翟玉紅 楊 俊 楊 簡 張 靜 李 奇 鄭 濤 范致星

(三峽大學 第一臨床醫(yī)學院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 心血管內(nèi)科 & 三峽大學 心血管病研究所， 湖北 宜昌 443003)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是目前人類死亡和致殘的主要原因，及時行再灌注治療(如經(jīng)皮冠狀動脈介入治療、冠狀動脈旁路移植術和早期溶栓等)是挽救AMI患者最有效的方法。但是，再灌注治療的同時常伴隨心肌頓抑、再灌注心律失常、微血管功能障礙等一系列心臟相關不良事件發(fā)生，造成心肌損傷進一步加重，這一現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1]。外泌體是細胞內(nèi)多囊體與質膜融合后釋放至細胞外的囊泡樣小體，具有獨特的生物學特性，通過轉運miRNAs、circRNAs、mRNAs、DNAs和脂質等生物分子成為細胞間通訊的重要介質[2]。新近研究發(fā)現(xiàn)，心血管病患者外泌體miRNAs差異性表達可操控多種基因的轉錄和翻譯，干預炎癥反應、細胞增殖、凋亡等病理生理過程，逐漸成為心血管疾病治療的關鍵靶點[3]。本文就外泌體源性miRNAs在MIRI發(fā)病機制中的研究進展進行歸納總結。

1 外泌體miRNAs

1.1 外泌體miRNAs的結構及功能

外泌體是直徑為30～150 nm，由各種類型的真核細胞釋放到血液、腦脊液、唾液、膽汁等細胞外液中的杯狀脂質雙層膜泡，通過傳遞蛋白質、糖、脂類、mRNAs、miRNAs和lncRNAs形成巨大的通訊網(wǎng)絡，參與包括發(fā)育、免疫、組織穩(wěn)態(tài)、腫瘤和神經(jīng)退行性疾病的調(diào)節(jié)[4]。深入研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中含有大量miRNAs，其中異質性胞核核糖核蛋白A2B1和KRAS基因在外泌體選擇性富集miRNs的過程中發(fā)揮關鍵作用[5]。外泌體miRNAs是一類內(nèi)生的、長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNAs，是調(diào)控基因轉錄后的主要因子，在外泌體介導的細胞間通訊中有著十分重要的意義[6]。外泌體通過質膜融合、細胞胞飲以及特異性受體依賴途徑將miRNAs轉運、釋放至靶細胞，隨后miRNAs以完全或不完全配對方式結合至靶mRNAs的3’非編碼區(qū)和/或5’非編碼區(qū)及開放閱讀框參與調(diào)節(jié)基因表達，其中，由2～7個核苷酸組成“miRNA種子序列”是影響功能靶點的重要因素[7, 8]。外泌體miRNAs的主要功能是參與靶基因水平的負向調(diào)控，單個miRNA可以調(diào)節(jié)多個靶基因位點，同時單個mRNA也可被多個miRNAs調(diào)控。如果miRNAs與靶mRNAs完全匹配，導致靶mRNAs降解；反之，則會抑制靶基因翻譯[9]。此外，部分外泌體miRNAs還具有與toll樣受體結合，激活免疫細胞的能力[10]。

1.2 外泌體miRNAs的生物學特性

外泌體的磷脂雙分子膜結構使外泌體miRNAs在細胞外液中高度穩(wěn)定且易于檢測，將外泌體置于4℃儲存96 h或在-70℃儲存1個月后，外泌體miRNAs的表達譜仍未發(fā)生明顯的改變[11]。外泌體廣泛參與器官/組織間信號通路交叉串擾，其中miRNAs的表達水平與細胞功能紊亂密切相關。由于泛素、轉運必需內(nèi)體分選復合物、Y-box蛋白27等調(diào)節(jié)蛋白的存在，患者和正常個體中的外泌體miRNAs含量存在顯著差異[12, 13]。當機體受到損傷時，組織中特異性外泌體miRNAs釋放入外周血循環(huán)，致使血漿中miRNAs的表達譜發(fā)生改變。值得注意的是，其變化常出現(xiàn)在某些疾病的早期階段，相比常規(guī)檢查具有更高的敏感性和特異性，并且這些miRNAs可通過多種機制改變靶細胞的活性，發(fā)揮生物學效應[14]。富集血漿外泌體進行分離和鑒定發(fā)現(xiàn)，AMI后大量miRNAs的表達水平升高；其中miR-21、miR-26和miR-328主要參與心臟重構；心肌細胞特異性外泌體miR-208a則隨細胞凋亡程度發(fā)生動態(tài)改變[15]。Pan等[16]在研究肥胖癥小鼠體內(nèi)脂肪細胞炎癥反應和胰島素抵抗的分子機制時，發(fā)現(xiàn)脂肪細胞分泌的外泌體miR-34a以旁分泌的方式進入巨噬細胞，靶向調(diào)節(jié)KLF4轉錄，抑制M2巨噬細胞極化，從而成為調(diào)控炎癥反應的重要介質。同時，胰腺β細胞來源的外泌體miR-15a可直接與視網(wǎng)膜細胞Akt3基因的3’非編碼區(qū)結合，通過抑制PI3K途徑減少細胞中活性氧的積累[17]。小膠質細胞來源的外泌體miR-124-3p是靶向下調(diào)FIP200介導的細胞自噬，減輕創(chuàng)傷性腦損傷的重要靶點[18]。因此，外泌體miRNAs通過不同路徑參與疾病的發(fā)生發(fā)展，可能在MIRI病變中起到重要的作用。

2 外泌體miRNAs在MIRI中的研究

近年來，大量研究表明，外泌體miRNAs通過自分泌、旁分泌、遠距分泌的方式，參與調(diào)控MIRI過程中凋亡、炎癥、自噬、氧化應激、線粒體功能障礙等多種病理反應，發(fā)揮積極的保護作用，成為心血管領域研究的重點[19, 20]。

2.1 外泌體miRNAs與細胞死亡

自噬和凋亡是缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)誘導損傷細胞死亡的主要途徑，并在心臟損傷病理演變過程中占有重要地位。減少I/R誘導的心肌細胞死亡和心功能障礙是改善MIRI的有效方法[21]。運動訓練是降低心臟疾病風險、提供心血管保護的有利因素。Hou等[22]鑒定出運動訓練衍生的血漿外泌體中部分miRNAs的表達上調(diào)，隨后在缺氧復氧(hypoxia reoxygenation，H/R)模型中評估這部分miRNAs對心肌細胞功能的影響，發(fā)現(xiàn)miR-342-5p可以顯著降低caspase9和JNK2蛋白水平，抑制LDH的釋放，從而減少心肌細胞凋亡，增加細胞活力。Chen等[23]研究表明，當發(fā)生MIRI時，缺氧誘導因子-1α促進心肌細胞釋放大量外泌體miR-30a，通過抑制自噬相關蛋白Beclin-1和Atg12的活性來減少心肌細胞死亡。然而，Xu等[24]使用外泌體miR-30a抑制劑處理I/R大鼠時發(fā)現(xiàn)，miR-30a抑制劑能顯著降低ULK1和Beclin-1的蛋白水平，通過減少自噬抑制心肌凋亡。上述研究提示，外泌體miRNAs的來源可能是影響缺血再灌注損傷的重要因素。

研究表明，成人心肌細胞的增殖和自我修復能力有限，干細胞移植治療成為心臟修復和再生的新趨勢[25]。干細胞來源的外泌體作為細胞間信息交流的載體，具有低免疫原性、高穩(wěn)定性和良好的生物相容性，且外泌體攜帶的miRNAs可直接到達心臟表面，發(fā)揮保護作用，成為干細胞治療MIRI的重要方式[26, 27]。Wang等[28]將誘導多能干細胞來源的外泌體通過心肌注射的方式遞送至AMI小鼠的局部缺血區(qū)域，隨后再灌注24 h，發(fā)現(xiàn)心肌細胞高度富集外泌體源心肌保護性miR-21和miR-210，從而表現(xiàn)出低caspase3活性。同時，Li等[29]發(fā)現(xiàn)骨髓間充質干細胞來源的外泌體富含miR-29c，將外泌體通過心尖注射處理I/R大鼠，發(fā)現(xiàn)外泌體miR-29c通過抑制PTEN基因表達和激活AKT/mTOR信號通路，降低過度自噬導致的再灌注心肌損傷。

2.2 外泌體miRNAs與炎癥反應

炎癥反應對延緩疾病發(fā)展具有重要意義，巨噬細胞極化在I/R組織炎癥損傷和修復進程中扮演重要角色[30]。Dai等[31]發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞來源的外泌體能提高H/R乳鼠心肌細胞存活率，維持細胞膜的完整性。同時，微陣列分析提示M2型巨噬細胞外泌體是導致乳鼠心肌細胞miR-148a表達水平升高的主要原因，miR-148a可下調(diào)硫氧還蛋白互作蛋白表達，干預TLR4/NF-κB信號通路，進而抑制NLRP3炎癥小體激活。Wei等[32]利用miR-181a的免疫抑制效應和干細胞源性外泌體與細胞靶向結合的能力，將過表達miRNA-181a的間充質干細胞源性外泌體注射到I/R小鼠的心肌組織，發(fā)現(xiàn)miRNA-181a可下調(diào)c-Fos蛋白水平，限制樹突狀細胞遷移，促進外周血單個核細胞Treg極化，減輕MIRI炎癥反應。

2.3 外泌體miRNAs與氧化應激

氧化應激與miRNAs之間的相互作用是維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要方式，同時，這種復雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡在I/R中也發(fā)揮著重要作用。已有研究報道，miR-150和miR-21參與調(diào)控氧化應激介導的MIRI[33]。缺血預處理導致血漿中外泌體miR-21表達水平明顯上升，Wen等[34]發(fā)現(xiàn)外泌體miR-21可顯著減少過氧化氫處理的H9C2細胞凋亡和大鼠MIRI，由此證明外泌體miR-21參與心肌I/R過程中的氧化應激反應。Wang等[35]分別在過氧化氫和氯化鈷誘導的H9C2細胞急性H/R模型中發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-126與 ErbB受體反饋抑制物1靶向結合，減少心肌細胞內(nèi)活性氧的積累，通過清除氧自由基和穩(wěn)定線粒體膜電位來抑制心肌細胞氧化應激。

2.4 外泌體miRNAs的其他作用機制

多種機制貫穿MIRI的全過程，外泌體miRNAs傳遞信息的同時也參與了組織修復、心室重塑和血管生成的調(diào)節(jié)。其中血管的快速再生是延長受損心肌存活的關鍵。在健康志愿者和缺血性心臟病患者血漿外泌體miRNAs調(diào)控內(nèi)皮細胞功能的研究中，Li等[36]發(fā)現(xiàn)缺血誘導的血漿外泌體miR-939-5p下調(diào)，可減輕對iNOS活性和內(nèi)皮NO產(chǎn)生的抑制，最終促進血管新生。應用大鼠I/R模型，結合主成分分析算法和偏最小二乘回歸方法評估嬰幼兒心臟祖細胞外泌體miRNAs的作用，結果顯示心臟祖細胞外泌體中miR-29c、miR-96、miR-182和miR-185參與改善梗死區(qū)域周邊心肌肥大及心肌纖維化程度，miR-27a可促進血管再生，miR -138和miR-25則參與減少心肌細胞凋亡[37]。Emanueli等[38]發(fā)現(xiàn)，接受冠狀動脈旁路移植術的急性心?；颊?，心臟會釋放大量外泌體miR-210，miR-133a/b至血液循環(huán)，觸發(fā)組織適應性修復。

3 展望和總結

外泌體miRNAs在心血管領域具有廣泛的應用前景，干細胞是其主要的來源之一。同時，研究表明，高通量電刺激預處理干細胞是一種優(yōu)化外泌體miRNAs心臟修復功能的有效方式[39]。人工體外合成外泌體miRNAs也是一種治療缺血性心臟疾病的有效策略。miR-322的靶基因CULLIN2可負調(diào)控HIF-1α的表達，發(fā)揮促血管生成作用[40]。Youn等[41]通過電穿孔將miR-322載入心臟祖細胞源性外泌體中，用于治療AMI的小鼠，發(fā)現(xiàn)外泌體miR-322可顯著縮小梗死面積，促進梗死邊緣區(qū)域血管新生。但是，如何個體化選擇需要修飾的miRNA，提高外泌體轉運效率、明確外泌體miRNAs的含量與療效之間的關系、以及降低治療的副作用等都是我們需要考慮的問題?？傊?，隨著研究的不斷深入，體外編輯或干預外泌體miRNAs的技術有望取得重大突破，為治療MIRI提供新方法。

外泌體作為細胞間信息交流的信使，通過轉運miRNAs調(diào)節(jié)MIRI發(fā)展過程中炎癥、自噬、凋亡、氧化應激等病理反應。但是，目前我們對外泌體miRNAs干預MIRI發(fā)病機制的認識有限，外泌體miRNA的提取、純化、修飾、人工處理以及檢測等技術仍有待提升，相關臨床實驗還需進一步完善。因此，外泌體miRNAs在MIRI的研究應用仍有待更深入的探索。