黃 芳,鄧 欣,謝淑桐,謝夢婷,徐翠芳,羅輝泰,黃曉蘭,吳惠勤

(廣東省科學院測試分析研究所(中國廣州分析測試中心),廣東省中藥質量安全工程技術研究中心,廣州 510070)

自新型冠狀病毒肺炎爆發(fā)以來,消毒劑已成為抗疫必需品,由于日常消毒的需要引發(fā)人們對消毒劑的大量需求,市面上出現的消毒劑種類越來越多。不同消毒劑的性質不同,使用的對象、效果和方法也不盡相同。聚六亞甲基雙胍,又稱聚胺丙基雙胍,是一種新型環(huán)保的胍類消毒劑,通常以鹽酸鹽的形式存在,其結構見圖1。

圖1 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的結構式Fig.1 Structural formula of polyhexamethylene biguanide hydrochloride

聚六亞甲基雙胍具有極強的殺菌和抑菌性能,廣譜高效、有效期長,分解溫度超過400℃,自然環(huán)境下可降解,無毒副作用,使用安全[1],且具有速效、對皮膚黏膜無刺激性、對金屬和織物無腐蝕性、穩(wěn)定性好等特點[2],適用于手消毒、外科洗手消毒、手術部位皮膚及黏膜消毒,也可用于物體表面的消毒殺菌,是目前殺菌活性較好的消毒劑原料之一[3],還可作為畜牧養(yǎng)殖場消毒劑、織物表面處理劑、污水處理絮凝劑以及聚合物抗菌改性劑等。

聚六亞甲基雙胍在不同消毒劑中的質量分數為0.001%～0.2%[4],而此類產品質量控制的分析方法卻相對滯后。國家標準GB 26367－2010《胍類消毒劑衛(wèi)生標準》只是針對原料的質量進行分析。文獻[5-7]以GB 26367－2010中的分光光度法(質量分數為19.0%～21.0%)為標準;有些企業(yè)以固含量(≥20%)指標來控制原料的質量。而實際應用中對于復配的消毒產品,采用分光光度法測定專屬性較差,容易產生干擾,導致結果不準確;同時聚六亞甲基雙胍不是單體化合物,高效液相色譜法或液相色譜法[4-10]只是測定了一定色譜條件下能出峰且有紫外吸收的部分。實際檢測中發(fā)現,不同廠家的消毒產品中聚六亞甲基雙胍的聚合度不同,導致產品的相對分子質量分布有差異,造成測定結果不一致。本工作將不同聚合度的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽水解成六亞甲基胍單體后,采用高分辨質譜法提取特征離子用于定量。該方法靈敏度高,避免了因原料聚合度不同導致的測定結果差異,為消毒產品的質量控制提供了技術支撐。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290型超高效液相色譜-6540型四極桿飛行時間質譜聯(lián)用儀;KQ2200型臺式機械超聲波清洗器;H H-ZK2型恒溫水浴鍋;TP-114型電子天平;MS3 Basic型渦旋混合器;Milli-Q型純化系統(tǒng)。

聚六亞甲基雙胍標準儲備溶液:1 g·L－1,稱取聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽標準品10 mg,用水溶解并定容至10 mL容量瓶中,配制成質量濃度為1 g·L－1的標準儲備溶液,于4℃避光保存。

聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽標準品的純度為98.4%;甲醇、甲酸、乙腈為色譜純,其余試劑均為分析純;試驗用水為三級水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Poroshell EC120型色譜柱(100 mm×2.1 mm,2.7μm);柱 溫 30 ℃;流 量 0.3 mL·min－1;流動相A為乙腈,B為0.1%(體積分數)甲酸溶液;進樣量2μL。梯度洗脫程序:0～6 min時,A為10%;6～8 min時,A為100%;8～12 min時,A為10%。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子(ESI)源,正離子模式采集;干燥氣為氮氣,干燥氣溫度300℃,干燥氣流量8 L·min－1;霧化氣為氮氣,壓力275.8 kPa;鞘氣溫度340℃,鞘氣流量11 L·min－1;毛細管電壓4 000 V,毛細管出口電壓135 V,錐孔電壓65 V,八極桿電壓750 V;全掃描模式采集,掃描范圍質荷比(m/z)70～1 200;參比離子為正離子m/z 121.050 9,922.009 8。

1.3 試驗方法

取消毒劑樣品2 mL于10 mL具塞試管中,加入4.0 mol·L－1鹽酸溶液2 mL,于95℃水浴中水解2.0 h,取出,放冷至室溫,用2 mol·L－1氫氧化鈉溶液調節(jié)溶液酸度至弱酸性(p H 5～6),用水稀釋至刻度,經0.45μm濾膜過濾得到樣品溶液,按照儀器工作條件進行測定,采用提取離子外標法定量。

2 結果與討論

2.1 測定方法的選擇

聚六亞甲基雙胍的相對分子質量和水溶性是保證其殺菌效果的重要條件[1],文獻[11]報道其相對分子質量在800～1 300 Da內具有較好的殺菌活性。但是目前還沒有一種合適的方法能測定這類化合物的相對分子質量和含量,更沒有統(tǒng)一的標準和方法來評價不同廠家聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的質量。

文獻[5-7]報道采用分光光度法測定聚六亞甲基雙胍,其原理是直接測定234 nm處的吸光度,或用曙紅(Eosin染料)顯色反應后于545 nm處測定。而實際大多數消毒產品均由乳化劑、穩(wěn)定劑以及其他功能劑或輔料復配而成,采用分光光度法得到樣品溶液的顏色與對照品的顏色相差甚遠,導致結果誤差大,難以準確定量。

試驗采用高效液相色譜法和凝膠色譜法測定不同來源聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽中聚六亞甲基雙胍的含量,所得色譜圖見圖2。

圖2 不同測定方法得到的色譜圖Fig.2 Chromatograms obtained by different determination methods

由圖2(a)可知,5個不同來源的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽在同一色譜條件下出峰不一致,得到的不是單一色譜峰,可能是由于合成工藝[12-14]不同,得到的聚六亞甲基雙胍聚合程度不同。若采用該方法進行定量,則需要用與樣品一樣的原材料作對照品,并選擇其中保留時間一致的色譜峰。

凝膠色譜法根據物質的保留時間計算相對分子質量大小,保留時間短的物質相對分子質量相對較大。由圖2(b)可知:A廠家的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽相對分子質量較小,E廠家的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽相對分子質量較大,且相對分子質量分布與標準品C基本一致;B廠家的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽相對分子質量居中,相對分子質量分布與標準品D基本一致。根據文獻報道,聚六亞甲基雙胍的相對分子質量為1 000～1 800 Da,采用核磁共振法測試,推測該聚合物可能以大環(huán)化合物的形式存在[15]。由此可見,采用高效液相色譜法和凝膠色譜法對不同相對分子質量的聚六亞甲基雙胍定量是不合適的。

試驗進一步采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法(UHPLC-Q-TOF-MS)直接進樣測試,掃描范圍m/z 70～3 200。結果顯示,未得到m/z 800以上的分子或離子,因此采用UHPLC-Q-TOFMS直接進樣測定聚六亞甲基雙胍的含量也不合適。

綜上分析,分光光度法、高效液相色譜法、凝膠色譜法、UHPLC-Q-TOF-MS均無法直接測定聚六亞甲基雙胍的含量。因此,試驗先用鹽酸將產品中的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽水解,再用UHPLC-QTOF-MS對水解單體進行測定。

2.2 水解條件的選擇

按照試驗方法提取離子m/z 184.1559峰面積為指標,考察了鹽酸溶液濃度(2.0,4.0,8.0 mol·L－1)和水解時間(0.5,1.0,2.0,3.0 h)對聚六亞甲基雙胍峰面積的影響,結果見圖3。

圖3 鹽酸溶液濃度和水解時間對聚六亞甲基雙胍峰面積的影響Fig.3 Effect of hydrochloric acid solution concentration and hydrolysis time on peak area of polyhexamethylene biguanide

由圖3可知:當鹽酸溶液濃度為2.0,4.0 mol·L－1時,隨著水解時間的延長,水解產物的峰面積逐漸增大;當水解時間為2.0 h時,峰面積趨于平穩(wěn);并且當鹽酸溶液濃度為4.0 mol·L－1時,水解產物的峰面積更大。綜合考慮,試驗最終選擇水解時間為2.0 h,鹽酸溶液濃度為4.0 mol·L－1。

2.3 定量離子的選擇

按照試驗方法將聚六亞甲基雙胍標準溶液水解后上機分析,得到高分辨質譜圖見圖4。

由圖4可知,豐度最高的特征離子為m/z 184.155 9,經儀器自帶軟件 Aglient Qualitative Navigator B.08.00推測,其分子式為C8H17N5;再根據二級碎片,推測其結構式為[(CH2)6－NHCNH－NH－CNH－NH]＋,即聚六亞甲基雙胍的基本組成單元;進一步根據母離子及二級碎片推測并解析其余離子,各水解產物的質譜信息見表1。其中,A代表NH－(CH2)6－NH－CNH,B代表NH－(CH2)6－NH－CNH－NH－CNH。

表1 水解產物的質譜信息Tab.1 MS information of hydrolyzed products

圖4 標準溶液的高分辨質譜圖Fig.4 High resolution mass spectrum of standard solution

由表1可知:聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽水解后得到8個特征離子,測定值與理論值的相對誤差的絕對值均小于2.00×10－6,表明測定值與理論值基本一致。以豐度最高的特征離子(m/z 184.155 9)為指標,提取離子峰面積,用于外標法定量。聚六亞甲基雙胍標準溶液和實際樣品溶液的提取離子流色譜圖見圖5。

圖5 提取離子流色譜圖Fig.5 Extracted ion chromatograms

2.4 標準曲線和檢出限

移取適量的聚六亞甲基雙胍標準儲備溶液,用水逐級稀釋,配制成質量濃度為1.0,2.5,5.0,10.0,50.0,100.0 mg·L－1的聚六亞甲基雙胍標準溶液系列。按照試驗方法進行測定,以聚六亞甲基雙胍的質量濃度為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明:聚六亞甲基雙胍的質量濃度在1.0～100.0 mg·L－1內與其峰面積呈線性關系,線性回歸方程為y＝348.5 x＋202.3,相關系數為0.994 6。

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),所得檢出限為1.0 mg·L－1。按照1.3節(jié)處理樣品后測試,得到檢出限為5.0 mg·L－1。

2.5 精密度和回收試驗

對空白消毒劑樣品進行低(1.16 mg·L－1)、中(11.6 mg·L－1)、高(58.0 mg·L－1)等3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平取6份,按照試驗方法處理并測定聚六亞甲基雙胍的含量,計算回收率及測定值的相對標準偏差(RSD)。結果表明:聚六亞甲基雙胍的回收率依次為112%,117%,99.5%,測定值的 RSD(n＝6)依次為8.1%,7.2%,7.7%。

2.6 樣品分析

按照試驗方法,測定了不同廠家送檢產品中聚六亞甲基雙胍的含量,結果見表2。

表2 樣品分析結果Tab.2 Analytical results of samples %

結果表明,所送檢產品中聚六亞甲基雙胍的質量分數為0.032%～0.110%。

聚六亞甲基雙胍應用廣泛,但是相應的質量控制標準及方法相對滯后。由于不同來源的聚六亞甲基雙胍在紫外吸收、相對分子質量分布、液相色譜行為等方面存在差異,因此本工作先將復配消毒產品中的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽水解,建立了UHPLCQ-TOF-MS測定復配消毒產品中聚六亞甲基雙胍含量的方法,可為此類產品的質量控制提供有效的技術支撐。