李天芝，于新友，霍 芳，李 峰

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea,PEDV）屬冠狀病毒科冠狀病毒屬[1]，病毒粒子呈球形，有囊膜，表面有纖突，大小約95～190 nm。PEDV的唯一宿主是豬，可引起豬急性腸道傳染病豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea viruse, PED），豬不分品種和日齡均可感染發(fā)病，臨床表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉、脫水[2]。該病發(fā)病急，傳播速度快，哺乳仔豬發(fā)病后死亡率高，7日齡內(nèi)仔豬死亡率可達100%。現(xiàn)有商品化疫苗雖能減輕臨床癥狀，但不能阻止病毒感染，已發(fā)病豬場短時間內(nèi)可反復發(fā)病。PED于1971年首次暴發(fā)于英格蘭，目前在世界主要養(yǎng)豬國家均有發(fā)病和流行，是危害豬業(yè)的一種重要疾病。我國于1976年首次報道豬流行性腹瀉病例的存在，通常呈散發(fā)流行，危害相對較輕，自2010年開始PED在我國大規(guī)模暴發(fā)[3]，PEDV持續(xù)不斷的變異，由G1型毒株轉(zhuǎn)變?yōu)橐訥2型毒株流行為主，病毒致病力增強，至今一直未得到有效控制[4]。

引起豬腹瀉的因素眾多，有細菌性腹瀉、病毒性腹瀉、寄生蟲性腹瀉，以及飼養(yǎng)管理不善導致的腹瀉。豬腹瀉后快速查找病因，并采取相應的措施，是進行有效防控的前提和基礎(chǔ)。豬流行性腹瀉在豬場發(fā)病率高，造成的損失嚴重，且與豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒病等在臨床表現(xiàn)和病理變化上很難區(qū)分，早期檢測確診后，采取相應措施可有效減少豬場損失。確診方法為采用針對病原的快速檢測法，傳統(tǒng)的病原分離法不能滿足疾病快速確診的需求。隨著技術(shù)的發(fā)展和科技的進步，針對PEDV病原的新型檢測方法不斷出現(xiàn)，文章綜述了針對PEDV新型檢測方法研究進展，以期為該病的診斷和防控提供參考。

1 常規(guī)RT-PCR法

RT-PCR法是以病毒的RNA為模板進行擴增反應來檢測病毒核酸的方法，其特異性好，已經(jīng)廣泛應用于各種動物疾病診斷中。王若木等[5]基于PEDV的S基因和E基因序列，分別設(shè)計了PEDV的分型和鑒別引物，經(jīng)過反應條件優(yōu)化，成功建立了鑒別PEDV G1/G2型感染的雙重RT-PCR方法；其中，PEDV G1型感染可擴增得到1條249 bp的目的片段，G2型感染擴增得到2條目的片段（840 bp和249 bp）。趙攀登等[6]根據(jù)GenBank中PEDV變異毒株和傳統(tǒng)毒株S基因序列，設(shè)計兩對特異性引物，進行反應條件優(yōu)化。結(jié)果顯示，建立的RT-PCR鑒別診斷方法能夠特異性區(qū)分PEDV變異毒株和傳統(tǒng)毒株，能擴增出變異毒株442 bp的目的片段，而傳統(tǒng)毒株是270 bp的目的片段，并且與TGEV（傳染性胃腸炎）、PRV（豬偽狂犬病病毒）、PRRSV（藍耳病病毒）、PPV（細小病毒）、CSFV（豬瘟病毒）等均無交叉反應；敏感性結(jié)果表明，該方法能檢測出變異毒株和傳統(tǒng)毒株的底限均為4×104拷貝/μL。

2 多重RT-PCR法

多重RT-PCR法是在一個體系中加入多對引物，優(yōu)化反應條件后可同時實現(xiàn)多種病原篩查，具有快速、靈敏度高、高效等優(yōu)點，廣泛用于臨床疾病的快速診斷。丁慶文等[7]參照GenBank中登錄的PEDV M基因、PDCoV（豬丁型冠狀病毒）N基因和PSV 2C基因的保守序列，設(shè)計3對引物，經(jīng)反應條件優(yōu)化，建立了能同時檢測PDCoV、PEDV和PSV（豬薩佩羅病毒）的多重RT-PCR方法。結(jié)果顯示，該方法除了對PDCoV、PEDV和PSV有特異性擴增外，對PRV、PCV2（圓環(huán)病毒2型）、PBoV（豬博卡病毒）、CSFV、PRRSV等豬常見病毒的擴增結(jié)果均為陰性，特異性較強；建立的多重RT-PCR方法對3種質(zhì)粒標準品的最低檢測限分別為1.40×102拷貝/μL（PDCoV）、1.53×102拷貝/μL（PEDV）、1.57×103拷貝/μL（PSV）；而以3種質(zhì)粒標準品為模板的各單一PCR對PDCoV、PEDV和PSV的最低檢測限分別為1.40×102拷貝/μL、1.53×102拷貝/μL、1.57×102拷貝/μL。以PDCoV、PSV病毒核酸及PEDV陽性病料的cDNA為模板，不同時間重復檢測3次，檢測結(jié)果均一致，表明該方法重復性較好。曾秀秀等[8]設(shè)計3對特異性引物，建立PEDV、PDCoV和SADS-CoV（豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒）的三重RT-PCR方法。結(jié)果表明，采用建立的三重RT-PCR方法對PEDV、PDCoV和SADS-CoV進行擴增，分別擴增出大小約為486 bp、329 bp和628 bp的特異性片段；該方法對CSFV、TGEV和PRRSV不能擴增出任何片段，特異性好；對PDCoV、PEDV和SADS-CoV的最低檢測量分別為1×106拷貝/μL、1×103拷貝/μL、1×104拷貝/μL，具有較高的敏感性。劉瑩等[9]根據(jù)GenBank中登錄的PDCoV M基因和PEDV M基因設(shè)計了2對引物，通過對PCR反應條件的優(yōu)化，建立了檢測PDCoV和PEDV的雙重RT-PCR檢測方法。特異性和敏感度的試驗表明，此方法對PDCoV和PEDV核酸的最低檢測量分別為3.27×103拷貝/μL和3.63×104拷貝/μL，敏感度較高；該方法可同時擴增出340 bp（PDCoV）和520 bp（PEDV），但不能擴增出TGEV、PRV、PBoV和PRRSV的對應條帶。

3 納米PCR方法

納米PCR方法是將納米金粒子添加于PCR反應體系中的一種新技術(shù)，可提高酶的活性和穩(wěn)定性，提升反應效率，減少非特異性擴增，提高PCR反應特異性，縮短反應時間，使檢測更加準確、可靠[10]。付琦媛等[11]參照GenBank中PEDV經(jīng)典株CV777和變異株CH-HB1-2018的S基因序列，設(shè)計了3條特異性引物，并以納米金顆粒作為熱導介子，優(yōu)化PCR反應條件，建立了能夠區(qū)分PEDV經(jīng)典株和變異株的雙重納米RT-PCR檢測方法。利用該方法同時檢測PEDV經(jīng)典株和變異株、PRV、PCV2和PCV3（圓環(huán)病毒3型）、PRRSV和PDCoV，結(jié)果顯示，該方法能特異性鑒別PEDV經(jīng)典株（747 bp）和變異株（442 bp），且與其他病原均無交叉反應，特異性較強；將重組質(zhì)粒標準品10倍倍比稀釋后分別利用該方法和普通RT-PCR同時檢測，結(jié)果顯示，所建立的雙重納米RT-PCR方法能檢測出經(jīng)典株CV777和變異株CH-HB1-2018重組質(zhì)粒標準品的下限分別為5.68×102拷貝/μL和4.93×102拷貝/μL，其敏感性較普通RT-PCR的敏感性高100倍。

4 熒光RT-PCR方法

熒光RT-PCR是在常規(guī)RT-PCR技術(shù)上發(fā)展的一種病原核酸檢測技術(shù)，具有靈敏、快速、特異等優(yōu)點，可直接觀察擴增結(jié)果，不需要后續(xù)電泳檢測產(chǎn)物，降低了實驗室氣溶膠污染概率，避免了假陽性結(jié)果，可以分為染料法和探針法兩種。王以欣等[12]以PEDV的N基因為靶基因，基于雙啟動寡核苷酸引物（DPO），經(jīng)過條件優(yōu)化，建立了檢測PEDV的熒光RT-PCR方法。結(jié)果顯示，DPO引物的有效退火溫度范圍較寬（45～65 ℃）；在測試的10種病毒中僅PEDV為陽性擴增結(jié)果，其余病毒為陰性結(jié)果，特異性較強；對PEDV質(zhì)粒標準品的檢測限可達1.64×101拷貝/μL，敏感性較高；組內(nèi)、組間重復性結(jié)果的變異系數(shù)均小于1%，重復性較好。南沛等[13]設(shè)計了一對特異性引物，建立了PEDV EvaGreen熒光PCR檢測方法，對其特異性、靈敏度和重復性進行分析。結(jié)果表明，該熒光定量PCR可以特異性地檢測PEDV，對其他非靶標病毒無交叉反應，最低檢測限為5 拷貝/ μL；使用3個不同濃度的標準品進行批內(nèi)和批間重復，Ct值的變異系數(shù)在2.8% 以下，表明該方法重復性好。冉偉等[14]建立了基于PEDV ORF3基因的SYBR Green I熒光RT-PCR檢測方法。結(jié)果顯示，以重組質(zhì)粒標準品構(gòu)建的標準曲線的相關(guān)系數(shù)為0.998 2，Ct值與質(zhì)粒標準品在102～1010拷貝/μL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。該方法除對PEDV檢測結(jié)果為陽性外，對TGEV、PoRV、PDCoV、PCV3和PRRSV核酸擴增結(jié)果均為陰性，特異性強；該方法對重組質(zhì)粒標準品的檢測下限為102拷貝/μL，比普通RT-PCR靈敏100倍，敏感性高；批內(nèi)和批間重復試驗的變異系數(shù)均小于5%，重復性好。許夢怡等[15]根據(jù)TGEV的M基因、PEDV的M基因和PoRV的VP2基因序列，分別設(shè)計引物和探針，經(jīng)過進一步的條件優(yōu)化，建立了檢測TGEV、PEDV、PoRV的三重實時熒光定量PCR方法，該方法對TGEV、PEDV、PoRV的檢測靈敏度分別為2.49拷貝/μL、4.36拷貝/μL、4.96拷貝/μL，TGEV、PEDV、PoRV的組內(nèi)重復試驗的CV（變異系數(shù)）最大值分別為2.5% 、3.8% 、4.3%，組間重復性試驗的CV最大值分別為3.7% 、3.4% 、3.2%，均不超過5%，表明建立的方法重復性好；用此方法對PRV、PCV1（圓環(huán)病毒1型）、PRRSV樣本進行檢測，均沒有交叉反應，表明該方法特異性好。于新友等[16]根據(jù)GenBank中已登錄的PRRSV ORF7基因和PEDV N基因序列，設(shè)計2對特異性引物和2條TaqMan探針，通過優(yōu)化擴增條件建立檢測PRRSV和PEDV的雙重TaqMan熒光定量RT-PCR方法。結(jié)果表明，最終確立的20 μL擴增體系中各引物和探針的加樣量分別為：PRRSV-F 0.8 μL，PRRSV-R 0.6 μL，PRRSV-P 0.5 μL；PEDV-F 1.2 μL，PEDV-R 1.0 μL，PEDV-P 0.7 μL。擴增程序為：50 ℃反轉(zhuǎn)錄6 min；95 ℃預變性1 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸1 0 s，共4 0個循環(huán)。檢測P R R S V和PEDV的敏感性可分別達到1.05 TCID50/100 μL和3.16 TCID50/100 μL，該方法特異性好，不與其他常見豬病病原體發(fā)生交叉反應，批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均不高于2.0%。劉如月等[17]根據(jù)GenBank中的PEDV M基因及PDCoV N基因設(shè)計了兩對特異性引物和探針，建立了PEDV和PDCoV的雙重TaqMan qRT-PCR方法，該方法特異性強，與PCV2、PCV3、PRV、PRRSV、TGEV、PBoV及CSFV均無交叉反應；敏感性試驗結(jié)果顯示，建立的單一與雙重熒光定量PCR對PEDV及PDCoV的質(zhì)粒標準品檢測下限分別為4.7×101拷貝/μL和3.17×101拷貝/μL，敏感性高；對該檢測方法的重復性進行驗證，結(jié)果顯示，該方法組內(nèi)和組間的變異系數(shù)均小于3%，重復性好。

5 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導等溫擴增（LAMP）方法是由日本學者Notomi等發(fā)明的一種新型的恒溫核酸擴增技術(shù)，一臺水浴鍋或恒溫箱就能實現(xiàn)反應，結(jié)果可通過肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成來判斷，簡便快捷，具有靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點。吳迪等[18]針對PEDV的M基因編碼區(qū)序列，分別設(shè)計合成3組引物，通過對引物的篩選和反應條件優(yōu)化，建立了PEDV RT-LAMP可視化快速檢測方法。靈敏度和特異性試驗結(jié)果顯示，該方法在65 ℃ 45 min對PEDV的檢測靈敏度為2 拷貝/μL，與TGEV、PoRV、CSFV、PRV、PRRSV均無交叉反應。狄亞心等[19]根據(jù)PEDV N基因設(shè)計引物，優(yōu)化并建立了基于RT-LAMP的PEDV快速檢測方法。結(jié)果顯示，該方法的最佳反應條件：反應溫度為61 ℃，反應時間為50 min，Mg2+（鎂離子）和dNTPs濃度分別為8.0 mmol/L和4.0 mmol/L，外引物和內(nèi)引物最佳濃度比為1∶4。特異性試驗結(jié)果顯示，該方法只能檢測出PEDV，對其他病原檢測均為陰性，具有良好的特異性；敏感性試驗結(jié)果顯示，該法能檢測出的最低RNA濃度為6.52×10-5mg/L，而常規(guī)RT-PCR能檢測到最低濃度為6.52×10-3mg/L，表明RT-LAMP敏感性是RT-PCR的100倍；重復性試驗結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間重復性試驗結(jié)果無明顯差異，重復性較好。

6 重組聚合酶擴增技術(shù)

重組聚合酶擴增（recombinase polymerise amplification, RPA）技術(shù)是2006年由英國TwistDx Inc公司研發(fā)的一種新病原核酸恒溫檢測技術(shù)，主要在25～42 ℃等溫條件下，采用3種酶實現(xiàn)核酸快速大量擴增，短時間內(nèi)實現(xiàn)靶基因指數(shù)擴增，不需要昂貴的儀器設(shè)備，能滿足疫病快速現(xiàn)場檢測的需求。呂繼洲等[20]基于PEDV病毒M基因保守序列，設(shè)計一系列擴增引物及其熒光探針，建立了一種PEDV實時熒光RPA等溫檢測方法，測定了方法的特異性與敏感性。結(jié)果表明，該實時熒光RPA方法可在39 ℃恒溫反應20 min特異性擴增PED病毒M基因，與TGEV、PRRSV、PCV2、CSFV等對照病毒無交叉反應，其檢測限為10拷貝/μL。

7 膠體金檢測法

膠體金法原理是利用膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團牢固結(jié)合，而不影響蛋白質(zhì)的生物特性。具有操作簡便、穩(wěn)定性好、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點，適合基層臨床一線疾病快速確診應用。張艷萍等[21]用膠體金標記抗PEDV單克隆抗體B1，摸索與優(yōu)化標記條件并制備成金墊；將抗PEDV的單克隆抗體B2和羊抗鼠IgG多克隆抗體噴在硝酸纖維素膜上，優(yōu)化確定最佳包被濃度，組裝成試紙條并做成帶有樣本采集部件的檢測卡。結(jié)果表明，PEDV快速檢測卡可檢測最低病毒含量為100 TCID50/mL；臨床檢測腹瀉豬糞便樣本，與PCR試劑盒結(jié)果對比，檢測卡靈敏度為94.7%，特異性為100%。

8 基因芯片技術(shù)

基因芯片檢測技術(shù)原理是將大量探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。胡靖飛等[22]根據(jù)PEDV的S、M基因、TGEV的S、N基因、PRoV A的VP7、NSP4基因與PDCoV的M、N基因設(shè)計8對特異性引物，再根據(jù)每對引物擴增基因的保守區(qū)域設(shè)計寡核苷酸探針，并用Cy-3熒光直接標記下游引物5'端進行多重PCR擴增標記樣品。研究確定最佳制備和反應參數(shù)：100 μmol/L探針原液與點樣緩沖液比例為1∶2，水合處理10 h，雜交溫度為42 ℃，雜交時間為120 min，以信噪比值≥2或信號值＞1 300判為陽性。該芯片靈敏性試驗表明最低檢測量為106拷貝/μL，特異性試驗表明對非目標病原無交叉反應，保存期試驗表明制備的芯片置于4 ℃下可保存至少60 d。

9 小結(jié)

豬病毒性腹瀉是豬場常見的嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的一類疫病，可導致仔豬大量死亡，其中PED發(fā)病率最高，危害最嚴重，且同其他病毒引起腹瀉癥狀和病變類似，臨床上很難鑒別，需借助實驗室方法檢測確診。傳統(tǒng)的病毒分離等方法不能滿足臨床疾病快速確診需求，而抗體檢測法不能判定疾病現(xiàn)癥感染。隨著技術(shù)的不斷進步越來越多病原快速檢測法被研制，并應用于臨床疾病檢測，主要是針對病原核酸的，還有直接針對病毒的，包括RT-PCR方法、熒光RT-PCR方法、環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）、重組聚合酶擴增技術(shù)（RPA）、膠體金檢測法、基因芯片技術(shù)等。這些檢測方法均有各自不同特點，常規(guī)RT-PCR法雖然特異性強，但檢測速度慢，操作繁瑣，反應結(jié)束后需要電泳檢測，且敏感性不高。熒光RT-PCR法雖克服了常規(guī)RT-PCR的部分缺陷，但儀器昂貴，需合成探針，增加檢測成本，不適合基層應用。LAMP方法雖然簡單、方便，適合基層進行推廣應用，但靈敏度太高，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。RPA方法雖不需要復雜的儀器和設(shè)備，操作簡便，但試劑昂貴。膠體金方法雖檢測速度快，但檢測敏感性低，容易漏檢，市場上產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。基因芯片檢測技術(shù)鑒于成本和技術(shù)原因，尚不能廣泛應用于臨床。不同養(yǎng)殖場及實驗室應根據(jù)自身不同情況選擇適合自己的方法。隨著技術(shù)的進一步發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了病原免核酸提取直擴PCR技術(shù)、便攜式熒光PCR儀器及除模板外PCR組分凍干保存技術(shù)，如能應用于PEDV分子檢測，必將開發(fā)出更多方便、快捷、成本更低的病毒檢測技術(shù)，方便疾病確診，從而更好地進行PEDV的防控工作。

影響檢測結(jié)果的因素眾多，除了檢測方法，所選擇及采集的病料樣本也很關(guān)鍵，要在合適的時機，采集典型病料豬及新死亡豬病料樣本，盡可能多采集幾份，病料要新鮮防止腐敗變質(zhì)，并及時送檢，PED不同時期糞便中病毒含量不同。一旦確診后同豬群其他健康豬可緊急接種疫苗，同時加強飼養(yǎng)管理，改善豬只所處環(huán)境，提升環(huán)境溫度，降低舍內(nèi)氨氣濃度，加強環(huán)境消毒和豬場生物安全管控。病死豬嚴格無害化處理，防止病原在場內(nèi)大規(guī)模擴散。