,100,200,500,800μg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按儀器工作條件進行測定。以五氯酚的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的五氯酚衍生物與內(nèi)標(biāo)2,4,6-三溴酚衍生物的峰面積比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,內(nèi)標(biāo)法定量。所得的線性范圍為25～800μg·L－1,線性回歸方程為y＝0.520 7 x－0.472 0,相關(guān)系數(shù)為0.999 4。

以3倍信噪比(S/N)計算方法的檢出限(3S/N),結(jié)果為0.003 mg·kg－1。以10倍信噪比計算方法的測定下限(10S/N),結(jié)果為0.01 mg·kg－1。

2.6 精密度和回收試驗

取數(shù)份經(jīng)GC-MS/MS驗證無目標(biāo)物的竹木砧板空白樣品,分別添加0.010,0.025,0.050 mg·kg－1等3個濃度水平的五氯酚,按試驗方法進行測定,每個濃度水平平行測定5次,計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝5)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

由表2可知,回收率為86.0%～96.0%,RSD為2.5%～4.2%,表明本方法精密度良好。

2.7 樣品分析及數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用本工作建立的方法,對2019年貴州省食品安全風(fēng)險專項監(jiān)測中采集的80份市售竹木砧板樣品進行分析,具體所采集樣本的生產(chǎn)地及數(shù)量為:貴州省10份、湖南省21份、浙江省28份、福建省11份、廣西壯族自治區(qū)4份、廣東省5份、江西省1份。

貴州省各市州采集的市售竹木砧板中五氯酚平均殘留量結(jié)果顯示:畢節(jié)和黔西南地區(qū)的砧板中五氯酚平均殘留量較高,主要原因是這兩個地區(qū)采集的樣本中非定型包裝(散裝)竹木砧板分別占總數(shù)的37.5%,100%。通過監(jiān)測數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),非定型包裝竹木砧板檢出的五氯酚殘留量為0.200～384.350 mg·kg－1,平均殘留量為 51.150 mg·kg－1,是定型包裝竹木砧板中檢出的五氯酚平均殘留量的100倍左右,而歐盟法令1935/2004/EC、2003/02/EC和89/106/EC等指令中規(guī)定木制品中防腐劑五氯酚應(yīng)小于0.15 mg·kg－1,說明竹木砧板中的五氯酚殘留量具有潛在風(fēng)險,應(yīng)引起相關(guān)部門的注意。

本工作采用表層取樣法與九點式布點法聯(lián)合制備樣品,結(jié)合GC-MS/MS快速測定竹木砧板中五氯酚殘留量,該樣品制備方法可減少取樣隨機性,使樣品中目標(biāo)物更均勻。采用該法對2019年貴州省食品安全風(fēng)險專項監(jiān)測中80份市售竹木砧板進行檢測分析及數(shù)據(jù)統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)非定型包裝竹木砧板中五氯酚高殘留量的潛在風(fēng)險,為今后竹木砧板中五氯酚在各種食品中遷移量及竹木制品的產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了必要的數(shù)據(jù)支撐。