張少芬，王志蓮

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，近年研究表明，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是多基因的遺傳學(xué)與表觀遺傳學(xué)共同作用的結(jié)果?，F(xiàn)在越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)腫瘤中表觀遺傳學(xué)的改變，特別是基因的異常甲基化在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中扮演不可或缺的角色，對其進(jìn)行研究有利于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)及在治療上取得新突破。其中抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 島的異常高甲基化可以引起腫瘤抑制基因沉默表達(dá)，與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)[1]。人類DKK3（dickkopf-3）是近年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，也是經(jīng)典Wnt 信號傳導(dǎo)通路的重要的細(xì)胞外抑制因子。DKK3 在人類惡性腫瘤中普遍下調(diào)，是致癌過程中潛在的關(guān)鍵因素?，F(xiàn)對DKK3基因的分子生物學(xué)特性、在腫瘤中的表達(dá)和功能及其與宮頸癌相關(guān)性的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 DKK3 概述

DKK3 基因?qū)儆诰幋a分泌性Wnt 拮抗劑的Dickkopf 基因家族（包括DKK1、DKK2、DKK3、DKK4及Soggy），也被命名為“永生化細(xì)胞中的減少表達(dá)基因”（reduced expression in immortalized cells gene，REIC）。該基因位于人類染色體的11p15.3 位點(diǎn)，這是一個(gè)在癌變中常缺失的位點(diǎn)。DKK3 基因包含46 358 個(gè)核苷酸，有9 個(gè)外顯子和2 個(gè)啟動(dòng)子，mRNA第198～1 247 堿基對編碼產(chǎn)生由350 個(gè)氨基酸組成的DKK3 蛋白[2]。

DKK3 是一種分泌糖蛋白，分子質(zhì)量約為38 ku，是DKK 蛋白家族中的一個(gè)特征性成員。DKK3 含有2 個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域Cys-1 和Cys-2，其中氨基端富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域是每個(gè)DKK 蛋白特有的，而羧基端半胱氨酸豐富的結(jié)構(gòu)域在家族成員中是保守的，暗示一個(gè)保守的功能，這2 個(gè)結(jié)構(gòu)域由12 個(gè)氨基酸組成的連接區(qū)隔開。DKK3 與其他家族成員同樣具有幾個(gè)蛋白酶水解位點(diǎn)，表明其在翻譯后發(fā)生了修飾。但與DKK1 和DKK2 只有1 個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)不同，DKK3 具有4 個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，且存在特殊結(jié)構(gòu)Soggy（SGY）結(jié)構(gòu)域[3]。

2 DKK3 與腫瘤的關(guān)系

2.1 DKK3 的抑癌機(jī)制DKK3 屬于Dickkopf Wnt信號通路抑制因子家族，該家族成員通過與細(xì)胞表面受體或細(xì)胞質(zhì)中伴侶蛋白相互作用而發(fā)揮Wnt 信號通路內(nèi)源性拮抗劑的功能。Wnt 信號是一種進(jìn)化保守的信號通路，在形態(tài)發(fā)生和癌變過程中起著重要作用，該信號通路的異常激活在多種惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制中起著核心作用[4]。DKK3 與DKK1、DKK2和DKK4 不同，不與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（lowdensity lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6）或受體Kremen1 結(jié)合[5]，其調(diào)控Wnt/β-catenin信號的能力存在爭議，可能是通過一種與Wnt 無關(guān)的途徑參與β-catenin 失活，從而抑制β-catenin 下游的靶基因（例如c-myc、Cyclin D、Axin-2 等）表達(dá)。Leonard 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，除DKK3 蛋白外，DKK3 基因還編碼一種細(xì)胞質(zhì)的、非分泌型的異構(gòu)體DKK3b，DKK3b 填補(bǔ)了連接DKK3 基因與其調(diào)節(jié)β-catenin信號通路間的空白。

除了β-catenin 信號通路，DKK3 還可通過其他途徑發(fā)揮抗腫瘤功能。DKK3 可通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)JNK 激活，促進(jìn)細(xì)胞型特異性caspase 依賴型凋亡[7]。還有文獻(xiàn)報(bào)道，在卵巢癌細(xì)胞中DKK3可通過逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。DKK3 還可能通過抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[9]。此外，目前認(rèn)為DKK3 可能是一種新的免疫調(diào)節(jié)劑，激活了抗腫瘤免疫反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)在外周血單核細(xì)胞中，DKK3 蛋白上調(diào)了單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞樣表型的分化，并隨后激活了細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞的功能[10-11]。

2.2 DKK3 重要的失活機(jī)制DKK3 啟動(dòng)子區(qū)富含CpG 島，已有研究證實(shí)在DKK3 啟動(dòng)子區(qū)域的異常甲基化狀態(tài)是導(dǎo)致DKK3 表達(dá)下調(diào)、沉默的原因之一[12]。癌組織中DKK3 基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 島甲基化水平高于正常組織，這種高甲基化狀態(tài)在多種惡性腫瘤（如非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、肝癌）中均被檢測到[13]，且DKK3 基因甲基化水平及表達(dá)情況與疾病嚴(yán)重程度、預(yù)后好壞有關(guān)。鑒于DKK3 基因異常甲基化在多種腫瘤中均可檢測到，其可作為判斷患者發(fā)病、復(fù)發(fā)、預(yù)后的生物標(biāo)志物，較傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物具有更高的敏感度及特異度，在疾病的診斷、監(jiān)測等方面具有重要價(jià)值。

2.3 DKK3 是腫瘤治療中的潛在靶點(diǎn)基因啟動(dòng)子甲基化的潛在可逆性為新型抗癌藥物的開發(fā)提供了機(jī)會。有研究發(fā)現(xiàn)，去甲基化治療可以恢復(fù)DKK3在胃癌細(xì)胞中的功能，即促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡并抑制其增殖[14]。近年來，隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，一些DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）抑制劑（如5-氮胞嘧啶、地西他濱等）得以開發(fā)，這些藥物可重新激活表觀沉默的腫瘤抑制基因，并被成功地用于治療包括口腔鱗狀細(xì)胞癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤[15]。

此外，DKK3 靶向性腫瘤治療，即腫瘤內(nèi)注射攜帶REIC/DKK3 基因的腺病毒載體（adenoviral vector，Ad）也是一種前景廣闊的基因治療方法。該方法通過啟動(dòng)DKK3 基因在惡性組織中的重新表達(dá)來誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。據(jù)報(bào)道，第2 代腺病毒介導(dǎo)的DKK3 全長cDNA 在小鼠異種移植瘤模型中的表達(dá)能發(fā)揮抗腫瘤作用[16]?，F(xiàn)在，有研究正在探討Ad-REIC 在肝癌[17]等惡性腫瘤治療中的臨床應(yīng)用。總之，DKK3 可能是一個(gè)潛在的抗癌靶點(diǎn)，但尚需進(jìn)一步研究來驗(yàn)證基因治療的可行性。

3 DKK3 與宮頸癌的相關(guān)性

宮頸癌是威脅全球婦女健康及生命的主要惡性腫瘤之一，目前其發(fā)病率為女性惡性腫瘤的第4 位，也是婦女惡性腫瘤死亡的第4 大原因[18]。眾所周知，高危型人乳頭瘤病毒（HPV）的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要病因，基于此，HPV 疫苗的應(yīng)用和宮頸癌篩查使宮頸癌的發(fā)病率顯著降低。但宮頸癌發(fā)病率和死亡率在發(fā)展中國家仍居高不下，其依然是一項(xiàng)全球性的重大健康挑戰(zhàn)[19]。據(jù)估計(jì)，2018年我國有10.6萬新發(fā)病例和4.8 萬例死亡[20]。目前關(guān)于宮頸癌的研究已廣泛開展，但其具體發(fā)病機(jī)制及協(xié)同因素仍有待闡明。

隨著對宮頸癌表觀遺傳學(xué)機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)原癌基因、抑癌基因及相關(guān)調(diào)節(jié)基因的分子生物學(xué)異常改變與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。不同的研究報(bào)道了宮頸癌患者中經(jīng)常發(fā)生改變的不同組基因，而DKK3 是其中具有代表性的抑癌基因之一。2009年，Lee 等[21]首次發(fā)現(xiàn)，與正常宮頸組織相比，宮頸癌組織中DKK3 mRNA 表達(dá)常下調(diào)，并與其啟動(dòng)子區(qū)高甲基化有關(guān)，這一結(jié)果與DKK3 在多數(shù)腫瘤中的表現(xiàn)一致。研究表明，Wnt/β-catenin 信號通路在人子宮頸角質(zhì)形成細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中被激活，β-catenin 結(jié)構(gòu)和信號特性的不平衡參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，最終宮頸癌組織中β-catenin 在細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核中異常積累。宮頸癌中DKK3 蛋白作為β-catenin 的負(fù)調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，其下調(diào)參與了β-catenin 信號通路的激活。一方面DKK3 蛋白抑制β-catenin 的轉(zhuǎn)錄活性，降低β-catenin 表達(dá)，并阻斷β-catenin 向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)使其失活；另一方面通過與含有β 轉(zhuǎn)導(dǎo)素的重復(fù)蛋白（βTrCP）的協(xié)同作用增強(qiáng)DKK3 蛋白對β-catenin 的抑制作用，促進(jìn)βcatenin 降解（或）核轉(zhuǎn)運(yùn)，最終導(dǎo)致β-catenin 下游靶基因（VEGF、Cyclin D）表達(dá)減少[21]。之后，Ryu 等[22]通過免疫組織化學(xué)法證實(shí)在50%的宮頸原位癌及64.8%的浸潤癌中DKK3 蛋白的表達(dá)低于正常對照組。Luo 等[23]的研究表明，DKK3 是HeLa 細(xì)胞中miR-92a 的直接靶基因，其蛋白表達(dá)受miR-92a 的負(fù)調(diào)控，DKK3 的過表達(dá)減弱了miR-92a 對宮頸癌細(xì)胞活力和侵襲的促進(jìn)作用。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，是一個(gè)多因素、多基因、多步驟協(xié)同參與的過程，DKK3 參與的詳細(xì)機(jī)制尚未完全清楚。

DKK3 可作為治療宮頸癌的靶基因。研究發(fā)現(xiàn)將DKK3 導(dǎo)入HeLa 宮頸癌細(xì)胞后，抑制β-catenin表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞集落形成減少，細(xì)胞生長減慢，這提示DKK3 蛋白對宮頸癌細(xì)胞具有抗增殖活性[21]。此外，最近的研究發(fā)現(xiàn)DKK3 過度表達(dá)促進(jìn)宮頸癌HeLa 細(xì)胞中Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，抑制B 細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）在細(xì)胞中的表達(dá)，最終抑制HeLa 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[24]。

目前一些研究對宮頸癌患者中DKK3 表達(dá)水平與預(yù)后相關(guān)性進(jìn)行了分析。宮頸組織中DKK3 蛋白高表達(dá)的患者總體生存率和腫瘤緩解率均較高，DKK3 蛋白低表達(dá)則與宮頸癌患者的不良臨床結(jié)局有關(guān)[22]。Jiang 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者血清DKK3蛋白水平明顯高于正常人，且與臨床分期、腫瘤直徑有關(guān)，表明血清DKK3 蛋白水平低對患者預(yù)后不良有較好的預(yù)測作用。在基因甲基化方面，van der Meide等[26]研究表明癌組織中DKK3 啟動(dòng)子甲基化頻率顯著高于正常宮頸組織，且與宮頸鱗狀細(xì)胞癌相比，宮頸腺癌中DKK3 甲基化頻率明顯升高。2018年，Zhang等[27]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)38%的宮頸腺癌組織中有DKK3 啟動(dòng)子甲基化，而在正常宮頸組織未發(fā)現(xiàn)。DKK3 基因的甲基化水平隨腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移而升高，與宮頸腺癌的預(yù)后密切相關(guān)，可用于宮頸腺癌患者預(yù)后和治療效果的評估[4]。Kang 等[28]則證實(shí)了DKK3 甲基化對預(yù)后不利，并首次通過比較定量的甲基化分析確定了與宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者無復(fù)發(fā)生存相關(guān)的DKK3 啟動(dòng)子區(qū)域第1 位甲基化水平的閾值（26.3%），進(jìn)一步確定了預(yù)測疾病復(fù)發(fā)的新的臨床-表觀遺傳組合，旨在對宮頸癌患者進(jìn)行更精確地分層，優(yōu)化治療方案。

總之，DKK3 基因啟動(dòng)子甲基化是宮頸癌中的頻發(fā)事件，這為宮頸癌發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的思路，也為宮頸癌的治療提供了新的方向。DKK3 可能作為宮頸癌新的治療靶點(diǎn)，并在宮頸癌的分期預(yù)測、預(yù)后評估中可能有所作用。

4 結(jié)語與展望

宮頸癌的發(fā)生是體內(nèi)外等多方面因素共同作用的結(jié)果。盡管目前的研究已經(jīng)證實(shí)DKK3 參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但對其作為抑癌基因在宮頸癌分子發(fā)病機(jī)制中的作用仍知之甚少，其與其他癌基因及抑癌基因之間的相互作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。隨著對DKK3 基因的進(jìn)一步深入研究，其可能會成為宮頸癌診斷、治療及其預(yù)后的指標(biāo)，并為闡明宮頸癌的發(fā)生機(jī)制及行基因治療提供新思路。