胡文斌，張少飛，楊文，孫娜

（隴南師范高等?？茖W(xué)校，甘肅成縣 742500）

人工種子是指將植物離體培養(yǎng)產(chǎn)生的胚狀體或能發(fā)育成完整植株的分生組織，用含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的胚乳和具有保護(hù)功能的種皮包埋而形成的顆粒體。人工種子技術(shù)是建立在組織培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上，利用化學(xué)材料對(duì)胚狀體進(jìn)行包埋等方法而建立起來(lái)的技術(shù)，具有容易制備、育種周期短、成本低、可直接播種等優(yōu)點(diǎn)，有望代替組織培養(yǎng)技術(shù)成為瀕危植物、經(jīng)濟(jì)作物繁殖和優(yōu)良品種選育的新技術(shù)。筆者對(duì)人工種子技術(shù)近幾年來(lái)的研究進(jìn)行綜述，以期為人工種子制作工藝及技術(shù)的優(yōu)化提供參考。

1 人工種子材料的選擇

人工種子在研究過(guò)程中，一般將植物分成2 種類型：一類是具有一定研究基礎(chǔ)的植物，這類植物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)周期短、特征明顯，很容易與其他植物區(qū)分開(kāi)來(lái)，同時(shí)已建立好體細(xì)胞胚胎發(fā)生系統(tǒng)，稱為模式植物，如胡蘿卜、苜蓿、芹菜、花椰菜、萵苣等[1]；另一類是一些經(jīng)濟(jì)作物或者中藥材，如蕙蘭、鐵皮石斛、半夏、三七、馬鈴薯、小麥、玉米、青天葵等[2-4]。目前為止，研究人員已經(jīng)對(duì)多種類型的植物進(jìn)行了人工種子研究，研究范圍已經(jīng)從過(guò)去的模式植物轉(zhuǎn)向經(jīng)濟(jì)作物、觀賞植物、中藥材、瀕危植物等各種類型，并呈一定的上漲趨勢(shì)。

2 體細(xì)胞胚的同步化調(diào)控

體細(xì)胞胚的同步化是利用一定的方法將體細(xì)胞胚的分化程度控制在某一生長(zhǎng)階段，最終得到大小相同、形態(tài)及分化程度相近的胚狀體。如果體細(xì)胞胚的成熟度不同，所形成的人工種子萌發(fā)速度也會(huì)有差異，這樣就不便于管理，只有獲得大量同步化的體細(xì)胞胚，避免人工種子在包埋時(shí)再根據(jù)胚的大小、成熟度等來(lái)篩選體細(xì)胞胚等繁瑣的過(guò)程，才能節(jié)約大量人力、物力和財(cái)力，有效提高生產(chǎn)效率，為實(shí)現(xiàn)工廠化的生產(chǎn)目標(biāo)奠定基礎(chǔ)。

因此，體細(xì)胞胚的同步化是人工種子實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)的前提，目前，常用的體細(xì)胞胚同步化方法主要有物理方法和化學(xué)方法2 種，其中物理方法主要有過(guò)篩分級(jí)分選、密度梯度離心、低溫培養(yǎng)、滲透壓調(diào)節(jié)等，化學(xué)方法主要有饑餓法、抑制劑法、外源激素調(diào)控等[5]。

3 人工種子的包埋基質(zhì)

3.1 人工胚乳

人工胚乳是介于人工種皮和胚狀體之間，為胚狀體提供礦質(zhì)元素、維生素以及激素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的成分，是胚狀體萌發(fā)生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。人工胚乳所含的物質(zhì)是體細(xì)胞胚萌發(fā)的培養(yǎng)基成分，主要有MS 培養(yǎng)基、B5 培養(yǎng)基、N6 培養(yǎng)基和SH 培養(yǎng)基等[6]。同時(shí)，人工胚乳中還需添加一定的碳源，如蔗糖、果糖、麥芽糖和淀粉等，主要起維持胚乳內(nèi)外的滲透壓以及給胚狀體提供營(yíng)養(yǎng)的作用。

目前，適宜作為人工胚乳基質(zhì)的材料有海藻酸鈉、果膠酸鈉、瓊脂、明膠、樹(shù)膠等[6]，這些材料各有優(yōu)勢(shì)，目前常用的是海藻酸鈉，因其具有通透性好、無(wú)毒、具有生物相容性及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，至今仍是人工胚乳基質(zhì)的首選，但它也存在很多問(wèn)題，如易黏連、易滲漏、易失水、吸水回漲性差、機(jī)械強(qiáng)度差等，為了克服這些困難，研究人員嘗試用復(fù)合材料來(lái)制備人工胚乳，比如在人工胚乳中添加殼聚糖、活性炭、木薯淀粉、保水劑等[7-9]。同時(shí)，培養(yǎng)基成分由于含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而易污染，因此，人工胚乳中常通過(guò)添加防腐劑、抗生素及農(nóng)藥等的方式來(lái)提高其防腐性能，也是人工種子實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間貯藏以及田間播種的關(guān)鍵技術(shù)之一[10-11]。

3.2 人工種皮

人工種皮分內(nèi)種皮和外種皮2 種，內(nèi)種皮也就是人工胚乳，外種皮是能保持人工胚乳中的水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)具有一定強(qiáng)度以防止外來(lái)機(jī)械破壞并具一定的透氣性成分。目前，內(nèi)種皮的研制還依賴于無(wú)菌條件，僅有內(nèi)種皮包埋的人工種子機(jī)械強(qiáng)度差、易污染等，不利于機(jī)械化播種。

人工種子要想同自然種子一樣貯藏、包裝及運(yùn)輸，還需要附加人工外種皮來(lái)增強(qiáng)其保水性及機(jī)械強(qiáng)度等。外種皮不但可以提高人工種子的保水性、防止內(nèi)種皮中的營(yíng)養(yǎng)外滲，還可以降低土壤中微生物、溫度及pH 等環(huán)境因素對(duì)種胚萌發(fā)率、成苗率的影響。同時(shí)也便于人工種子的貯藏、運(yùn)輸及播種，外種皮目前最常用的制備方法仍然是通過(guò)在海藻酸鈉中添加多糖（如殼聚糖）。黃和平等[12]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)種皮基質(zhì)為4%海藻酸鈉+2% CaCl2+2%殼聚糖時(shí)，四倍體盾葉薯蕷人工種子的萌發(fā)率和成苗率最高。李偉平等[13]以白及種子為材料，研究發(fā)現(xiàn)以4.0%海藻酸鈉+0.2 mol/L CaCl2+0.4 mg/L 青霉素+0.3%多菌靈+0.2%苯甲酸鈉為人工種皮基質(zhì)，其成苗率最高，可以在有菌基質(zhì)中生長(zhǎng)。胡根海等[14]以陸地棉營(yíng)養(yǎng)芽為材料，發(fā)現(xiàn)人工種皮基質(zhì)為4%海藻酸鈉+1%甲基纖維素+1.0%苯甲酸鈉+0.02～0.04 mg/L 青霉素+0.5 mg/L 多效唑時(shí)，人工種子的萌發(fā)率達(dá)到了95%。

4 人工種子的包埋方法

人工種子的包埋方式目前主要有機(jī)械包埋和手工包埋2 種，機(jī)械包埋主要是利用人工種子包埋機(jī)進(jìn)行包埋，但是還有許多方面需要改進(jìn)，不能完全代替手工包埋。包埋方法主要有液膠包埋法、干燥法和離子交換法3 種[15]。液膠包埋法是將體細(xì)胞胚混合到溫度較高的膠液中，然后將容有胚狀體的膠液滴注到有小坑的模板上，待溫度下降即可形成膠丸狀的人工種子。干燥法是指利用聚氧乙烯等高聚物對(duì)胚狀體進(jìn)行包埋，干燥后休眠的人工種子可以長(zhǎng)時(shí)間保存，人工種子需要長(zhǎng)時(shí)間貯藏時(shí)可用這種方法。離子交換法是指通過(guò)離子交換的方法使外種皮固化后形成一個(gè)堅(jiān)硬的外殼，將繁殖體包埋起來(lái)，最終形成一個(gè)具有一定機(jī)械強(qiáng)度的凝膠顆粒，目前，最常用的方法是將胚狀體用海藻酸鈉包埋后，再轉(zhuǎn)到CaCl2溶液中與Ca2+發(fā)生離子交換，最后形成球狀膠囊。

5 人工種子的貯藏

由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有一定的季節(jié)性，因此，獲得的人工種子不一定能及時(shí)播種于大田，人工種子胚乳含有豐富的營(yíng)養(yǎng)，這就有可能導(dǎo)致其在貯藏過(guò)程中出現(xiàn)萌發(fā)的現(xiàn)象，同時(shí)人工種子含水量也比較高，失水后容易皺縮，因此，人工種子的貯藏是亟待解決的一個(gè)難題。想要解決這個(gè)問(wèn)題則要從多方面著手，如包埋基質(zhì)的完善、呼吸作用抑制失水后吸水回脹的研究等，目前人工種子貯藏方法主要有干燥法、低溫法、抑制劑法、超低溫保存法及多種方法組合等[16]。干燥法是通過(guò)脫水使胚狀體生長(zhǎng)停止，從而人工種子進(jìn)入休眠而達(dá)到貯藏的目的。低溫法一般將人工種子保存于4℃條件下，利用低溫環(huán)境來(lái)抑制人工種子的新陳代謝，從而達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的，但是低溫保存人工種子則需要耗費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力。抑制劑法是在人工胚乳中添加適當(dāng)?shù)拿撀渌岬却龠M(jìn)其休眠而達(dá)到貯藏的目的。液體石蠟法是在人工種子包埋后通過(guò)涂抹或者浸入液體石蠟的方式來(lái)抑制其呼吸作用，從而達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的。超低溫保存法是利用超低溫冰箱或者液氮對(duì)人工種子進(jìn)行保存的方法，在超低溫條件下，人工種子的新陳代謝或者生命活動(dòng)幾乎完全停止，在適當(dāng)條件下進(jìn)行解凍即可播種于大田。

6 人工種子的防腐

由于人工胚乳中含有糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)容易受到細(xì)菌、真菌等的污染，進(jìn)而影響其貯藏效果、人工種子的萌發(fā)率，以及企業(yè)的生產(chǎn)效率。因此，只有做好人工種子的防腐工作，才能延長(zhǎng)其貯藏時(shí)間，提高其萌發(fā)率和企業(yè)的生產(chǎn)效率。而目前的防腐措施主要是給人工胚乳中添加抗生素、農(nóng)藥、防腐劑等來(lái)提高人工種子的防腐效果，如青霉素[4，13-14]、多效唑[14]、多菌靈[10]、苯甲酸鈉[14]等。

同時(shí)有些植物材料在培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分裂分化過(guò)程中，會(huì)向培養(yǎng)基釋放褐色類物質(zhì)，從而導(dǎo)致褐變的發(fā)生，能夠發(fā)生褐變的外植體有很多，如鐵皮石斛[16]、核桃[17]、牡丹[18]等，因此，在人工種子制作過(guò)程中，可以在人工胚乳中添加PVP、硫代硫酸鈉、活性炭、硝酸銀等來(lái)減少褐變的發(fā)生。

7 討論及展望

目前人工種子的研究仍然處于試驗(yàn)階段，還有許多問(wèn)題需要解決。人工種胚基本上都是通過(guò)組織培養(yǎng)獲得，與天然種子相比，在生理生化方面還有著很大差別，人工種胚體內(nèi)蛋白質(zhì)含量較低，同時(shí)在抗性、休眠及生長(zhǎng)發(fā)育等方面還與天然種子差距較大；同時(shí)，體細(xì)胞胚的同步化研究措施存在操作復(fù)雜、易污染、周期長(zhǎng)且同步化效率不高等問(wèn)題；人工胚乳和人工種皮材料與天然種子也存在很大差距，保水性較差，機(jī)械強(qiáng)度不夠等，同時(shí)胚乳的成分也有待于進(jìn)一步優(yōu)化，這就縮短了人工種子的貯藏時(shí)間；人工種子對(duì)播種條件的要求也較高，如果防腐工作不到位就會(huì)嚴(yán)重影響其萌發(fā)率和成苗率；人工種子的生產(chǎn)仍然以人工為主，機(jī)械化及自動(dòng)化程度不高[2，15，19]。

人工種子是在組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一種新的育種方式，具有廣闊的應(yīng)用前景，但離大規(guī)模的推廣應(yīng)用還有很長(zhǎng)的路要走。但是隨著對(duì)人工種子技術(shù)研究的深入以及制作工藝的優(yōu)化，人工種子的制作成本將會(huì)進(jìn)一步下降，貯藏時(shí)間將會(huì)進(jìn)一步延長(zhǎng)，種胚的萌發(fā)率和成苗率也會(huì)進(jìn)一步提高，人工種子極有可能成為瀕危植物保護(hù)、經(jīng)濟(jì)作物育種及珍稀中藥材繁殖的主要方式。相信在不久的將來(lái)，人工種子與天然種子相比也將具有獨(dú)特的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，人工種子將展現(xiàn)出巨大的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景。