陳 明 孫 哲 王思斯 王文萍 黃重銘 彭慧婷 林曉彤 曹 洋

1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東廣州 510405

根據世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構發(fā)布的2020 年全球最新癌癥負擔數據，肺癌新發(fā)病例高達220 萬例，死亡病例180 萬例，死亡率居惡性腫瘤之首，是癌癥死亡的主要原因[1]。非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌的85%，是肺癌中最常見的病理類型[2]。既往我國晚期NSCLC 的5 年生存率僅5%左右[3]。中藥復方金福安湯是國醫(yī)大師鄧鐵濤教授治療肺癌的經驗方，由生半夏、生南星、丹參、桃仁、壁虎、山慈菇、浙貝母、葦莖、薏苡仁、太子參組成，具有化痰祛瘀的功效[4]。既往研究顯示，金福安湯聯合化療治療中晚期NSCLC 具有穩(wěn)定瘤體、緩解臨床癥狀、改善生存質量、減少化療不良反應等作用[4-6]。然而，由于中藥復方的復雜性，目前對金福安湯的有效成分及其作用機制尚不十分清楚。該研究基于網絡藥理學與分子對接技術[7-8]，建立了“藥物-靶點-通路-疾病”網絡，以期篩選出金福安湯活性成分，探索金福安湯治療NSCLC 的作用機制。

1 資料與方法

1.1 金福安湯化合物的篩選

金福安湯中每一味中藥的有效成分的數據都通過兩種方式收集：①文獻，主要在美國國立醫(yī)學圖書館（National Library of Medicine，PubMed）和中國知網（China National Knowledge Infrastructure，CNKI）中檢索，檢索時間為1980 年1 月至2021 年1 月；②中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）[9]，結合兩個重要的藥動學參數，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18[10-11]。

1.2 金福安湯靶點的預測

從PubChem 數據庫中收集化合物的典范簡化分子線形結構（canonical SMILE）或2D、3D 結構，導入SwissTargetPrediction 數據庫，選擇物種“智人”進行靶點預測。

1.3 NSCLC 疾病靶點的獲取

使用關鍵詞“non-smallcelllungcancer”在GeneCards數據庫和OMIM 數據庫中搜索，將搜索到的靶點匯總再刪除重復數據后得到NSCLC 疾病靶點。

1.4 NSCLC 與金福安湯的共同靶點

將NSCLC 與金福安湯的靶點上傳至Venny 2.1.0網站，得到靶點的交集，并用Venn 圖表示。選擇這些共同靶點作為金福安湯治療NSCLC 的潛在作用靶點。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用（proteinprotein interaction，PPI）分析

將共同靶點上傳至STRING 數據庫，選擇物種“智人”，置信度0.7，得到蛋白質互作網絡。STRING 數據庫自定義的置信度區(qū)間為：低為[0.15，0.4）；中為[0.4，0.7）；高為[0.7，0.9）；最高為[0.9，1]。

1.6 共同靶點通路分析

通過David 數據庫中的KEGG 對共同靶點進行通路富集分析。借助omicshare 網站繪制KEGG 通路高級氣泡圖。

1.7 可視化網絡的構建

使用Cytoscape 軟件進行可視化網絡的構建：①“中藥-化合物-共同靶點”網絡；②“中藥-化合物-核心靶點-核心通路”網絡。核心靶點、核心化合物、核心通路通過拓撲分析篩選，拓撲分析主要應用Network-Analyzer 模塊計算，只有度值、中介中心性和接近中心性＞相應平均值的節(jié)點才被納入[12]。

1.8 核心靶點的分子對接

運用PyRx-Virtual Screen Tool 軟件將核心靶點與金福安湯核心化合物進行分子對接。該分子對接的評價標準為：-7 kcal/mol≤對接結合能＜-5 kcal/mol，表明靶點與化合物具有一定的結合親和力；-9 kcal/mol≤對接結合能＜-7 kcal/mol，結合親和力良好；對接結合能＜-9 kcal/mol，結合親和力較強[13]。

2 結果

2.1 金福安湯活性化合物

通過TCMSP 數據庫篩選得到135 個化合物，文獻檢索得到24 個化合物。2 個化合物在PubChem 上搜索不到，21 個化合物在PubChem 中搜索不到canonical SMILE，12 個化合物預測不到靶點，再排除16 個重復項，最終納入108 個化合物。

2.2 金福安湯與NSCLC 的共同靶點

金福安湯一共預測到6783 個靶點，剔除可能性＜0.2 的靶點，再刪除重復項后，最終納入178 個。NSCLC相關靶點，在GeneCards 數據庫中收集到4180 個，在OMIM 數據庫中收集到483 個，合并后去除重復項，最終得到4549 個。金福安湯和NSCLC 共同靶點有124 個。Venn 圖見圖1，圖中的百分率代表相應區(qū)域的靶點數量占金福安湯和NSCLC 靶點并集的比例。

圖1 金福安湯與非小細胞肺癌的共同靶點Venn 圖

2.3 共同靶點PPI 網絡

使用STRING 數據庫分析了124 個共同靶點的相互作用，將結果導入Cytoscape 軟件進行拓撲分析。最終一共得到19 個關鍵靶點，選擇其中排序前6 位的 靶 點STAT3、SRC、PIK3R1、EGFR、AKT1 和AR 作為金福安湯治療NSCLC 核心靶點。共同靶點PPI 網絡見圖2。

圖2 金福安湯與非小細胞肺癌的共同靶點蛋白質-蛋白質相互作用網絡

2.4 “中藥-化合物-共同靶點”網絡

使用Cytoscape 構建“中藥-化合物-共同靶點”，見圖3。進行拓撲分析，最終一共得到16 個核心化合物，具體信息見表1。

表1 金福安湯治療非小細胞肺癌的核心化合物具體信息

圖3 “中藥-化合物-共同靶點”網絡圖

2.5 KEGG 通路富集分析

通過DAVID 數據庫對共同靶點進行KEGG 通路富集分析，根據P 值（Benjamin 方法校正，P ＜0.05 視為顯著富集），得到金福安湯治療NSCLC 的相關通路41 條。將P 值進行排序，最終通過氣泡圖呈現20 條與NSCLC 密切相關的通路，見圖4。再進一步構建“中藥-化合物-核心靶點-核心通路”網絡，篩選出與核心靶點密切相關的核心通路15 條。見圖5。

圖4 前20 條KEGG 通路富集分析氣泡圖（P ＜0.05）

圖5 “中藥-化合物-核心靶點-核心通路”網絡圖

2.6 分子對接

將核心化合物及其預測的核心靶點進行分子對接，見表2（部分）。結果表明，表中所有對接結合能都＜-5 kcal/mol，且絕大部分＜-7 kcal/mol，提示均有良好的結合能力。因文章篇幅限制，僅展示部分示意圖，見圖6。

圖6 核心化合物及其預測的核心靶點的分子對接示意圖（部分）

表2 核心化合物及其預測的核心靶點的分子對接結果（部分）

3 討論

中醫(yī)學認為肺癌是一種全身屬虛、局部屬實的疾病，其核心病機可概括為“虛”“痰”“瘀”“毒”。金福安湯主要針對“痰、瘀”立方，方中生半夏、生南星化痰散結及丹參、桃仁活血祛瘀，并為君藥，壁虎、山慈菇解毒散結，消腫定痛，為臣藥，浙貝母、葦莖清熱化痰，薏苡仁、太子參健脾益氣，為佐助藥，全方共奏化痰祛瘀、消癥散結之功。金福安湯的前期基礎研究圍繞著p120 連環(huán)蛋白（p120 catenin，p120ctn）展開，機制主要集中在上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）上[14]。然而，金福安湯的有效成分目前尚未明確，作用機制仍有待進一步探索。

“中藥-化合物-核心靶點-核心通路”網絡圖主要圍繞核心靶點來構建，圖中包含非核心化合物。篩選出的核心通路大致可分為4 類：第1 類是細胞增殖和凋亡途徑，如自噬、癌癥中的microRNAs、PI3K-Akt、FoxO 信號通路等；第2 類是血管生成途徑，即VEGF信號通路；第3 類是細胞黏附途徑，包括癌癥中的蛋白聚糖、黏著連接、焦點粘連等通路；第4 類是免疫調節(jié)途徑，包括TNF 和B 細胞受體信號通路。其調節(jié)著細胞生長、增殖分化、侵襲轉移等多種功能，調控NSCLC 的發(fā)生發(fā)展。

通過TCMSP 數據庫篩選和文獻檢索[15-20]最終得到金福安湯活性化合物108 個，化合物靶點178 個，NSCLC 疾病靶點4549 個，兩者共同靶點124 個，其中核心靶點6 個：STAT3、SRC、PIK3R1、EGFR、AKT1和AR。PI3K-Akt 信號通路是EGFR、SRC 的下游共同信號通路，核心靶點EGFR、SRC、PIK3R1、AKT1 均處于這一信號通路上。目前，從lumican/p120ctn 復合體調節(jié)PI3K-Akt 信號通路的角度探討金福安湯干預肺癌轉移機制的相關實驗正在進行中。另外值得一提的是，p120ctn 是SRC 磷酸化的底物，SRC 可通過整合素/黏著斑激酶途徑介導正常細胞的黏附和遷移[21]。

而在篩選出的核心活性成分中，木犀草素與AKT1、SRC、EGFR、PIK3R1 皆有良好的結合能力。木犀草素可抑制NSCLC A549 細胞增殖、侵襲及遷移能力，誘導細胞凋亡[22]；通過調節(jié)肌鈣蛋白表達、收縮細胞骨架等機制逆轉EMT[23]。黃芩素能通過靶向Src/Id1 途徑抑制肺癌細胞生長[24]；還能增強順鉑毒性，增強化療敏感性，其機制可能是阻斷細胞內Akt/NF-κB 信號通路，從而抑制EMT 的發(fā)生[25]。

本研究存在一些不足之處。第一，不可避免誤篩一些活性化合物，譬如與STAT3 均有良好結合的隱丹參酮、小紅參醌乙、丹參醛；第二，金福安湯具體活性成分需進一步通過分離提取、質譜儀分析等手段來確定，具體作用機制亦需通過實驗來進一步驗證。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學及分子對接技術，初步揭示了金福安湯治療NSCLC 的核心化合物與作用機制，呈現了金福安湯在治療NSCLC 中的多個成分、靶點、通路之間的復雜網絡關系，為后續(xù)深入研究金福安湯治療NSCLC 的作用機制提供了一定參考。