黃新瑞，李 莎，高 嵩△

(1. 北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與生物物理學(xué)系，北京 100191； 2. 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)技術(shù)研究院，北京 100191)

1 冷凍電鏡的發(fā)展背景

在人類基因組測定之后，人們發(fā)現(xiàn)僅從基因組序列的角度無法完整、系統(tǒng)地闡明生物體的功能，因此，研究以蛋白質(zhì)為主體的生物大分子三維結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系成為現(xiàn)代生命科學(xué)的一個重要研究領(lǐng)域，尤其是生物大分子高分辨率三維結(jié)構(gòu)的研究甚至原子水平結(jié)構(gòu)的研究[1-2]。透射電鏡本質(zhì)上有原子尺度分辨率的能力，但由于生物樣品易受輻照損傷、圖像襯度差、信噪比低的特點(diǎn)，使其對生物大分子的高分辨率結(jié)構(gòu)解析比較困難[3-4]。冷凍電鏡(cryo-electron microscopy)成像采用冷凍電子顯微技術(shù)和計(jì)算機(jī)三維重構(gòu)技術(shù)相結(jié)合的方式[5-6]，將含水生物大分子快速冷凍(>104℃/s)到液氮或液氦溫度，并在低溫條件下(～100 K)采用低電子劑量(如5～10 electron/A2)成像，從而在高分辨水平上研究生物大分子的三維結(jié)構(gòu)。由于生物大分子樣品被冷凍的速度極快，樣品內(nèi)部的水來不及結(jié)晶而形成玻璃態(tài)的冰，從而避免了晶態(tài)冰形成時破壞生物分子樣品的結(jié)構(gòu)[7-8]。這層非晶態(tài)的冰一方面可在電子顯微鏡中支撐樣品，另一方面也可以在電子顯微鏡鏡筒的高真空環(huán)境中很好地保存含水生物大分子樣品中的水，從而更好地保護(hù)生物大分子樣品，讓其處于或接近于其生理活性狀態(tài)，有效提高了分辨率[9-10]。冷凍電鏡研究的對象小至幾個納米大小的單個蛋白質(zhì)分子，大至整個病毒粒子，甚至是微米尺度的細(xì)胞器[11]。

冷凍電鏡技術(shù)在生物領(lǐng)域目前主要有三大研究手段：電子晶體學(xué)、單顆粒分析、電子斷層三維重構(gòu)技術(shù)。電子晶體學(xué)方法是將生物分子的二維晶體在電子顯微鏡中進(jìn)行傾斜來收集不同方向的衍射譜，再將這些衍射譜在傅里葉(Fourier)空間進(jìn)行整合來解析生物大分子的結(jié)構(gòu)[12]。單顆粒方法是對多個取向不同的結(jié)構(gòu)完全相同的生物分子或復(fù)合體進(jìn)行分類、疊加平均和三維重構(gòu)來解析它們的結(jié)構(gòu)[13]。電子晶體學(xué)和單顆粒分析均要求純化的生物樣品具有較好的均一性，但對沒有結(jié)構(gòu)同一性的生物樣品(如細(xì)胞、病毒或生物組織等)只能采用電子斷層成像方法，通過獲取同一區(qū)域的多個角度的投影圖來反向重構(gòu)它們的三維結(jié)構(gòu)。經(jīng)過近40年發(fā)展，尤其是近5年的技術(shù)突破，冷凍電鏡技術(shù)特別是單顆粒技術(shù)，因其在生命科學(xué)領(lǐng)域的突出應(yīng)用價(jià)值和前景，三位發(fā)展冷凍電鏡技術(shù)的先驅(qū)科學(xué)家分享了2017年的諾貝爾化學(xué)獎[5,14-16]。雖然冷凍電鏡技術(shù)取得了突破，但由于一些瓶頸問題的存在，單顆粒技術(shù)的分辨率有待進(jìn)一步提高，亞納米原位結(jié)構(gòu)解析的電子斷層重構(gòu)技術(shù)有待進(jìn)一步發(fā)展和建立。冷凍電鏡中電子束輻照損傷仍是提高三維重構(gòu)分辨率的關(guān)鍵限制因素[17-19]。在冷凍電鏡成像中，由于樣品未經(jīng)染色而圖像襯度很低，樣品對輻射損傷的耐受能力雖因冷凍而增加，但為獲得高分辨圖像，在觀察和拍照時所用的電子劑量必須很小，因此，與常規(guī)電子顯微鏡方法相比，冷凍電鏡方法的信噪比低(如電子斷層成像中信噪比通常小于0.1)。這就是說，冷凍電鏡方法雖然能夠很好地保存生物大分子天然狀態(tài)的結(jié)構(gòu)，但這些結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)被淹沒在噪聲之中而難以辨認(rèn)。低對比度、低信噪比和高噪聲對圖像識別、對齊、重構(gòu)及結(jié)構(gòu)的顯示與解釋都有極大影響。當(dāng)前用于生物大分子三維重構(gòu)的硬件(如電子顯微鏡和計(jì)算機(jī)等)都已發(fā)展到非常高的水平，而三維重構(gòu)的理論和相應(yīng)的圖像處理技術(shù)發(fā)展卻相對滯后，尤其是針對冷凍電子斷層成像(cryo-electron tomography)的圖像處理和重構(gòu)技術(shù)[6]。

本文總結(jié)了冷凍電鏡領(lǐng)域多位學(xué)者對于冷凍電鏡圖像特點(diǎn)和相應(yīng)成像技術(shù)的研究工作，提出使用各種濾波器進(jìn)行噪聲抑制問題，以期在被噪聲“污染”的數(shù)據(jù)中找出有價(jià)值的信息，提高圖像信噪比，獲取高分辨三維結(jié)構(gòu)，得到最好的顯示效果用于解釋生物大分子的三維結(jié)構(gòu)和功能。

2 冷凍電鏡成像中的噪聲模型

冷凍電鏡圖像在生成和傳輸過程中常常因受到各種噪聲的干擾和影響，如環(huán)境因素、設(shè)備因素等[20]，使得圖像模糊，甚至淹沒圖像特征，妨礙對所接受的圖像源信息進(jìn)行記錄、理解或分析，這對后續(xù)圖像的處理和生物分子結(jié)構(gòu)的正確獲得和解釋都將產(chǎn)生不利影響[21]。雖然近年來具有先進(jìn)電子光學(xué)系統(tǒng)的高穩(wěn)定電子顯微鏡(如FEI Titan Krios)和直接電子探測器(direct detection device)得以研制開發(fā)和成熟應(yīng)用，使得硬件設(shè)施具有優(yōu)異性能，但冷凍電鏡成像中仍不可避免多種噪聲干擾，根據(jù)不同分類準(zhǔn)則可將噪聲分類如下：(1)按照產(chǎn)生原因，圖像噪聲可分為外部噪聲和內(nèi)部噪聲。外部噪聲指系統(tǒng)外部干擾以電磁波或經(jīng)電源耦合進(jìn)系統(tǒng)內(nèi)部而引起的噪聲，如外部電氣設(shè)備產(chǎn)生的電磁波干擾、天體放電產(chǎn)生的脈沖干擾等。由系統(tǒng)電氣設(shè)備內(nèi)部引起的噪聲為內(nèi)部噪聲，如內(nèi)部電路的相互干擾。內(nèi)部噪聲一般又可分為以下四種：(a)由光和電的基本性質(zhì)所引起的噪聲，如由光的統(tǒng)計(jì)本質(zhì)和圖像傳感器中光電轉(zhuǎn)換過程引起的光電子噪聲；(b)電器的機(jī)械運(yùn)動產(chǎn)生的噪聲；(c)器材材料本身引起的噪聲，例如在阻性器件中，由于電子隨機(jī)熱運(yùn)動而造成的電子噪聲；(d)系統(tǒng)內(nèi)部設(shè)備電路引起的噪聲。(2)按照統(tǒng)計(jì)特性，圖像噪聲可分為平穩(wěn)噪聲和非平穩(wěn)噪聲，統(tǒng)計(jì)特性不隨時間變化的噪聲稱為平穩(wěn)噪聲，統(tǒng)計(jì)特性隨時間變化的噪聲稱為非平穩(wěn)噪聲，即此種噪聲在圖像中的分布和大小不規(guī)則，具有隨機(jī)性。(3)按照噪聲的概率分布情況，圖像噪聲可分為高斯(Gaussian)噪聲、泊松(Poisson)噪聲、瑞利(Rayleigh)噪聲、伽馬(Gamma)噪聲、指數(shù)噪聲和均勻噪聲等。根據(jù)噪聲幅度隨時間的分布形狀，若其幅度分布遵循高斯分布就稱其為高斯噪聲，遵循泊松分布就稱其為泊松噪聲，遵循瑞利分布就稱其為瑞利噪聲。根據(jù)噪聲頻譜形狀，若其頻譜均勻分布就稱其為白噪聲，若其頻譜與頻率成反比就稱其為1/f噪聲，若其頻譜與頻率的平方成正比就稱其為三角噪聲等。(4)按照噪聲和信號之間的關(guān)系，圖像噪聲可分為加性噪聲和乘性噪聲，例如在串聯(lián)圖像傳輸系統(tǒng)中，若各部分串入噪聲是同類噪聲可以進(jìn)行功率相加，依次信噪比下降。假定信號為S(t)，噪聲為ε(t)，如果混合疊加波形是S(t)+ε(t)的形式，則稱其為加性噪聲。加性噪聲和圖像信號強(qiáng)度是不相關(guān)的，如圖像在傳輸過程中引進(jìn)的“信道噪聲”。如果疊加波形為S(t)[1+ε(t)]的形式，則稱其為乘性噪聲。乘性噪聲則與信號強(qiáng)度有關(guān)，往往隨圖像信號的變化而變化，例如膠片圖像顆粒噪聲。噪聲與圖像之間一般具有相關(guān)性，例如攝像機(jī)的信號和噪聲相關(guān)，黑暗部分噪聲大，明亮部分噪聲?。挥秩鐢?shù)字圖像中的量化噪聲與圖像相位相關(guān)，圖像內(nèi)容接近平坦時，量化噪聲呈現(xiàn)偽輪廓，但圖像中的隨機(jī)噪聲會因?yàn)轭澰胄?yīng)反而使量化噪聲變得不很明顯。為了分析處理方便，往往將乘性噪聲近似認(rèn)為是加性噪聲，而且總是假定信號和噪聲是互相獨(dú)立的，因而噪聲具有疊加性。

冷凍電鏡成像中影響圖像采集的環(huán)境因素(如磁場變化、機(jī)械和聲振動、房間熱不穩(wěn)定性和電磁鏡片等)大的波動都被不同的物理裝置(實(shí)時磁場，例如補(bǔ)救補(bǔ)償器、隔音器、空調(diào)和水冷系統(tǒng))進(jìn)行最大程度的消除，所以一般認(rèn)為剩余相關(guān)噪聲的效果圍繞平均值居中，是加性的并遵循高斯分布。來自傳感器[如電荷耦合器件(charge coupled device, CCD)或直接電子探測器相機(jī)(electron direct detection device, DDD)]的非常低的噪聲大致為泊松噪聲，來自非彈性電子束與樣品相互作用的噪聲是高斯分布?；谝陨侠鋬鲭婄R成像中的噪聲特點(diǎn)，目前一般認(rèn)為冷凍電鏡圖像噪聲為零均值加性高斯白噪聲圖像模型[22-23]，即：f(n)=I(n)+ε(n)，其中f(n)為冷凍電鏡圖像數(shù)據(jù)，n∈{1, 2, …, N}代表具有N個像素的圖像f中的每一個像素指標(biāo)，I(n)為理想的無噪聲圖像，ε(n)為零均值加性高斯白噪聲，即ε:Norm(0,σ2)，其中σ2為圖像f的噪聲方差。

由于高斯噪聲在空間和頻域中數(shù)學(xué)上的易處理性，這種噪聲(也稱為正態(tài)噪聲)模型經(jīng)常被用于冷凍電鏡圖像的建模分析中。由于噪聲對冷凍電鏡圖像的生成、采集、處理等各種環(huán)節(jié)以及輸出結(jié)果的全過程都有影響，為了抑制噪聲，改善圖像質(zhì)量，便于更高層次的處理，去噪已經(jīng)成為冷凍電鏡圖像處理中極其重要的一個步驟。圖像去噪本質(zhì)就是在盡量保持原有圖像數(shù)據(jù)的前提下將噪聲數(shù)據(jù)剔除[24-25]，即通過記錄的噪聲圖像數(shù)據(jù)f最大限度估計(jì)理想無噪聲圖像數(shù)據(jù)I，即得到去噪后的圖像數(shù)據(jù)fdenoised。

3 冷凍電鏡中常用濾波器的應(yīng)用分析

圖像處理領(lǐng)域中常見的去噪方法大致有以下四類：(1)基于圖像的空間域或變換域進(jìn)行濾波去噪；(2)基于偏微分方程進(jìn)行圖像去噪；(3)利用數(shù)學(xué)變分法的思想進(jìn)行圖像去噪，如全變分(total variation, TV)模型；(4)利用形態(tài)學(xué)噪聲濾除器進(jìn)行圖像去噪。前兩類目前在冷凍電鏡圖像處理中已有廣泛應(yīng)用實(shí)例，空間域?yàn)V波是在原圖像上對像素的灰度值直接進(jìn)行處理，冷凍電鏡領(lǐng)域常見的空間域圖像去噪算法有均值濾波、中值濾波、高斯低通濾波等；圖像變換域去噪方法是對圖像進(jìn)行某種變換，將圖像從空間域轉(zhuǎn)換到變換域，再對變換域中的變換系數(shù)進(jìn)行處理，然后再進(jìn)行反變換將圖像從變換域轉(zhuǎn)換到空間域來達(dá)到去除圖像噪聲的目的。將圖像從空間域轉(zhuǎn)換到變換域的變換方法很多，如傅里葉變換、小波變換、余弦變換、沃爾什-哈達(dá)瑪變換(Walsh-Hadmard transform)以及K-L變換等。傅里葉變換和小波變換是常見的用于冷凍電鏡圖像去噪的變換方法[26-28]。實(shí)際應(yīng)用中，結(jié)合冷凍電鏡三維重構(gòu)流程，對冷凍電鏡圖像濾波處理的圖像數(shù)據(jù)類型主要為兩類：對投影數(shù)據(jù)去噪處理和對重建圖像去噪處理[29-32]。任何濾波器都有一定的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，濾波器的性能完全取決于應(yīng)用場合[33]。

冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)算法首先需要挑選大量的二維投影樣本，然后利用一定的三維重構(gòu)技術(shù)，重構(gòu)出其三維空間結(jié)構(gòu)。隨著重構(gòu)精度逐漸要求達(dá)到原子級水平，待挑選的蛋白質(zhì)顆粒也達(dá)到了上萬甚至上百萬的水平，從高噪聲冷凍電鏡圖像中識別生物大分子顆粒、校正、對齊等，直接影響三維重構(gòu)的效率和精度[34-37]。一般的圖像處理步驟為[38]：(1)對使用直接電子探測器以電影模式(movie mode)一秒鐘之內(nèi)獲得的至少幾十張投影圖片進(jìn)行樣品漂移修正[39-40]；(2)對投影圖像進(jìn)行圖像質(zhì)量評估并挑選；(3)對挑選的投影圖像進(jìn)行襯度傳遞函數(shù)(contrast transfer function, CTF)的校正；(4)挑選單顆粒樣品的投影；(5)單顆粒樣品二維投影數(shù)據(jù)的對齊、分類和篩選[41]；(6)單顆粒三維模型的重構(gòu)和優(yōu)化；(7)三維模型分類及多重構(gòu)象的結(jié)構(gòu)分析；(8)評估重構(gòu)的三維模型的分辨率；(9)三維重建結(jié)構(gòu)的顯示及解釋。目前常用的重構(gòu)軟件包括Spider、EMAN、XMIPP、Relion等[42]，考慮到高噪聲對獲取最后高分辨率三維結(jié)構(gòu)的影響，這些軟件里面均植入了基本的通用濾波器，如高斯濾波器或均值濾波器等。為了進(jìn)一步提高圖像處理效果，研究人員也針對冷凍電鏡圖像開發(fā)了一些專門的濾波程序，如EMAN軟件中的雙邊濾波器[43]、ImageMagick軟件中的歧視性雙邊濾波器、Bsoft軟件中的迭代中值濾波器、FREALIGN軟件中的維納(Wiener)濾波器等。

冷凍電子斷層成像是將冷凍樣品沿固定旋轉(zhuǎn)軸旋轉(zhuǎn)、傾斜不同角度拍照(例如在-60°～60°的范圍內(nèi)，將樣品每傾斜2°拍一張照片)，即可獲得該樣品的一組投影，一般稱之為“傾斜系列(tilt series)”[44]。在此基礎(chǔ)上，利用專門的圖像處理軟件計(jì)算出樣品的三維結(jié)構(gòu)(cryo-tomogram)，研究其任一斷面的結(jié)構(gòu)或整個斷層體積中內(nèi)容物的結(jié)構(gòu)。由于冷凍生物樣品受輻射總劑量限制(約不超過100 electron/A2)，在保證樣品不損傷且能最大限度獲取投影圖片的情況下，每張圖片的劑量會極低(約1～2 electron/A2)，導(dǎo)致噪聲往往會非常高。尤其對于生物組織這樣的厚樣品在大傾轉(zhuǎn)角數(shù)據(jù)收集時，增加了非彈性散射和多重散射電子的比例，降低了有用的彈性散射電子在圖像形成中所占的比例，結(jié)果投影圖像的信噪比更低[45]。受冷凍電子斷層成像有限傾斜角和高噪聲的限制，現(xiàn)有的三維重構(gòu)算法(如常用的加權(quán)背投影算法和同時迭代技術(shù))在數(shù)據(jù)缺失和高噪聲條件下不能獲得較好的重構(gòu)效果，使得重構(gòu)后的三維結(jié)構(gòu)也淹沒在大量噪聲中。一般的圖像處理步驟為：(1)高通量自動化低劑量傾轉(zhuǎn)序列圖像數(shù)據(jù)收集，對快速冷凍或高壓冷凍的樣品使用較低放大倍數(shù)，找到合適的成像區(qū)域后，在成像區(qū)域附近聚焦，對成像區(qū)域低劑量曝光拍照，然后將樣品傾轉(zhuǎn)到下一個角度對同一成像區(qū)域精確跟蹤后再次拍照，從而完成整套數(shù)據(jù)收集；(2)傾轉(zhuǎn)序列圖像對齊配準(zhǔn)；(3)電子斷層圖像的三維重構(gòu)；(4)對重構(gòu)的三維斷層體數(shù)據(jù)的分割和結(jié)構(gòu)理解[46]。目前也有專門的軟件來完成這一重構(gòu)流程，如SerialEM、UCSFTomo、Protomo、TOM、Xplore3D、IMOD、Chimera、Amira等。由于冷凍電鏡收集的各角度圖像所用的電子劑量很低，故數(shù)據(jù)信噪比很差，重構(gòu)后產(chǎn)生的三維圖像的噪音同樣很大。無論是在數(shù)據(jù)收集或圖像對齊過程中對目標(biāo)區(qū)域的識別跟蹤，還是在重構(gòu)后對三維體數(shù)據(jù)的顯示或分割，降噪處理變得很有必要[47-48]。目前，冷凍電子斷層成像常用的降噪處理主要包括區(qū)域合并(binning)和濾波處理，而濾波的常用方法包括帶通濾波、中值濾波、非線性濾波等，其中各項(xiàng)異性擴(kuò)散的非線性濾波方法效果最為出色，已被植入常用重構(gòu)軟件IMOD中。

雖然冷凍電子斷層重構(gòu)的結(jié)構(gòu)本身不具有結(jié)構(gòu)全同性，但是它的一些亞單元結(jié)構(gòu)(如包膜蛋白結(jié)構(gòu))可能會有一致性，可對這些結(jié)構(gòu)均一的目標(biāo)對象分割提取進(jìn)行量化表征。如果目標(biāo)對象在樣品中結(jié)構(gòu)一致，且數(shù)量較多，可以將其分離出來，并做進(jìn)一步的分類和密度平均，提高研究對象的分辨率，獲得其更加精細(xì)的結(jié)構(gòu)，從而清楚、直觀地獲得目標(biāo)對象在整個重構(gòu)區(qū)域中的三維分布，即為亞單元平均技術(shù)(subvolume averaging)[49-50]。目前此技術(shù)面臨的關(guān)鍵問題是冷凍電子斷層重復(fù)亞單元的提取、識別和對齊分類等，由于冷凍電子斷層圖像的低對比度和低信噪比等特點(diǎn)，很難達(dá)到理想的效果。一般需先對重構(gòu)后的斷層圖像降噪處理，在較好的襯度和分辨率范圍下判定生物學(xué)對象是否含有有價(jià)值的信息。重復(fù)亞單元的顆粒識別分類是冷凍電鏡亞單元平均三維重構(gòu)方法非常重要的環(huán)節(jié)，直接影響亞單元三維重構(gòu)的效率和三維結(jié)構(gòu)的精度。從低對比度和低信噪比的冷凍電鏡圖像中提取成千上萬個生物顆粒是一件相當(dāng)耗時的工作，已經(jīng)成為三維重構(gòu)過程的瓶頸，自動顆粒識別方法的研究已成為當(dāng)前關(guān)注的焦點(diǎn)，數(shù)據(jù)噪聲是影響自動顆粒識別的關(guān)鍵因素。

以下將針對上述冷凍電鏡成像中不同成像手段及其不同圖像數(shù)據(jù)處理流程中常用的濾波器的優(yōu)缺點(diǎn)具體分析，以期為進(jìn)一步發(fā)展新的有效濾波算法奠定基礎(chǔ)。

3.1 高斯濾波器

高斯濾波器是一類根據(jù)高斯函數(shù)的形狀來選擇權(quán)值的線性平滑濾波器，對于抑制服從正態(tài)分布的噪聲非常有效。高斯濾波是一種各向同性的加權(quán)平均濾波，離目標(biāo)像素越近的點(diǎn)對最終結(jié)果的貢獻(xiàn)越大，反之則越小，即每個鄰域像素點(diǎn)權(quán)值是隨該點(diǎn)離目標(biāo)像素點(diǎn)的距離單調(diào)增減的。這一性質(zhì)是很重要的，因?yàn)檫吘壥且环N圖像局部特征，如果平滑運(yùn)算對離算子中心很遠(yuǎn)的像素點(diǎn)仍然有很大作用，則平滑運(yùn)算會使圖像失真。高斯濾波后圖像被平滑的程度取決于標(biāo)準(zhǔn)差σ。σ越大，高斯濾波器的頻帶就越寬，平滑程度就越好。通過調(diào)節(jié)平滑程度參數(shù)σ，可在圖像特征過分模糊(過平滑)與平滑圖像中由于噪聲和細(xì)紋理所引起的過多的不希望突變量(欠平滑)之間取得折中。在冷凍電鏡圖像處理中，高斯平滑濾波器無論在空間域還是在頻率域都是十分有效的低通濾波器，且在實(shí)際圖像處理中得到了有效的使用，尤其是單顆粒分析技術(shù)中，在顆粒挑選前被廣泛采用以便對顆粒進(jìn)行識別[51-52]。

3.2 中值濾波器

中值濾波器是一種比較經(jīng)典的非線性濾波方法，是基于排序統(tǒng)計(jì)理論的一種能有效抑制噪聲的信號平滑處理技術(shù)。中值濾波的基本原理是把圖像數(shù)據(jù)中目標(biāo)像素點(diǎn)的值用該點(diǎn)的一個鄰域中各像素點(diǎn)值的中值代替，從而消除孤立的噪聲點(diǎn)。方法是用某種結(jié)構(gòu)的滑動模板，如通常選3×3正方形區(qū)域二維模板或3×3×3立方體區(qū)域三維模板為待濾波二維或三維數(shù)據(jù)中目標(biāo)像素點(diǎn)的鄰域，按照像素值的大小將模板內(nèi)像素點(diǎn)排序，生成單調(diào)上升(或下降)的二維或三維數(shù)據(jù)序列，從而確定模板內(nèi)像素點(diǎn)的中值代替目標(biāo)像素的值，通過模板在待濾波數(shù)據(jù)空間的移動完成整個濾波過程。相對于古典線性平滑濾波器(如高斯低通濾波器)，中值濾波器的優(yōu)點(diǎn)是傾向于保護(hù)圖像邊緣信息，同時檢測去除脈沖噪聲給圖像處理帶來的影響。中值濾波器的缺點(diǎn)是受滑動模板尺寸的限制：模板小，不能有效地消除噪聲；模板大，會破壞圖像的有用細(xì)節(jié)。目前有研究者改進(jìn)傳統(tǒng)中值濾波為迭代中值濾波，對冷凍電鏡圖像自動去噪，以期在適度內(nèi)存要求下實(shí)現(xiàn)對冷凍電子斷層重建結(jié)構(gòu)圖進(jìn)行快速分割、體征提取和模式識別[53]。

3.3 維納濾波器

維納濾波器是數(shù)學(xué)家Norbert Wiener在20世紀(jì)40年代提出的一種頻域?yàn)V波器，它較好地解決了一般頻域?yàn)V波器直接濾除圖像的高頻分量，使得圖像的細(xì)節(jié)信息隨著噪聲信息的去除而一起丟失的問題。維納濾波器對圖像的高頻分量進(jìn)行適當(dāng)衰減，而非簡單舍棄，有較好的去噪性能。維納濾波基于最小均方誤差準(zhǔn)則，濾波器的輸出與期望輸出之間的均方誤差為最小，是對平穩(wěn)過程的最優(yōu)估計(jì)，可用于提取被平穩(wěn)噪聲所污染的信號。例如，對于運(yùn)動引起的圖像模糊，最簡單的方法是直接做逆濾波，但是逆濾波對加性噪聲特別敏感，使得恢復(fù)的圖像幾乎不可用，而維納濾波的目標(biāo)是找到未被模糊圖像的一個估計(jì)，使它們之間的均方差最小，可以去除噪聲的同時清晰化模糊圖像。維納濾波器已經(jīng)應(yīng)用于二維和三維冷凍電鏡圖像的數(shù)據(jù)處理，目標(biāo)是將嘈雜的圖像用無噪聲對象組合成最佳表示，因?yàn)榫S納濾波器可通過獲得估計(jì)的傅里葉空間表示的信噪比數(shù)據(jù)，即頻譜信噪比(signal-to-noise ration，SSNR)，來抑制噪聲傅里葉空間測量不足部分，以獲得更好的符合無噪聲信號的效果。研究發(fā)現(xiàn)，冷凍電鏡單顆粒分析三維重構(gòu)中的三維顆粒的SSNR映射與顆粒占據(jù)的分?jǐn)?shù)體積成線性比例，使用SSNR和傅里葉殼層相關(guān)(Fourier shell correlation,FSC)功能評估可減輕重構(gòu)中噪聲產(chǎn)生的誤差[54]。而通常計(jì)算SSNR和FSC在顆粒周圍的溶劑區(qū)域中包含噪聲，因此不能準(zhǔn)確反映顆粒密度本身的信號。FREALIGN 8.10整合的“單顆粒維納濾波器”在粒子體積已知情況下可以最小化重構(gòu)粒子的誤差映射，適用于廣泛的現(xiàn)有3D重建技術(shù)，特別適用于傅里葉反演方法的有效和準(zhǔn)確實(shí)施[55]。

3.4 雙邊濾波器

雙邊濾波器是一種局部加權(quán)平均策略的濾波方法，它考慮了像素點(diǎn)間的空間鄰近度和灰度相似度，在圖像變化平緩的區(qū)域，目標(biāo)像素點(diǎn)鄰域內(nèi)像素灰度值相差不大，雙邊濾波轉(zhuǎn)化為高斯低通濾波器；在圖像變化劇烈的區(qū)域，濾波器利用邊緣點(diǎn)附近灰度值相近的像素點(diǎn)的灰度平均值替代原灰度值。雙邊濾波同時考慮空域信息和灰度相似性，達(dá)到保邊去噪的目的。一般的維納濾波或者高斯濾波降噪，都會較明顯地模糊邊緣，對于高頻細(xì)節(jié)的保護(hù)效果并不明顯。高斯濾波在低通濾波算法中有不錯的表現(xiàn)，但只考慮了像素間的空間位置關(guān)系，并沒有考慮像素值之間的相似程度，因此得到的濾波結(jié)果通常是整張圖片一團(tuán)模糊。盡管雙邊濾波具有一定保護(hù)圖像邊緣的優(yōu)勢，但其對邊緣有一定挑剔性，會限制其在降噪中的應(yīng)用。例如，低劑量冷凍電鏡圖片中，脈沖噪聲造成的稀疏分布的高頻噪聲像素，就不會有效地被雙邊濾波器去除，因而有研究者開發(fā)了歧視性雙邊濾波器[56]，已被證明在單顆粒分析方面有助于單顆粒識別框選、分類、對齊和三維圖像重建，在斷層圖像中有助于自動圖像分割。另外，結(jié)合邊緣檢測算法，有研究者開發(fā)了雙邊邊緣濾波器[57]，與傳統(tǒng)邊緣檢測技術(shù)(如遞歸和Canny算法等)相比，雙邊邊緣濾波器需選擇和調(diào)節(jié)的參數(shù)較少或無需參數(shù)輸入，非常適合追蹤隨機(jī)取向的單顆粒，而且可對跨多個尺度的復(fù)雜細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效分割以用于進(jìn)一步的下游處理，例如細(xì)胞注釋和斷層掃描亞單元平均，為準(zhǔn)確和高通量識別亞單元提供了有價(jià)值的工具，在亞細(xì)胞層面的三維結(jié)構(gòu)復(fù)雜性注釋，以及映射空間和時間到細(xì)胞層析圖中原位重組大分子結(jié)構(gòu)的應(yīng)用中發(fā)揮重要作用。

3.5 非局部均值濾波器

均值濾波器是一種線性平滑濾波器，它是給圖像上的目標(biāo)像素一個模板(如3×3模板，以目標(biāo)像素為中心的周圍8個像素，構(gòu)成一個濾波模板)，再用模板中的全體像素的平均值來代替目標(biāo)像素原來值。均值濾波器的主要應(yīng)用是去除圖像中的不相關(guān)細(xì)節(jié)，其中“不相關(guān)”是指與濾波器模板尺寸相比較小的像素區(qū)域。然而，由于圖像的邊緣也是由圖像灰度的尖銳變化帶來的特性，所以均值濾波處理還是存在著邊緣模糊的負(fù)面效應(yīng)，對脈沖噪聲消除效果也不理想。均值濾波算法中，目標(biāo)點(diǎn)上的像素值由其所在位置上周圍的一個小局部鄰近像素值所決定。這種局部平滑方法雖然可去除噪聲并保持圖像基本的幾何架構(gòu)，但是無法很好地保留一些精細(xì)的結(jié)構(gòu)、細(xì)節(jié)以及紋理。1999年，有研究使用非局部自相似性來合成紋理、填補(bǔ)圖像中的小洞，發(fā)展了非局部化(non-local means)的圖像去噪算法，該算法掃描圖像的很大一部分來尋找與目標(biāo)像素點(diǎn)相似的所有像素，通過所有相似像素的平均灰度來實(shí)現(xiàn)濾波。目前多名研究者已經(jīng)證明，非局部均值濾波器是冷凍電鏡圖像數(shù)據(jù)處理和分析的有用工具，其中包括優(yōu)化的局部自適應(yīng)非局部均值濾波器、基于Zernike矩的非局部均值濾波器等，可在保存信號細(xì)節(jié)的同時顯著抑制噪聲[58-59]。

3.6 各向異性擴(kuò)散濾波器

非線性各向異性擴(kuò)散(nonlinear anisotropic diffusion，NAD)濾波器是一種非線性的濾波方法，是用方向性分布系數(shù)函數(shù)來代替線性熱傳導(dǎo)方程中的常系數(shù)后形成的，其目的是為了克服線性濾波方法存在模糊邊緣和移動邊緣位置的缺點(diǎn)。NAD濾波的基本思想是，在可能是邊緣的地方減小擴(kuò)散系數(shù)，從而在邊緣處擴(kuò)散減小(甚至為零)來保護(hù)邊緣，而在均勻區(qū)域擴(kuò)散增大來消除噪聲，由于其平滑度依賴于圖像的局部特征，所以它會受圖像均勻度的影響。

NAD濾波器是通過研究高斯濾波與偏微分方程之間關(guān)系發(fā)展的基于偏微分方程的去噪算法[60]。偏微分方程具有各向異性的特點(diǎn)，所以在圖像去噪中，可以在去除噪聲的同時，很好地保持邊緣。偏微分方程方法所利用的先驗(yàn)信息是圖像為分片光滑的二元函數(shù)，只是該函數(shù)在某些重要數(shù)據(jù)處不連續(xù)。根據(jù)圖像分片光滑的特性可構(gòu)造關(guān)于梯度的約束，而根據(jù)圖像處理目的不同又可構(gòu)造圖像與原始圖像之間的相似性約束，將此兩個組合即得到變分方程，進(jìn)而由歐拉(Euler)方程得到圖像處理的拋物方程。此濾波器成立的統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)可以用尺度空間理論來解釋，已用于體積重建斷層掃描的去噪。目前用于局部增強(qiáng)的NAD濾波器主要基于邊緣增強(qiáng)擴(kuò)散和相干增強(qiáng)擴(kuò)散。Frangakis等[61]在2001年將該方法應(yīng)用于電子顯微鏡的示例表明它非常適合二維傾斜角度投影圖像去噪，可減少多重散射事件和量子分解效應(yīng)導(dǎo)致的噪聲，通過提高單個角度投影圖像質(zhì)量從而提高三維重構(gòu)的體積質(zhì)量。

基于偏微分方程的NAD濾波主要是通過隨時間變化的更新迭代，使得圖像向所要得到的效果逐漸靠近。該方法在確定擴(kuò)散系數(shù)時有很大的選擇空間，在前向擴(kuò)散的同時具有后向擴(kuò)散的功能，所以具有平滑圖像和將邊緣尖銳化的能力。偏微分方程在低噪聲圖像的處理中取得了較好的效果，但是在處理高噪聲圖像時去噪效果不理想，而且處理時間較長。該算法的一個關(guān)鍵問題是什么時候停止過濾過程(即最佳迭代次數(shù)設(shè)定)，使得信號信息不是錯誤分類或模糊。雖然目前提出了幾個客觀停止標(biāo)準(zhǔn)，但大多數(shù)不適用于低溫電子斷層掃描數(shù)據(jù)，一般都需用戶手動選擇，產(chǎn)生的結(jié)果將依賴于對該特定圖像的主觀判斷。

3.7 小波濾波器

前述濾波器在實(shí)際運(yùn)用到低劑量高噪聲的冷凍電鏡圖像中時，通常會造成圖像灰度級損失，圖像清晰度下降。因?yàn)楸惶幚淼膱D像某一具體區(qū)域與空間域中對應(yīng)部分并非簡單的一一映射關(guān)系，對被處理域圖像的濾波，哪怕僅僅是一個數(shù)值的修改，就會導(dǎo)致原圖像中的相關(guān)區(qū)域，甚至整幅圖像的改變，而且，在被處理域圖像各部分、各像素間通常幾乎不存在空間域中的相關(guān)性，找到一個合適的濾波標(biāo)準(zhǔn)存在一定的難度。傳統(tǒng)的去噪方法僅適用于信號和噪聲的頻帶沒有重疊或少部分重疊的情況，當(dāng)信號和噪聲頻帶重疊較大時，這種方法就無能為力了。小波變換目前已成為國內(nèi)外應(yīng)用最廣泛且非常有效的醫(yī)學(xué)圖像去噪方法，其處理的信號和噪聲譜可以任意重疊[62-64]。小波去噪方法的核心是多分辨率分析，通常大尺度對應(yīng)圖像的概貌，小尺度對應(yīng)圖像的細(xì)節(jié)特征，能在有效濾除噪聲的同時，較好地保留圖像的細(xì)節(jié)，被形象地喻為“數(shù)學(xué)顯微鏡”而廣泛使用于各個圖像領(lǐng)域。但是，小波濾波器的組成及求解涉及很多參數(shù)選取，針對不同的目標(biāo)圖像，這些參數(shù)可能不是普遍適用的，尤其是冷凍電鏡成像中，由于生物樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)差異較大，對圖像的清晰度和處理速度要求又很高，所以這些小波圖像去噪方法在實(shí)際的應(yīng)用中要視目標(biāo)圖像而定[65-66]。本研究組在系統(tǒng)研究冷凍電鏡不同成像方法噪聲特性基礎(chǔ)上，將不同閾值函數(shù)、閾值選取方法、小波基等進(jìn)行了優(yōu)化組合，構(gòu)成合適小波濾波器對數(shù)據(jù)進(jìn)行濾波處理，結(jié)合冷凍電鏡成像原理和三維重構(gòu)方法探索出了有利于獲取高分辨率三維結(jié)構(gòu)的小波濾波器及其最優(yōu)參數(shù)，增加了三維數(shù)據(jù)的信噪比，在去除噪聲的同時保持了圖像分辨率，三維結(jié)構(gòu)的顯示穩(wěn)定性和質(zhì)量均有提高[67-68](圖1)。

4 展望

冷凍電鏡結(jié)合三維重構(gòu)方法發(fā)展迅速，成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)中一個越來越重要并正在取得重要突破的技術(shù)，成為解析大型蛋白質(zhì)復(fù)合體、病毒乃至細(xì)胞器的三維納米及亞納米分辨率結(jié)構(gòu)的有力工具。冷凍電鏡圖像數(shù)據(jù)快速、自動去噪算法的開發(fā)是針對精準(zhǔn)圖像分割、特征提取、模式識別的數(shù)據(jù)分析和圖像處理的主要焦點(diǎn)研究內(nèi)容。冷凍電鏡單顆粒技術(shù)，通過去噪提高圖像質(zhì)量可為生物分子顆粒高通量自動識別挑選提供有利保證，在圖像三維重構(gòu)不損失分辨率的情況下有效地進(jìn)行顆粒分類、對齊、校正。冷凍電子斷層成像可對圖像重構(gòu)前后的數(shù)據(jù)分別進(jìn)行濾波去噪處理，對其三維結(jié)構(gòu)的顯示和正確解釋提供有力幫助。