張宇鑫，李惠，張夢(mèng)，宋翔，余游，余馬，陳華

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010；2.綿陽市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 綿陽 621000）

月季（Rosa chinensis）是世界上最受歡迎的觀賞花之一，具有重要觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。花瓣的形狀及顏色決定了月季的五彩斑斕，因而花瓣的發(fā)育對(duì)月季的美觀起著重要作用。Squamosa promoter binding protein like（SPL）基因家族作為植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，其家族成員能夠與SQUAMOSA啟動(dòng)子結(jié)合，被稱為SQUA啟動(dòng)子結(jié)合蛋白［1］。SPL基因編碼一個(gè)高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域約含76個(gè)氨基酸殘基，包括Cys-Cys-His-Cys和Cys-Cys-Cys-His兩個(gè)串聯(lián)鋅指，并在C端具有核定位信號(hào)［2］。研究表明，SPL調(diào)控植物從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)葉片形態(tài)發(fā)生，參與環(huán)境信號(hào)的響應(yīng)對(duì)植物生長發(fā)育發(fā)揮著重要作用［3］。此外，SPL基因參與調(diào)節(jié)花器官的形成及其后期發(fā)育［4］。

SPL基因最初從金魚草的cDNA文庫中分離出來［5］，隨著植物基因組數(shù)據(jù)的不斷發(fā)表，許多物種相繼進(jìn)行了SPL基因的全基因組鑒定與分析。擬南芥的基因組共鑒定出16個(gè)SPL基因［6］，隨后SPL家族在番茄、苦蕎、白樺樹、綠藻、苔蘚、玉米、葡萄、蘋果、甜瓜、丹參、蓖麻、棉花、梅花、矮牽?；ā⒏涕?、小麥、菊花、辣椒等［7-24］中相繼被分離鑒定出來，但目前月季的SPL基因尚未被鑒定。

本研究通過生物信息學(xué)的方法對(duì)月季RcSPL基因家族進(jìn)行了全面分析，包括基因結(jié)構(gòu)、染色體位置和共線性分析等，旨在探究RcSPL基因在月季花瓣發(fā)育中所行使的功能，為調(diào)控月季花瓣發(fā)育提供分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從已公布的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘月季轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，月季轉(zhuǎn)錄組材料為花蕾期、開花期、凋謝期的近軸與遠(yuǎn)軸端月季花瓣。

1.2 方法

1.2.1 月季SPL基因序列的鑒定 月季的基因組序列和注釋文件下載于月季Rosa chinensis‘Old Blush’基因組網(wǎng)站（https：//lipm-browsers.toulouse.inra.fr//pub/RchiOBHm-V2/）［25］。擬 南 芥 的16條SPL基 因下載于擬南芥數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org）。SPL基因家族的SBP-box結(jié)構(gòu)域（PF03110）下載于Pfam（http：//pfam.xfam.org）數(shù)據(jù)庫。16條擬南芥的SPL基因的蛋白序列被作為query序列進(jìn)行比對(duì)，利用BLASTP（E＜10-5）在月季蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)搜索，并除去重復(fù)序列。采用HMMER 3.0軟件的隱馬爾可夫模型（HMM）對(duì)SBP結(jié)構(gòu)域［26］再次進(jìn)行比對(duì)搜索，將2次搜索得到的序列取交集，最終確認(rèn)為月季的RcSPL家族基因數(shù)目。

1.2.2 月季SPL基因家族分類及蛋白結(jié)構(gòu)域、順式作用元件分析 利用ClustalX 1.83將鑒定到的月季RcSPL家族蛋白序列和擬南芥SPL家族蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)［27］，隨后利用MEGA5采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹［28］，Bootstrap method設(shè)置為1 000。利用在線軟件GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）繪制基因結(jié)構(gòu)圖［29］。利用 在 線 軟 件MEME 5.0.2（http：//meme-suite.org）［30］對(duì)SPL蛋白家族的保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)數(shù)目設(shè)置為10，其他參數(shù)為默認(rèn)值。利用plantcare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be）網(wǎng)站預(yù)測(cè)月季RcSPL基因上游2 000 bp的順勢(shì)作用元件。

1.2.3 染色體定位以及共線性分析 使用MapChart 2.2軟件繪制月季RcSPL家族在染色體每條染色體的位置［31］。利用MCscanX軟件分析月季RcSPL基因家族在基因組中的共線性以及復(fù)制事件［32］。

1.2.4 月季SPL基因的表達(dá)分析 根據(jù)已發(fā)表NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫中月季轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject）提取出RcSPL基因的相關(guān)表達(dá)量，利用pheatmap軟件包繪制相關(guān)熱圖［33］。

2 結(jié)果與分析

2.1 月季SPL基因家族成員鑒定、特征分析、進(jìn)化樹分析

通過blast和hmmer在月季的基因組中共檢索出17個(gè)RcSPL基因，分別命名為RcSPL1至RcSPL17（表1）。系統(tǒng)發(fā)育樹將擬南芥與月季的RcSPL基因分成8個(gè)亞組（圖1），RcSPL6為Ⅰ組，RcSPL7、RcSPL8、RcSPL17為Ⅱ組，RcSPL1為Ⅲ組，RcSPL11、RcSPL14、RcSPL15為Ⅳ組，RcSPL2、RcSPL10為Ⅴ組，RcSPL3、RcSPL12、RcSPL13為Ⅵ組，RcSPL4、RcSPL9、RcSPL16為Ⅶ組，RcSPL5為Ⅷ組，Ⅳ組與Ⅶ組處于同一進(jìn)化分支，Ⅲ組、Ⅷ組、Ⅴ組處于同一分支且親緣關(guān)系更近。RcSPL基因蛋白序列長度為156～1 075 aa，分子量為17.7～118.62 kDa，等電點(diǎn)除RcSPL7均超過7，顯弱堿性。

表1 月季SPL基因的起始位置、終止位置、相對(duì)分子質(zhì)量、蛋白序列長度和等電點(diǎn)

圖1 擬南芥和月季的SPL基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 月季SPL基因保守結(jié)構(gòu)域、motif、基因結(jié)構(gòu)、順勢(shì)作用元件分析

多序列比對(duì)分析結(jié)果表明，RcSPL基因中SBP結(jié)構(gòu)域非常保守（圖2），其包含兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，Zn-1、Zn-2和一個(gè)高度保守的核定位信號(hào)。比較RcSPL基因外顯子和內(nèi)含子數(shù)量和位置（圖3），RcSPL基因含有2～10個(gè)外顯子，各亞組間成員所含外顯子差異較大，Ⅱ亞組中含有最多的外顯子，其中RcSPL7包含10個(gè)外顯子，Ⅵ亞組成員所含外顯子最少，均為2～3個(gè)；各亞組內(nèi)成員間外顯子數(shù)目相似。

圖2 月季SPL蛋白序列關(guān)鍵部位的多序列比對(duì)結(jié)果

圖3 月季SPL基因的基因結(jié)構(gòu)

保守基序分析預(yù)測(cè)到10個(gè)保守基序（圖4），將這10個(gè)保守基序按順序命名為Motif 1～Motif 10，分析發(fā)現(xiàn)所有蛋白序列均含有Motif 1。Ⅱ亞組成員具有最多的保守基序，并且所含種類也最多，Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ亞組成員均只含有Motif 1。

圖4 月季SPL基因的進(jìn)化關(guān)系和motif的預(yù)測(cè)

預(yù)測(cè)月季SPL基因上游2 000 bp的順勢(shì)作用元件（圖5），定向分析了MYB與MYC的作用位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其上游2 000 bp中含有2～13個(gè)MYB與MYC作用位點(diǎn)，除RcSPL2、RcSPL5均含有5個(gè)及以上的作用位點(diǎn)。

圖5 月季SPL基因部分順式作用元件分布情況

2.3 月季SPL基因的共線性分析、復(fù)制分析、染色體定位分析

染色體定位分析表明，RcSPL基因在除6號(hào)染色體外的其余6條染色體上均有分布（圖6）。RcSPL的復(fù)制事件分析結(jié)果表明，該家族在月季中有兩對(duì)串聯(lián)復(fù)制基因，分別為1號(hào)染色體的RcSPL1和Rc-SPL2，2號(hào)染 色體的RcSPL7和RcSPL8。RcSPL1和RcSPL2分別為Ⅲ亞組和Ⅴ亞組，RcSPL7和RcSPL8均為Ⅱ亞組。共線性分析發(fā)現(xiàn)，月季中RcSPL基因有四個(gè)共線性塊（圖7）。

圖6 月季SPL基因在染色體上的分布情況

圖7 月季SPL基因的共線性分析

2.4 月季SPL基因家族表達(dá)分析

通過NCBI轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)月季花蕾期（FB）、開花期（OF）、凋花期（SF）花瓣的近軸（AD）與遠(yuǎn)軸（AB）RcSPL基因表達(dá)相關(guān)，大多數(shù)月季SPL基因的表達(dá)模式具有相似性，RcSPL3與RcSPL5顯著正相關(guān)為0.9，且與其他基因具有相反的表達(dá)模式（圖8）?；虮磉_(dá)分析表明月季的RcSPL基因在開花后期表達(dá)相對(duì)較高，RcSPL3、RcSPL5、RcSPL16在花蕾期表達(dá)相對(duì)較高，RcSPL1、RcSPL13、RcSPL9、RcSPL12在花凋謝時(shí)期表達(dá)相對(duì)較高，RcSPL2、Rc-SPL14、RcSPL4、RcSPL15在開花期和花蕾期表達(dá)相對(duì)較 高，RcSPL10、RcSPL11、RcSPL17、RcSPL6、Rc-SPL7、RcSPL8在花蕾期表達(dá)相對(duì)較高（圖9）。

圖8 月季SPL基因表達(dá)模式的相關(guān)性

圖9 月季花瓣近軸與遠(yuǎn)軸RcSPL基因花蕾期、開花期、凋謝期的表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

SPL基因在植株的生長發(fā)育過程行使著重要的功能，研究在月季的基因組中共發(fā)掘出17個(gè)RcSPL成員，系統(tǒng)發(fā)育樹分析將其分成8個(gè)亞組，每個(gè)亞組具有較為相似的基因結(jié)構(gòu)且外顯子數(shù)目基本相同，這與前人研究結(jié)果相符［34，35］。通過RcSPL蛋白序列的保守基序分析發(fā)現(xiàn)，每條RcSPL均具有Motif 1。此外，Ⅱ亞組具有最多的保守基序，最多的外顯子，具有較高水平的表達(dá)，推測(cè)其在月季花開過程行使重要的功能。

RcSPL基因上游2 000 bp的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，該段區(qū)域具有2～13個(gè)MYB與MYC轉(zhuǎn)錄因子的作用位點(diǎn)，MYB是一種調(diào)控花色的轉(zhuǎn)錄因子，MYB與MYC在花青素的合成中起著重要的作用。有研究表明SPL基因與花青素的含量和花香有關(guān)［36］，因此推測(cè)SPL基因很可能與MYB和MYC相互作用調(diào)控月季花青素的含量，共同調(diào)控花的生長發(fā)育。

分析基因表達(dá)模式的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)月季RcSPL基因的表達(dá)模式具有相似性，RcSPL3、RcSPL5的表達(dá)模式與其他基因相反，推測(cè)這兩個(gè)基因可能發(fā)揮與其他RcSPL基因相反的功能。轉(zhuǎn)錄因子通常在控制組織特異性基因的表達(dá)中起著關(guān)鍵性作用［37］。根據(jù)RcSPL家族表達(dá)量的分析，發(fā)現(xiàn)RcSPL成員間表達(dá)差異明顯。研究表明，擬南芥SPL8能夠影響花粉的發(fā)育［38］，GbSBP6基因在銀杏胚珠中顯著表達(dá)且與擬南芥SPL8位于同一亞組，可能參與了銀杏的花發(fā)育［39］，RcSPL1也位于該亞組，推測(cè)RcSPL1可能參與月季花粉形成的調(diào)控。前人研究表明擬南芥SPL3、SPL4、SPL5編碼的轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控開花時(shí)間和成花轉(zhuǎn)變，該亞組的多數(shù)SPL成員與植物生殖器官的生長發(fā)育有關(guān)，野生葡萄的VvSBP11參與了 成 花 轉(zhuǎn) 變 過 程［40］。RcSPL3與 擬 南 芥 的SPL3、SPL4、SPL5處于同一亞組且在花蕾期有相對(duì)的高表達(dá)，因此推測(cè)RcSPL3可能參與月季開花時(shí)間的調(diào)控。