苑召虎 魏亞明

輸血醫(yī)學(xué)已經(jīng)成為臨床醫(yī)學(xué)中不可或缺的重要組成部分，保障患者安全、有效、合理和經(jīng)濟的用血是臨床醫(yī)療機構(gòu)輸血治療技術(shù)水平的重要體現(xiàn)。成分輸血是臨床輸血治療主要標(biāo)志[1]。臨床上，紅細胞輸注的主要目的是為了提高血液中的氧合血紅蛋白含量，血紅蛋白與從肺部吸入的氧氣結(jié)合，運送到身體各個器官組織，從而改善機體缺氧狀態(tài)。血小板成分輸注在臨床治療上被廣泛應(yīng)用于治療血小板減少或血小板功能障礙相關(guān)疾病，血小板通過內(nèi)皮下組織的膠原纖維結(jié)合蛋白以及凝血酶等激活后，發(fā)生變形、釋放和聚集等一系列反應(yīng)，起到初期止血的作用。

血液離開機體在體外儲存過程中會發(fā)生一系列生理生化、形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能變化，稱為“儲存損傷”。研究顯示，儲存紅細胞的生化、形態(tài)學(xué)和組學(xué)特征在大約14天后發(fā)生了明顯的變化，血液流變學(xué)指標(biāo)發(fā)生明顯改變，血液粘度和聚集性增高，紅細胞變形能力下降，通過毛細血管時容易遭到破壞從而加重局部缺血。紅細胞的體外儲存損傷除引起紅細胞直接破壞外，還可促進紅細胞自殺性程序性死亡，即衰亡（eryptosis）[2]。研究顯示儲存損傷可促進受者血液中1/4以上儲存紅細胞在輸注24 h后迅速清除[3]。我們及他人的研究顯示，一氧化氮（NO）可有效改善紅細胞變形能力，血液粘度下降，使血流阻力減少，血流流速增加，改善了血液流變特性，增加了血液攜氧和運輸營養(yǎng)物質(zhì)的能力[4，5]。與紅細胞相似，血小板在保存期間也會發(fā)生形狀和生物化學(xué)變化，這些變化包括血小板圓盤狀消失，形態(tài)由雙面凸形向球形轉(zhuǎn)變、樹枝突起及偽足生成，導(dǎo)致血小板膜糖蛋白的改變。血小板保存過程中的代謝導(dǎo)致耗氧增加，使乳酸大量堆積、酸度升高、pH下降，進而導(dǎo)致血小板活化、血小板顆粒分泌并釋放出內(nèi)容物，其“活化”的形態(tài)學(xué)變化還常伴有凋亡，進而導(dǎo)致其體外功能的變化，如粘附和聚集等，反映了血小板在儲存期間完整性和功能的喪失[6]。

紅細胞和血小板都屬于無核細胞，但研究顯示在紅細胞及血小板胞漿中仍存有大量的非編碼RNA（Non-coding RNA，ncRNA），而且這些非編碼RNA對紅細胞和血小板的發(fā)育至關(guān)重要，這些非編碼RNA根據(jù)堿基長度可以分為短鏈RNA［如微小RNA（MicroRNA，miRNA）、內(nèi)源性小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）、與Pi蛋白相互作用 RNA（Piwi-interactiing RNA，Pi RNA）］、長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNAs，lncRNA）以及與以上線性結(jié)構(gòu)不同的環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）等[7-10]。非編碼RNA是參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的小分子RNA，其本身并不編碼任何蛋白質(zhì)，只能通過逆向調(diào)節(jié)靶基因（mRNA）來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成與分解[11]。不同造血細胞中ncRNA存在不同的表達類型，以此可以區(qū)分不同的造血細胞系，且不同的ncRNA在造血細胞系的不同階段發(fā)揮的作用不同[12]。近年來，研究顯示在紅細胞或血小板在體外儲存過程中，ncRNA呈現(xiàn)不同表達狀態(tài)，有可能成為“儲存損傷”的標(biāo)志物[8-10]。雖然紅細胞、血小板仍存在體外低溫存儲的情況，如-80℃保存的冰凍血小板及冰凍甘油紅細胞等，但目前關(guān)于儲存血細胞中非編碼RNA的研究都集中在常規(guī)保存條件下（紅細胞在4±2℃保存，血小板在22±2℃保存）。

1 miRNA miRNA是一種內(nèi)源性、廣泛存在于真核生物中的單鏈小RNA。miRNA基因以單拷貝、多拷貝及基因簇的形式離散地分布在基因組中，其中70%～90%位于間隔區(qū)，其余位于內(nèi)含子或外顯子上。大多數(shù)miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ作用下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生幾百至幾千個核苷酸的初級miRNA產(chǎn)物（pri-miRNA），在細胞核內(nèi)被RNaseⅢ內(nèi)切酶家族的Drosha酶切割成70個核糖核苷酸左右的發(fā)夾狀前體miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA在轉(zhuǎn)運蛋白的作用下轉(zhuǎn)運出核，然后經(jīng)Dicer酶切割成長度約19～25個核苷酸的成熟miRNA[13,14]。miRNA在多種生命過程中發(fā)揮著重要作用，其在特定的細胞或組織、時間、發(fā)育階段才會表達，提示它對組織的發(fā)育有著潛在的重要作用[7-9]。

1.1 miRNA在體外儲存紅細胞中的表達及其在儲存損傷的作用：miRNA在造血過程中的重要作用早期已有報道，近期人們發(fā)現(xiàn)成熟紅細胞內(nèi)含有大量miRNA。2010年，MEGANATHAN KANNAN等首次提供了存儲紅細胞的miRNA差異圖譜，為識別新的儲存損傷的RBC生物標(biāo)志物開辟了新的途徑，提出了儲存紅細胞可能存在靶基因-miRNA調(diào)控途徑[1]。2015年，CHINTAMANI ATREYA通過在人有核紅細胞系過表達hsa-miR-196a，證實了hsamiR-196a對紅細胞衰亡和ATP消耗的保護作用[2]。隨后探索了AGO2-miRNA復(fù)合體在成熟紅細胞中的作用。我們通過基因芯片研究顯示，當(dāng)儲存20天紅細胞與新鮮組比較時，有109個miRNA在儲存過程中表達上調(diào)和102個基因表達下調(diào)。經(jīng)RT-PCR驗證的13個miRNAs中，miR-31-5p、miR-196a-5p、miR-203a、miR-654-3p，miR-3591-5p和miR-769-3p表達上升，let-7a-3p、miR-96-5p、miR-150-5p和miR-197-3p表達下降，具有明顯變化趨勢的miRNAs可以作為“儲存損傷”的生物學(xué)標(biāo)志物[15]。其中，miR-196a-5p、let-7a-3p、miR-96-5p、miR-150-5p、miR-145-3p和miR-197-3p被證實與RBC和血小板儲存過程中的凋亡信號通路有關(guān)，其中miR-196a-5p、miR-96-5p、miR-150-5p和miR-197-3p在紅細胞儲存0～20天時表現(xiàn)為上升趨勢，let-7a-3p和miR-145-3p在紅細胞整個儲存過程中均保持較低水平，let-7b可作為分期特異性紅細胞轉(zhuǎn)錄程序的關(guān)鍵調(diào)控因子，而miR-150-5p的下調(diào)是紅細胞生成所必需的；miR-96-5p在網(wǎng)織紅細胞中亦高表達，與Hb形成有關(guān)[16，17]。通過KEGG預(yù)測分析顯示，miR-203a、miR-654-3p和miR-31-5p表達上調(diào)調(diào)節(jié)CASP10表達下調(diào)；miR-203a和miR-196a-5p表達上調(diào)調(diào)節(jié)CASP8表達下調(diào)；miR-31-5p表達上調(diào)調(diào)節(jié)MAP3K14表達下調(diào)；miR-203a表達上調(diào)調(diào)節(jié)IL3表達下調(diào)；miR-203a、miR-654-3p、miR-3591-5p和miR-31-5p表達上調(diào)調(diào)節(jié)PPP3CA表達下調(diào)；miR-203a、miR-654-3p和miR-3591-5p表達上調(diào)調(diào)節(jié)ATM表達下調(diào)，從而抑制凋亡，延長紅細胞儲存時間[5，17]。SARACHANA等學(xué)者分析發(fā)現(xiàn)了四種與紅細胞儲存損傷相關(guān)的mricoRNA，通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)這4個miRNA在第14天和第28天存在差異表達。生物信息學(xué)分析確定了這些miRNA的潛在靶點和生物學(xué)功能。在人紅細胞細胞系中過表達hsa-miR-196a證實了它對細胞死亡和ATP丟失的保護作用[8]。

1.2 miRNA在體外儲存血小板中的表達及其在儲存損傷的作用：與紅細胞相似，血小板中亦含有大量的miRNA，這些miRNA表達量隨著血小板在體外保存時間的延長，呈現(xiàn)不同變化趨勢。在體外儲存血小板中miRNA表達量降低為主要趨勢，升高的miRNA數(shù)量遠少于降低的miRNA，這些變化的miRNA可通過調(diào)控相應(yīng)的蛋白表達來影響血小板的聚集功能。如在血小板活化聚集通路中miR-223、miR-21、let-7b可通過相關(guān)的mRNA來調(diào)節(jié)血小板中蛋白表達，進而影響血小板的聚集功能。血小板miRNA的靶基因還與血小板活化、脫粒、血小板源生長因子受體信號通路及干細胞分化等相關(guān)。其中miR-223顯示了對P2Y12的調(diào)控、對血小板活化通路的影響，且具有易檢測的特征，具備成為首個血小板儲存損傷的生物學(xué)標(biāo)記的潛質(zhì)[18]。在人類中，估計約60%的蛋白編碼基因受miRNAs的調(diào)控，并被認為參與了大部分的生理和病理過程。在血小板儲存條件下，miRNAs繼續(xù)發(fā)揮活性，血小板貯藏過程中與血小板表型相關(guān)的miRNA-mRNA表達可能發(fā)生改變。多種靶向預(yù)測顯示一個miRNAs可以靶向多個mRNA，大多數(shù)mRNA被多個miRNAs靶向，揭示了miRNA譜和血小板反應(yīng)性之間的聯(lián)系[19]。

KANNAN等學(xué)者通過膜陣列miRNA分析明確了血小板儲存凋亡相關(guān)的52個miRNA，研究顯示miR-150、miR-151、miR-152、miR-184、miR-188、miR-196a、miR-197和miR-202在血小板的體外儲存期間始終保持較高水平；Let-7b和miR-16在PLT存儲過程中表現(xiàn)出顯著增加的趨勢，而miR-7和miR-145表現(xiàn)出顯著下降的趨勢，并進一步通過生物學(xué)信息預(yù)測出這四個miRNA潛在的靶mRNA，為血小板存儲相關(guān)病變的分子機制提供新的見解[7]。通過KEGG數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻推測miRNA與血小板活化聚集過程存在有調(diào)控關(guān)系，如let-7b影響GPⅢa從而影響血小板聚集過程，miR-223參與對P2Y12 mRNA表達的調(diào)控，從而影響P2Y12蛋白的合成，miR-21也可能作用于P2Y12[18]。此外，miR-326可下調(diào)抗凋亡基因Bcl-xL的表達外，進而引起血小板凋亡[20]。與上述結(jié)果一致的是，在血小板儲存過程中miR-16靶基因的增加參與了凋亡。DAHIYA等還發(fā)現(xiàn)在儲存的血小板中，miR-570可與編碼mRNA的線粒體ATP酶亞基g（ATP5L）相互作用，因此，miR-570也可以作為存儲血小板質(zhì)量和活性的生物標(biāo)志物之一[21]。通過ApoE-/-小鼠模型研究顯示來源于小鼠血小板的miR-25-3p可通過NF-κB以減輕脂質(zhì)氧化[22]。miR-96可以作用于VAMP8相關(guān)的mRNA，VAMP8可通過影響ADP在血小板活化聚集通路中起作用，miRNA-96含量與VAMP8蛋白及其mRNA的含量呈反比，并且miRNA-96具有抑制VAMP8蛋白表達的作用，從而可降低血小板的活化能力[23]

2 長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）lncRNA是一種長度大于200bp，不能編碼蛋白質(zhì)，具有重要調(diào)控功能的轉(zhuǎn)錄本。大量研究證實lncRNA可在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白修飾等四個水平調(diào)控基因的表達，在細胞分化、增殖、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。lncRNAs在不同的組織，發(fā)育階段和生理情況下的表達也不同；有些是生命所必需的，有些只是特定的發(fā)育階段或生理功能所必需的。lncRNA與DNA、RNA及蛋白質(zhì)通過多種方式相互作用，通過堿基互補配對或者是形成結(jié)構(gòu)域來發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

2.1 lncRNA在體外儲存紅細胞中的表達及其在儲存損傷的作用：截至投稿，關(guān)于lncRNA在RBC中功能的研究，更多的集中在紅系祖細胞的分化、白細胞激活和DNA修復(fù)上，與紅細胞儲存損傷相關(guān)研究尚處于早期階段；早期丁楠等學(xué)者通過高通量測序技術(shù)獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從臍帶血造血干細胞到無核成熟的紅細胞共六個階段（即HSC、P2、P3、P4、P5和無核RBC六個階段）中研究發(fā)現(xiàn)了1 034個已知lncRNAs，明確了35 090對lncRNAs-基因潛在的互作關(guān)系，綜合分析表明lncRNA可參與調(diào)控紅細胞的成熟，特別是與血紅蛋白代謝、對氧反應(yīng)性和DNA損傷的有關(guān)[24]。JUAN等學(xué)者通過全基因組分析發(fā)現(xiàn)了多種在紅細胞生成過程中動態(tài)表達及顯示表觀遺傳調(diào)控的lncRNAs，這些lncRNAs可被關(guān)鍵的紅細胞轉(zhuǎn)錄因子GATA1、TAL1或KLF1靶向控制，這些lncRNA的耗盡可嚴重損害紅細胞的成熟，抑制紅細胞體積的減小及去核過程[25]，如lncRNA shlnc-EC6可通過Rac1/PIP5K信號通路調(diào)節(jié)小鼠胚胎成熟紅細胞的去核[24]。

2.2 lncRNA在體外儲存血小板中的表達及其在儲存損傷的作用：早期我們通過芯片研究顯示在人血小板儲存過程中有大量的lncRNA表達發(fā)生改變，第5天與第2天相比，有162種lncRNA表達發(fā)生了變化，升高的有4種，降低的有158種；第8天與第2天相比，有691種lncRNA發(fā)生變化，表達升高的有20種，降低的有671種；第8天與第5天相比，有246種lncRNA發(fā)生變化，有2種表達升高，244種表達降低，分析表明部分變化的lncRNA與血小板聚集、血小板激活、內(nèi)吞等生理過程相關(guān)。KEGG功能分析顯示lnc-WBSCR16-3∶6、lnc-CHD1L-1∶10、lnc-EWSR1-2∶1及l(fā)nc-PIM2-1∶1與內(nèi)吞途徑高度相關(guān)。血小板激活也在KEGG分析統(tǒng)計中被高度富集，血小板儲存損傷發(fā)生時，血小板首先發(fā)生激活，釋放出一系列炎癥因子，同時伴隨著血小板凋亡的發(fā)生，其生理功能和存活率顯著下降。KEGG分析表明lnc-FAM75A7-2∶5、lnc-MARCH6-2∶1、lnc-TMEM86B-2和lnc-TOMM22-1∶1在血小板激活中具有重要的意義，為進一步探究血小板儲存損傷機制提供了新的靶點[26]。cis調(diào)控分析得出lncRNA-mRNA可能的相互調(diào)節(jié)關(guān)系如下：lnc-USP39-1調(diào)控VAMP8的表達；lnc-TMEM86B-2調(diào)控GP6的表達；lnc-MAPK13-3調(diào)控MAPK14的表達；lnc-FOXS1-2調(diào)控BCL2L1的表達；lnc-CAPN2-1調(diào)控CAPN2的表達等等，這些調(diào)控關(guān)系與血小板的激活或凋亡有著密不可分的聯(lián)系[27-29]。研究顯示血小板lncRNA表達量隨著血小板儲存時間的延長而呈不同的變化趨勢，下調(diào)的lncRNA數(shù)量較多，且下調(diào)幅度更明顯，lncRNA的表達隨著血小板生理狀態(tài)的變化而改變，部分變化的lncRNA與血小板生理功能相關(guān)，并且在血小板儲存損傷中發(fā)揮作用[26]。

3 環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）circRNA是一類新的共價閉合單鏈RNA，通過特殊的選擇性剪切，由外顯子或內(nèi)含子衍生而來。circRNA的主要生物學(xué)功能有miRNA sponge、調(diào)控蛋白結(jié)合、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、編碼功能。由于沒有游離的ploy(A)末端，環(huán)狀RNA對RNA核酸外切酶和脫支酶存在一定的抗性，無論在細胞核中還是在細胞質(zhì)中都可穩(wěn)定存在[3]。

3.1 circRNA在體外儲存紅細胞中的表達及其在儲存損傷的作用：研究顯示有核細胞的circRNA豐度約占細胞總mRNA的2%～4%，在無核的血小板和紅細胞這一比例更高，已經(jīng)證實多個circRNA比人類紅細胞中的相對應(yīng)線性mRNA高出50到1 000倍。在造血系統(tǒng)中，通過RNA-seq分析鑒定出造血細胞表達的55 187個環(huán)狀RNA，數(shù)據(jù)顯示顯著的細胞類型特異性和非編碼轉(zhuǎn)錄本在造血過程中的潛在調(diào)控作用。在所有造血細胞中，血小板和紅細胞含有的circRNA數(shù)量最多，并且circRNA的類型和數(shù)量在成熟過程中發(fā)生變化[4，5]。紅細胞及血小板沒有細胞核，它們需要使用RNA來維持其功能，對環(huán)境因素作出反應(yīng)，或通過微囊泡向其他細胞傳遞信號[6，7]。紅細胞中circRNA豐度高，穩(wěn)定性好，可作為紅細胞儲存損傷的標(biāo)志物，此外，circRNA在紅細胞代謝和儲存病變中也起著重要調(diào)控作用。

早期我們通過高通量測序分析在儲存紅細胞中發(fā)現(xiàn)了2 586個已知的和6 216個新發(fā)現(xiàn)的circRNA，儲存紅細胞中存在100多種表達差異的circRNA，其中下調(diào)的circRNA數(shù)量較多，且下調(diào)幅度比升高幅度更大。mireap、miranda、targetscan和mirTarBase預(yù)測顯示有多個circRNA可靶向作用于miRNA和mRNA，如通過CirRNA-miRNA-mRNA分析得出：hsa_circ_00007470的兩個靶miRNA，即hsamiR-155-5p與hsa-miR-6827-5p的靶蛋白是MRP4。hsa_circ_00007470和其靶miRNA都起著調(diào)控MRP4的作用。hsa_circ_00007470或許能通過解除miRNA對MRP4的抑制作用通過ATP代謝改善紅細胞變形能力。生物信息學(xué)分析顯示這些變化的circRNA主要與泛素介導(dǎo)的蛋白水解、RNA降解、RNA轉(zhuǎn)運、cAMP信號通路、紅細胞粘著連接、TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、AMPK信號通路及細胞周期中凋亡通路等生理過程相關(guān)。我們研究顯示circRNA.0007127可能通過吸附miR-513a-5p，促進下游靶基因CASP8表達，進而調(diào)控紅細胞的細胞凋亡，這一過程類似于K-562氧化應(yīng)激反應(yīng)中的調(diào)控過程。在整個紅細胞儲存期，泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路一直為變化最為顯著，其余通路的名稱及排名隨儲存時間發(fā)生變化，說明circRNA的差異表達與紅細胞生理狀態(tài)改變有一定敏感性與相關(guān)性[30]。此外，JENNIFER F.DOSS等人分析發(fā)現(xiàn)miR-4732-3p可靶向作用于SMAD2和SMAD4，這兩種關(guān)鍵成分涉及TGF-β途徑與紅細胞生成有關(guān)[31]。

3.2 circRNA在體外儲存血小板中的表達及其在儲存損傷的作用：目前，關(guān)于circRNA在紅細胞儲存損傷中的研究尚處于早期階段。MASS等人研究顯示在儲存血小板中有3 324個circRNA表達。血小板雖然缺乏細胞核，但與其他組織相比，血小板中含有更多circRNA的表達。如在ACVR2A和SMARCA5中circRNA的表達顯著高于mRNA。circRNA在磷酸二酯酶PDE3A、PDE4D和PDE5A中表達也得到了驗證，PDEs可水解cAMP和cGMP，控制血管舒張、心臟收縮和抑制血小板聚集[32]。此外，血小板還可將胞漿中circRNA血小板囊泡（微囊泡和外泌體）釋放到體外發(fā)揮作用[33]。

4 其他非編碼RNA 紅細胞和血小板中除含有大量的miRNA、lncRNA及circRNA外，亦含有部分siRNA及PiRNA。SiRNA是一類雙鏈RNA分子，長度為20～5個堿基對，它可干擾表達與其互補的核苷酸序列的mRNA，從而防止翻譯，目前體外過表達的siRNA常用于各種分子生物學(xué)實驗，但是目前仍未見有內(nèi)源性siRNA在體外儲存紅細胞及血小板中相關(guān)作用的報道[7-10]。PiRNA是一類含有24～31個核苷酸殘基的非編碼RNA，可通過結(jié)合argonaute蛋白的PIWI亞家族發(fā)揮作用，具有維持基因組穩(wěn)定以及調(diào)節(jié)表觀遺傳學(xué)、生殖干細胞分化、胚胎發(fā)育等功能，但目前尚未見有在體外儲存紅細胞及血小板中作用的相關(guān)報道[7-10]。

5 展望 通過對ncRNA功能的闡述，使我們明確非編碼RNA調(diào)控血細胞存儲損傷中的重要作用，同時，也揭示了非編碼RNAs很可能成為血細胞儲存期間的重要調(diào)節(jié)因子。對ncRNAs的功能以及它們之間、它們和mRNA及DNA之間的相互作用的研究，有利于進一步明確ncRNA在血細胞存儲過程中調(diào)控機制，提高血細胞體外儲存的質(zhì)量，延長體外儲存時間，進而改善患者輸血療效。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突