張?zhí)N曦，陳鑫釗，王家鈺，趙蓓瑩，韓芳

（中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院組織胚胎學教研室，沈陽 110122）

早期生活壓力在個體生長發(fā)育過程中起至關重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁的發(fā)生與兒童時期不良應激暴露密切相關［1］，受到早期生活壓力影響的兒童有相當高的可能患有情緒和精神疾病［2］。母嬰分離被認為是一種模擬早期生活壓力的動物模型［3］。嚙齒類動物研究表明，非常短暫的母嬰分離可能會對后代的發(fā)育產(chǎn)生積極的影響，但長時間的母嬰分離會造成負性影響，這種影響會在成年時表現(xiàn)出來，并持續(xù)終生。在嚙齒類動物特別是在大鼠中，母嬰分離被用作各種精神疾病尤其是抑郁癥的模型。研究［4］表明，母嬰分離可以造成大鼠成年后焦慮、抑郁、認知障礙等一系列異常行為。

目前最常用的建立母嬰分離大鼠模型的方法是采用每天母嬰分離3 h（maternal separation for 180 min，MS180）或15 min（maternal separation for 15 min，MS15），但是人們對2種分離方法對大鼠造成的行為影響存在較大分歧，尚無統(tǒng)一結論。一些研究［5］認為MS180會造成大鼠一系列負性行為，而MS15可以減少大鼠焦慮樣行為。此外，一些研究［6］將MS15作為MS180的對照組。另一方面，在創(chuàng)傷后應激障礙、抑郁癥等精神疾病中，有研究［7］發(fā)現(xiàn)雌性對精神疾病具有更高的易感性。同時有研究［8］發(fā)現(xiàn)，運動具有緩解焦慮、抑郁的作用。因此，本研究選取雌性大鼠為研究對象，探索MS180和MS15兩種分離方法對雌性大鼠行為的影響，以及跑輪運動是否可以糾正母嬰分離造成的雌性大鼠行為異常。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2只SPF級12周齡Sprague-Dawley（SD）孕鼠，購自遼寧長生生物技術有限公司。采用Panlab Smart 3.0動物行為學視頻分析系統(tǒng)，記錄動物在曠場、十字高架、水迷宮3種行為學實驗中的運動距離、運動時間等數(shù)據(jù)。所有大鼠在中國醫(yī)科大學實驗動物部飼養(yǎng)，實驗期間均可以自由飲水、攝食，明暗周期為12 h/12 h（8：00～20：00），室溫21～23 ℃，濕度50%～55%。篩選SD孕鼠分娩的雌性仔鼠22只作為研究對象。

1.2 實驗分組以及造模方法

1.2.1 母嬰分離造模：隨機將仔鼠分為對照組（Control組）、MS15組和MS180組，在仔鼠出生后（postnatal day，PND）第2天（PND2）至第14天（PND14），將MS15組和MS180組的仔鼠從母鼠身邊取出，放在單獨的飼養(yǎng)籠內(nèi)，每個飼養(yǎng)籠內(nèi)放1只仔鼠，MS180或MS15后將仔鼠送回原母鼠所在的飼養(yǎng)籠繼續(xù)喂養(yǎng)。Control組仔鼠不作任何處理，在母鼠所在飼養(yǎng)籠繼續(xù)喂養(yǎng)。所有仔鼠均于PND21斷奶，自由攝食、飲水，直至實驗結束。

1.2.2 跑輪運動：PND21斷奶分籠后，Control組、MS15組和MS180組均再細分為跑輪運動組（RW組）和非跑輪運動組（non-RW組），即對照非跑輪運動組（Control+non-RW組）、對照跑輪運動組（Control+RW組）、MS15非跑輪運動組（MS15+non-RW組）、MS15跑輪運動組（MS15+RW組）、MS180非跑輪運動組（MS180+non-RW組）、MS180跑輪運動 組（MS180+RW組）。PND22至PND35，Control+RW組、MS15+RW組、MS180+RW組的仔鼠每天進行不間斷跑輪運動30 min。

1.2.3 曠場實驗：所有仔鼠飼養(yǎng)至成年雌性大鼠后，即在PND63時，進行曠場、高架十字迷宮、水迷宮實驗。將每只大鼠放在曠場（由40 cm高的黑色墻壁和100 cm×100 cm底座包圍的黑色盒子）中央，自動分析系統(tǒng)記錄行為5 min，觀察大鼠在新環(huán)境中的自主行為、探究行為和緊張度。記錄大鼠運動總距離、在中心區(qū)域的時間、進入中心區(qū)域的次數(shù)以及站立次數(shù)。

1.2.4 高架十字迷宮實驗：十字高架主要觀察動物的焦慮水平，開放臂的探索減少表明焦慮相關行為增強。該裝置由2個開放臂（50 cm×10 cm）和2個與開放臂大小一致的閉合臂交叉組成，交叉形成一個中央?yún)^(qū)域（10 cm×10 cm），整個裝置離地70 cm。將每只大鼠頭朝向開放臂放置，在中央?yún)^(qū)域測試5 min，記錄每只大鼠的運動總距離、進入開放臂和閉合臂的時間，以及進入閉合臂的次數(shù)。

1.2.5 水迷宮實驗：水迷宮的圓形水箱被均等分為4個象限，一個直徑為10 cm的圓形目標平臺放置在第一象限。首先訓練大鼠學習找到平臺，訓練5 d，訓練時間內(nèi)未找到平臺的大鼠由實驗員引導至平臺上適應學習10 s。第6天撤走平臺，讓每只大鼠從距離平臺最遠的第三象限入水，測試時間為1 min，記錄其跨越平臺區(qū)域的次數(shù)、在第一象限停留的時間等指標，從而判斷大鼠的認知學習記憶能力。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 23.0和Graphpad Prism8.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用表示，多組間比較采用雙因素方差分析，事后檢驗的兩兩比較采用Tukey法。服從正態(tài)分布的2個獨立樣本計量資料的比較采用獨立樣本t檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 曠場實驗結果

采用雙因素方差分析比較曠場實驗中大鼠的運動總距離，結果發(fā)現(xiàn)，跑輪運動與母嬰分離相互作用［F（2，16）=0.2661，P＞ 0.05］、跑輪運動因素［F（1，16）=0.1518，P＞ 0.05］對運動總距離無顯著影響，母嬰分離因素［F（2，16）=5.169，P＜ 0.05］對運動總距離有顯著影響。采用Tukey法對Control、MS15和MS180三種母嬰分離方法進行兩兩比較，結果發(fā)現(xiàn)，MS15組大鼠的運動總距離顯著高于Control組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見圖1A。

采用雙因素方差分析比較曠場實驗中大鼠進入中心區(qū)域的時間，結果發(fā)現(xiàn)，母嬰分離因素和跑輪運動因素對大鼠進入中心區(qū)域的時間均無顯著影響（P＞ 0.05）。見圖1B。

采用雙因素方差分析比較曠場實驗中大鼠進入中心區(qū)域的次數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)，跑輪運動與母嬰分離相互作用［F（2，16）=2.592，P＞ 0.05］對進入中心區(qū)域的次數(shù)無顯著影響，跑輪運動因素［F（1，16）=8.104，P＜ 0.05］、母嬰分離因素［F（2，16）=22.43，P＜ 0.05］對進入中心區(qū)域的次數(shù)有顯著影響。采用Tukey法對6組進行兩兩比較，結果發(fā)現(xiàn)，MS15+non-RW組大鼠進入中心區(qū)域的次數(shù)顯著高于Control+non-RW組，MS180+RW組大鼠進入中心區(qū)域的次數(shù)顯著高于MS180+non-RW組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見圖1C。

采用兩個獨立樣本t檢驗比較曠場實驗中MS180+RW組和MS180+non-RW組大鼠站立次數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)，MS180+RW組大鼠的站立次數(shù)顯著高于MS180+non-RW組［分別為（19.75±2.754）和（13.25±4.5）次］，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見圖1D。

圖1 曠場實驗統(tǒng)計結果Fig.1 Statistical results of the open-field test

2.2 十字高架實驗結果

采用雙因素方差分析比較十字高架實驗中大鼠的運動總距離和進入開放臂的時間，結果發(fā)現(xiàn)，母嬰分離因素和跑輪運動因素對大鼠的運動總距離以及進入開放臂的時間均無顯著影響（P＞0.05）。見圖2A、2B。

采用兩個獨立樣本t檢驗比較十字高架實驗中MS180+RW組和MS180+non-RW組大鼠進入閉合臂的時間，結果發(fā)現(xiàn)，MS180+non-RW組大鼠進入閉合臂的時間顯著高于MS180+RW組［分別為（189.935±43.127）和（114.515±35.293）s］，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見圖2C。

采用雙因素方差分析比較十字高架實驗中大鼠進入閉合臂的次數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)，母嬰分離因素和跑輪運動因素對大鼠進入閉合臂的次數(shù)均無顯著影響（P＞ 0.05）。見圖2D。

圖2 十字高架實驗統(tǒng)計結果Fig.2 Statistical results of the elevated plus-maze test

2.3 水迷宮結果

采用重復測量方法分析比較各組大鼠在訓練5 d內(nèi)找到目標平臺所需時間的變化。結果發(fā)現(xiàn)，訓練天數(shù)因素［F（2.970，47.53）=16.11，P＜ 0.05］對所有大鼠找到目標平臺所需的時間有顯著影響，即所有大鼠找到目標平臺所需的時間隨訓練天數(shù)的增多而減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；但組別因素［F（5，16）=1.824，P＞ 0.05］對大鼠找到目標平臺所需的時間無顯著影響，即6組間大鼠找到目標平臺所需的時間無顯著差異（P＞ 0.05）。見圖3A。

采用雙因素方差分析比較大鼠在水迷宮實驗中進入第一象限的次數(shù)、在第一象限停留的時間和大鼠跨越目標平臺的次數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)，母嬰分離因素和跑輪運動因素對以上3個測試指標均無顯著影響（P＞ 0.05）。見圖3B～3D。

圖3 水迷宮實驗統(tǒng)計結果Fig.3 Statistical results of the water maze test

3 討論

3.1 母嬰分離造成雌性大鼠成年后行為異常

研究［9］發(fā)現(xiàn)，母嬰分離可提高大鼠的焦慮樣水平、增加大鼠的抑郁樣行為，損害大鼠的認知功能。同時，蔗糖偏好研究［10］結果顯示，母嬰分離導致大鼠的快感缺乏。此外，不同的母嬰分離方法造成的影響不同。有綜述［11］報道，MS15能夠增強大鼠對壓力的應對能力，因為MS15模型模仿了自然界大鼠離開幼崽在短時間內(nèi)收集食物的過程，是一種自然事件，因此MS15能夠減少仔鼠的焦慮樣行為。本研究發(fā)現(xiàn)，在曠場實驗中，MS15+non-RW組大鼠進入中心次數(shù)比Control+non-RW組明顯增多，提示MS15大鼠對新環(huán)境的探索欲望更強烈，焦慮恐懼水平更低。因此，MS15這種短期的母嬰分離會對雌性大鼠起到積極的作用。但是，MS180組大鼠與Control組大鼠相比，未見顯著行為差異。同時，水迷宮實驗未發(fā)現(xiàn)母嬰分離造成的記憶認知障礙這一行為異常表現(xiàn)，其原因需要更多的實驗驗證。

3.2 跑輪運動對MS180雌性大鼠抑郁行為的治療效果顯著

研究［12］發(fā)現(xiàn)，運動可以緩解母嬰分離造成行為異常表現(xiàn)，跑輪運動可以減輕母嬰分離對大鼠的負性影響，大鼠在青春期的跑輪運動增加了母嬰分離大鼠的蔗糖偏好，有效逆轉了在噴濺實驗中母嬰分離導致的對自我照顧的負性影響，說明跑輪運動能夠誘發(fā)母嬰分離大鼠的抗抑郁作用。本研究發(fā)現(xiàn)，跑輪運動的改善作用在MS180大鼠中最為明顯。在曠場實驗中MS180+RW組大鼠進入中心的次數(shù)顯著高于MS180+non-RW組，這表明經(jīng)過跑輪運動的MS180大鼠明顯增加了對新環(huán)境的探索欲望。同時，十字高架實驗發(fā)現(xiàn)，MS180+non-RW組大鼠進入閉合臂的時間顯著高于MS180+RW組，提示經(jīng)過跑輪運動后的MS180大鼠焦慮水平明顯降低。這些結果表明，跑輪運動對MS180的治療有效。而跑輪運動造成的影響在Control大鼠和MS15大鼠中并未發(fā)現(xiàn)，說明運動對MS180這樣的較長時間母嬰分離的治療效果更顯著。

綜上所述，本研究表明，MS15對雌性大鼠起積極作用，可以降低雌性大鼠的焦慮水平，提高雌性大鼠對新環(huán)境的探索欲望，跑輪運動對MS180的治療效果顯著。本研究的局限性在于只對母嬰分離造成的雌性大鼠異常行為進行了研究，對于造成這些異常行為的神經(jīng)生物學改變還需要進行進一步研究。