郇志博,段 云,徐 志,王明月,羅金輝,田 海,張利強(qiáng),韓丙軍

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 分析測(cè)試中心,?？?571101; 2.海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,?？?571101;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱作產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室,?？?571101; 4.海南省院士工作站,?？?571101)

丙烯酰胺被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為2A類致癌物,即“人類可能致癌物”[1]。2002年瑞典科學(xué)家發(fā)現(xiàn)富含淀粉的高溫?zé)峒庸な称?如餅干、薯?xiàng)l等)中含有大量的丙烯酰胺[2];2018年,全球咖啡行業(yè)因美國(guó)加州法院裁定星巴克咖啡中含有“可能致癌”的丙烯酰胺而遭受巨大影響。因此,監(jiān)測(cè)食品中丙烯酰胺的含量對(duì)保障消費(fèi)者的食品安全具有重要意義。

2014年我國(guó)發(fā)布了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.204－2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中丙烯酰胺的測(cè)定》,該標(biāo)準(zhǔn)建立了穩(wěn)定性同位素稀釋的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和穩(wěn)定同位素稀釋的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法兩種方法來(lái)測(cè)定熱加工(如煎、炙烤、焙烤等)食品中丙烯酰胺的含量。同時(shí),國(guó)內(nèi)外也報(bào)道了許多關(guān)于食品中丙烯酰胺的測(cè)定方法:文獻(xiàn)[3]采用高效液相色譜法測(cè)定曲奇餅干中丙烯酰胺的含量;文獻(xiàn)[4]采用高效液相色譜-四極桿質(zhì)譜法測(cè)定餅干中丙烯酰胺的含量;文獻(xiàn)[5]采用QuECh ERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定咖啡中丙烯酰胺;文獻(xiàn)[6]采用超高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定烘焙咖啡中丙烯酰胺。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.204－2014推薦的測(cè)定方法前處理操作步驟復(fù)雜,耗時(shí)較長(zhǎng),無(wú)法對(duì)大批量樣品進(jìn)行分析[6]。另外,前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),速溶咖啡和曲奇餅干兩種樣品的基質(zhì)差異較大,曲奇餅干中含有較多的油脂成分,而速溶咖啡中含有較多的極性成分,目前的參考文獻(xiàn)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)難以同時(shí)快速、準(zhǔn)確地測(cè)定兩種基質(zhì)中丙烯酰胺的含量。因此,本工作在前期研究的基礎(chǔ)上,通過優(yōu)化色譜條件和凈化方法,建立了超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定速溶咖啡和曲奇餅干中丙烯酰胺含量的方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX TRIPLE QUADTM6500＋型超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀;T25型勻漿機(jī);Milli-Q型超純水器;CR22GIII型高速冷凍離心機(jī);SENCO型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:100 mg·L－1。

內(nèi)標(biāo)(13C3-丙烯酰胺)儲(chǔ)備溶液:100 mg·L－1。

丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液:5.00 mg·L－1,移取0.5 mL的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10 mL容量瓶中,用水定容,配制成5.00 mg·L－1的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用時(shí),用水稀釋至所需質(zhì)量濃度。同法制得5.00 mg·L－1的內(nèi)標(biāo)溶液。

甲醇、乙腈、正己烷均為色譜純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Aglient Eclipse Plus C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.8μm);柱溫30℃;進(jìn)樣體積1μL;流動(dòng)相為5%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液,流量0.15 mL·min－1,等度洗脫。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子(ESI)源,正離子掃描;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;噴霧電壓5 500.0 V;離子源溫度550.0℃;霧化氣壓力379 Pa,加熱氣壓力379 Pa,氣簾氣壓力276 Pa,碰撞室壓力55.2 Pa;碰撞室入口電壓和出口電壓均為10.0 V;駐留時(shí)間100.0 ms。

丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺的質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中,“*”代表定量離子。

表1 丙烯酰胺與13 C3-丙烯酰胺的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters of acrylamide and 13 C3-acrylamide

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品提取

分別稱取2.0 g速溶咖啡粉末和曲奇餅干樣品粉末于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈,以轉(zhuǎn)速3 000 r·min－1勻質(zhì)1 min,再于4℃以轉(zhuǎn)速9 000 r·min－1離心3 min,將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。在殘?jiān)性偌尤?0 mL乙腈,渦旋30 s,于4℃以轉(zhuǎn)速9 000 r·min－1離心3 min,合并兩次上清液。在上清液中加入10 mL正己烷,渦旋2 min,于4℃以轉(zhuǎn)速9 000 r·min－1離心3 min,除去上層正己烷相,再次加入10 mL正己烷,重復(fù)操作,除去上層正己烷相。

1.3.2 樣品凈化

取10 mL下層乙腈相于50 mL圓底燒瓶中,于40℃減壓濃縮至近干,加入1 mL水溶解,經(jīng)0.45μm水系濾膜過濾,按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件,對(duì)丙烯酰胺質(zhì)量濃度均為0.05 mg·L－1的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液、曲奇餅干空白樣品加標(biāo)溶液和速溶咖啡空白樣品加標(biāo)溶液進(jìn)行測(cè)定,所得提取離子流色譜圖見圖1。

圖1 提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 樣品的提取

不同的提取和凈化方法對(duì)樣品的測(cè)定結(jié)果有很大影響。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.204－2014和文獻(xiàn)[4,7-8]直接用水作為餅干中丙烯酰胺的提取劑,然后用正己烷除脂;文獻(xiàn)[6]以甲醇為提取劑,提取咖啡中的丙烯酰胺;文獻(xiàn)[9-10]以乙腈-水混合液為提取劑;文獻(xiàn)[11]單獨(dú)使用乙腈為提取劑。試驗(yàn)分別以水、乙腈-水混合液、甲醇、乙腈為提取劑,用正己烷除脂,考察了上述提取劑對(duì)速溶咖啡和曲奇餅干樣品中丙烯酰胺提取效果的影響。結(jié)果表明:以水為提取劑時(shí),水與咖啡粉末形成懸濁液,難以通過離心獲得上清液,嚴(yán)重影響凈化步驟;以乙腈-水混合液為提取劑時(shí),乙腈和水容易分層,而且丙烯酰胺在兩相中均有溶解,造成測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確;以甲醇為提取劑時(shí),甲醇極性較強(qiáng),導(dǎo)致提取液中含有大量的極性干擾物質(zhì),與丙烯酰胺難以分開;以乙腈為提取劑時(shí),速溶咖啡和曲奇餅干中的丙烯酰胺均可被較好提取。因此,試驗(yàn)選擇以乙腈為提取劑,用正己烷除脂。

2.2.2 樣品的凈化

按照試驗(yàn)方法提取樣品,參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.204－2014和相關(guān)文獻(xiàn)[4,11-12]設(shè)計(jì)了4種凈化方法:① 取10 mL下層乙腈相于50 mL圓底燒瓶中,于40℃減壓濃縮至近干,加入1 mL水溶解,經(jīng)0.45μm水系濾膜過濾,按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定;② 取10 mL下層乙腈相,采用Oasis HLB(500 mg/6 mL)和Bond Elut-AccuCAT(200 mg/6 mL)固相萃取小柱凈化,凈化過程參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.204－2014,最后加入1 mL水溶解,經(jīng)0.45μm水系濾膜過濾,按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定;③取10 mL下層乙腈相,采用經(jīng)3 mL甲醇和3 mL水活化的HLB固相萃取小柱凈化,收集流出液,再用3 mL水洗脫,收集全部洗脫液,在氮?dú)庀聦⒘鞒鲆簼饪s至近干,最后用1 mL水溶解,經(jīng)0.45μm水系濾膜過濾,按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定;④ 取10 mL下層乙腈相,加入0.2 g N-丙基乙二胺,充分振蕩,于4℃以轉(zhuǎn)速9 000 r·min－1離心3 min,將上清液全部轉(zhuǎn)移至50 mL圓底燒瓶中,于40℃蒸發(fā)濃縮至近干,加入1 mL水溶解,經(jīng)0.45μm水系濾膜過濾,按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)考察了上述4種凈化方法對(duì)速溶咖啡和曲奇餅干中丙烯酰胺回收率的影響(加標(biāo)量均為0.1 mg·kg－1),并計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。

結(jié)果表明:經(jīng)方法②處理后,速溶咖啡和曲奇餅干中基本檢測(cè)不到丙烯酰胺,回收率僅為0.5%和0.2%;經(jīng)方法③和方法④處理后,丙烯酰胺的峰形較差且回收率較低;經(jīng)方法①處理后,速溶咖啡和曲奇餅干中丙烯酰胺的回收率分別為99.6%和111%。因此,試驗(yàn)選擇方法①來(lái)凈化樣品。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

丙烯酰胺屬于強(qiáng)極性物質(zhì),在C18色譜柱上的保留時(shí)間較短,容易受基質(zhì)干擾[7]。為了獲得最佳的分離效果,試驗(yàn)參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)[6-7,11-15],考察了不同流動(dòng)相體系[甲醇-水、甲醇-0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液、乙腈-水]對(duì)曲奇餅干和速溶咖啡樣品中丙烯酰胺分離效果的影響。結(jié)果顯示:對(duì)于曲奇餅干樣品,不同流動(dòng)相體系均能較好地分離丙烯酰胺;而對(duì)于速溶咖啡樣品,不同流動(dòng)相體系對(duì)丙烯酰胺分離效果的影響較大;當(dāng)以甲醇-水體系為流動(dòng)相時(shí),速溶咖啡中的丙烯酰胺可被較好地分離。因此,試驗(yàn)選擇甲醇-水體系為流動(dòng)相。

試驗(yàn)進(jìn)一步考察了體積分?jǐn)?shù)為5%,10%,20%的甲醇溶液在流量為0.20 mL·min－1以及體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇溶液在流量為0.10,0.15,0.20 mL·min－1時(shí)對(duì)曲奇餅干和速溶咖啡樣品中丙烯酰胺分離效果的影響。

結(jié)果表明:對(duì)于曲奇餅干樣品,當(dāng)流量為0.20 mL·min－1時(shí),甲醇體積分?jǐn)?shù)的改變對(duì)分離丙烯酰胺的影響較小;當(dāng)流動(dòng)相為5%甲醇溶液時(shí),隨著流量的減小,丙烯酰胺與雜質(zhì)峰的分離情況基本保持不變,說明甲醇體積分?jǐn)?shù)和流量對(duì)曲奇餅干樣品中丙烯酰胺的分離效果影響均不大。

對(duì)于速溶咖啡樣品,當(dāng)流量為0.20 mL·min－1時(shí),隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的減小,丙烯酰胺與雜質(zhì)峰的分離度逐漸增大[圖2(a)、(b)和(c)];當(dāng)流動(dòng)相為5%甲醇溶液,流量為0.15 mL·min－1時(shí),速溶咖啡樣品中丙烯酰胺的分離效果較好[圖2(d)],無(wú)肩峰和拖尾,且響應(yīng)值較高。因此,試驗(yàn)最終選擇流動(dòng)相為5%甲醇溶液,流量為0.15 mL·min－1,以分離曲奇餅干和速溶咖啡樣品中的丙烯酰胺。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別取 1 mL 0.10 mg·L－1的丙烯酰胺(CH2＝CH－CO－NH2)和13C3-丙烯酰胺(13CH2＝13CH－13CO－NH2)標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)針泵進(jìn)質(zhì)譜儀。由于丙烯酰胺帶有一個(gè)氨基基團(tuán),容易與質(zhì)子結(jié)合,因此選擇正離子掃描模式。確定丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺的母離子Q1分別為m/z 72.0(CH2＝CH－CO－NH3＋)和 75.0(13CH2＝13CH－13CO－NH3＋),丙烯酰胺經(jīng)碰撞室碰撞后產(chǎn)生的子離子Q3分別為m/z 55.0(CH2＝CHCO＋)和44.0(NH2－CO＋),選擇豐度最強(qiáng)的子離子m/z 55.0為定量離子,m/z 44.0為定性離子。13C3-丙烯酰胺經(jīng)碰撞室碰撞后產(chǎn)生的子離子分別為m/z 58.0(13CH2＝13CH －13CO＋)和 45.0(NH2－13CO＋),選擇m/z 58.0為定量離子,m/z 45.0為定性離子。進(jìn)一步優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量,優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

移取適量的5.00 mg·L－1丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液,用水逐級(jí)稀釋,配制成丙烯酰胺質(zhì)量濃度 分 別 為 0.005,0.01,0.05,0.10,0.50,1.00 mg·L－1,內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為0.1 mg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按照儀器工作條件進(jìn)樣分析。以丙烯酰胺的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以丙烯酰胺與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0.005～1.00 mg·L－1,線性回歸方程為y＝7.429 x＋1.100×10－3,相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比計(jì)算檢出限(3S/N)和測(cè)定下限(10S/N),計(jì)算得檢出限為0.000 3 mg·L－1,測(cè)定下限為0.001 mg·L－1。目前國(guó)內(nèi)外未建立餅干中丙烯酰胺的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn),歐盟規(guī)定烘焙咖啡和速溶咖啡中丙烯酰胺的限量值分別為0.40,0.85 mg·kg－1,該方法滿足測(cè)定要求。

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)市場(chǎng)購(gòu)買的5種速溶咖啡和5種曲奇餅干樣品進(jìn)行低(0.05 mg·kg－1)、中(0.10 mg·kg－1)、高(0.50 mg·kg－1)等3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平平行測(cè)定5次,計(jì)算回收率和測(cè)定值的RSD,結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝5)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

由表3可知,丙烯酰胺在不同種類的速溶咖啡和曲奇餅干中的回收率為88.9%～111%,RSD為2.5%～14%,符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 32465－2015《化學(xué)分析方法驗(yàn)證確認(rèn)和內(nèi)部質(zhì)量控制要求》的要求[16]。

目前針對(duì)咖啡或餅干樣品中丙烯酰胺的測(cè)定已有報(bào)道,但是缺乏同時(shí)測(cè)定不同類型基質(zhì)中丙烯酰胺的方法。本工作參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn),設(shè)計(jì)了一種2次乙腈提取,2次正己烷除脂的提取凈化方法處理富含極性組分的速溶咖啡和富含油脂組分的曲奇餅干,采用UHPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定速溶咖啡和曲奇餅干中丙烯酰胺的含量,該方法不需要經(jīng)過復(fù)雜的固相萃取過程,步驟簡(jiǎn)單,耗時(shí)較短,滿足測(cè)定要求。