王春艷， 侯益民， 李漢偉， 蘇秀紅,2*， 董誠(chéng)明,2， 陳隨清,2

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046)

近年來，腫瘤的發(fā)病率不斷攀升，惡性腫瘤嚴(yán)重影響人類的身體健康甚至危及生命，而治療腫瘤的基本手段主要依賴于放療和化療，但放化療藥的不良反應(yīng)較大，故從天然植物中尋找和開發(fā)高效低毒的抗腫瘤藥物，具有廣闊的研究前景[1]。

黑果菝葜為百合科菝葜屬攀援灌木，收載于《中華本草》《南陽中草藥名典》《秦嶺植物志》《涉縣中藥志》等著作。以根莖入藥，為“金剛藤”基源之一，具有祛風(fēng)、清熱、利濕、解毒等功效，臨床上常用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷、盆腔炎等疾病[2]。研究表明菝葜屬植物中多含有黃酮類物質(zhì)，有抗腫瘤的活性，且菝葜屬植物中菝葜、土茯苓等對(duì)腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用[3]。有研究表明，臨床復(fù)方菝葜顆粒可較好地治療非小細(xì)胞肺癌[4]。張蓮萍[5]認(rèn)為菝葜乙酸乙酯提取物的抗癌活性高于正丁醇及乙醇提取物；王濤等[6]發(fā)現(xiàn)菝葜的乙酸乙酯提取物質(zhì)可有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖；吳先闖等[7]比較了菝葜乙醇總提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位對(duì)3種肝癌細(xì)胞的抑制活性，其乙酸乙酯部位對(duì)肝癌細(xì)胞抑制活性最強(qiáng)。故課題組選用黑果菝葜乙酸乙酯部位進(jìn)行抗腫瘤篩選，且黑果菝葜作為菝葜屬中一個(gè)常用的藥用植物資源可能具有潛在的抗腫瘤研發(fā)價(jià)值，但目前對(duì)黑果菝葜的研究甚少[8-9]。

中藥是多成分、多靶點(diǎn)綜合作用的復(fù)雜體系，其藥效是多種成分共同作用的結(jié)果，而中藥譜效學(xué)是基于解決中藥活性成分復(fù)雜、藥理作用機(jī)制不明等問題的一門學(xué)科，廣泛應(yīng)用于中藥藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)研究，可將化學(xué)成分的變化與藥效指標(biāo)相結(jié)合，為中藥的質(zhì)量控制和藥效評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)[10]。目前雖然有研究對(duì)黑果菝葜中的成分進(jìn)行了分離鑒定，但尚未見關(guān)于該藥用植物中各成分與其抗腫瘤活性的研究。因此，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)考察了黑果菝葜乙酸乙酯部位對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞、人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞、人胃癌MGC80-3細(xì)胞抑制率影響，以確定其抗腫瘤活性部位并建立黑果菝葜抗肝癌SMMC-7721細(xì)胞活性部位的指紋圖譜，在此基礎(chǔ)之上探究黑果菝葜活性部位指紋圖譜特征峰與藥效間的相關(guān)性，以期揭示黑果菝葜抗腫瘤活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為黑果菝葜中抗腫瘤活性成分的提取富集及其資源合理開發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

Waters e2695-2489型高效液相(美國(guó)沃特世公司)；VARIOSKAN LUX型自動(dòng)酶標(biāo)儀、Scilentific 371型CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛世爾公司)；IMS105DU型天平(萬分之一，瑞士梅特勒-托利多集團(tuán))；EYELAN-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、EYELA FDU-1200型冷凍干燥機(jī)(上海愛朗儀器有限公司)。

胎牛血清(武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)SA190501)，MEM培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)WH0111201911SP)；噻唑藍(lán)(MTT，批號(hào)725C0511)、DMSO(批號(hào)11001G031)、0.25%胰酶(批號(hào)2050302)、青霉素-鏈霉素混合液(雙抗)(批號(hào)20190712)，以上試劑均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞、人胃癌MGC80-3細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。黑果菝葜采集信息見表1，由河南中醫(yī)藥大學(xué)蘇秀紅教授鑒定為百合科菝葜屬黑果菝葜Smilaxglauco-chinaWarb.。

表1 樣品信息

2 方法

2.1 色譜條件 以ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～15 min，5%～10% A；15～35 min，10%～15% A；35～55 min，15%～20% A；55～90 min，20%～30% A；90～105 min，30%～33% A)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 稱取白藜蘆醇對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制備成適當(dāng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 稱取黑果菝葜各產(chǎn)地藥材粉末100 g，加入10倍量70%乙醇回流提取1.5 h，重復(fù)3次，合并濾液，減壓回收乙醇，得到乙醇總提物浸膏，蒸干后加水200 mL，取1/5作乙醇總提取液，剩余4/5提取液乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部位；減壓回收各部位萃取液，冷凍干燥成粉末，配制備成5 mg/mL溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)MTT法 參考文獻(xiàn)[11-13]，人肝癌SMMC-7721細(xì)胞用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞和人胃癌MGC80-3細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721、A549和MGC80-3細(xì)胞株，用0.25%胰蛋白酶消化，含10%胎牛血清的培養(yǎng)液調(diào)制成5×104/mL的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔接種100 μL，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸出原培養(yǎng)液，設(shè)置對(duì)照組(加入等體積不含血清的培養(yǎng)基)和藥物組。藥物組，乙酸乙酯部位，每組藥物設(shè)置5個(gè)質(zhì)量濃度梯度(12.5、25、50、75、100 μg/mL)，每個(gè)質(zhì)量濃度復(fù)種3個(gè)孔，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h后，吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，在振蕩器上搖勻15 min，待其結(jié)晶完全溶解后，設(shè)置波長(zhǎng)為490 nm，在酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，細(xì)胞抑制率=[(OD對(duì)照組-OD給藥組)/OD對(duì)照組]×100%。

2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以Graphpad Prism 7.0軟件計(jì)算各組樣品IC50值。以黑果菝葜指紋圖譜中各共有峰的峰面積為自變量，SMMC-7721腫瘤細(xì)胞抑制率為因變量，采用SIMCA-P 13.0軟件對(duì)其進(jìn)行偏最小二乘回歸分析，建立回歸方程。

3 結(jié)果與分析

3.1 黑果菝葜乙酸乙酯部位對(duì)SMMC-7721、A549、MGC80-3細(xì)胞抑制率的影響 由表2可知，乙酸乙酯部位給藥組在一定質(zhì)量濃度下對(duì)SMMC-7721、A549、MGC80-3細(xì)胞均具有抑制作用，當(dāng)給藥質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，IC50值分別為19.27 μg/mL、大于100和無法計(jì)算。因此，當(dāng)給藥濃度為100 μg/mL時(shí)，乙酸乙酯部位對(duì)細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)，故選擇SMMC-7721細(xì)胞株進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

表2 黑果菝葜乙酸乙酯部位對(duì)SMMC-7721、A549、MGC80-3細(xì)胞株的細(xì)胞抑制率影響

3.2 黑果菝葜乙酸乙酯部位HPLC指紋圖譜建立 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備10批樣品的供試品溶液，各吸取10 μL，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，文件導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2012.130723)”，設(shè)置H3圖譜為參照?qǐng)D譜，采用多點(diǎn)校正將色譜峰自動(dòng)匹配，得出10批樣品指紋圖譜，見圖1，確定了17個(gè)共有峰，見圖2，以7號(hào)峰白藜蘆醇為指標(biāo)峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，見表3。發(fā)現(xiàn)各共有峰相對(duì)保留時(shí)間較為一致，RSD均小于2.33%，相對(duì)峰面積RSD為67.715%～218.165%，表明不同產(chǎn)地黑果菝葜主要成分的含量具有一定差異性。通過對(duì)比各樣品相似度發(fā)現(xiàn)，5批樣品相似度在0.9以上，見表4，4批在0.8以上，駐馬店市西平縣出山鎮(zhèn)月林村(H5)相似度為0.688。

圖1 10批黑果菝葜乙酸乙酯部位樣品HPLC指紋圖譜

圖2 黑果菝葜乙酸乙酯部位樣品共有峰

表3 10批黑果菝葜乙酸乙酯部位樣品共有峰相對(duì)峰面積

表4 10批不同產(chǎn)地黑果菝葜乙酸乙酯部位相似度

3.3 不同產(chǎn)地黑果菝葜乙酸乙酯部位對(duì)SMMC-7721細(xì)胞抑制率的影響 由表5可知，與對(duì)照組比較，10批黑果菝葜樣品均有抑制腫瘤的作用(P<0.01)。10批樣品進(jìn)行組間比較，南陽市西峽縣雙龍鎮(zhèn)十畝地村(H1)與南陽市西峽縣白羽街道土門社區(qū)壽山(H2)無顯著性差異(P>0.05)，駐馬店市西平縣出山鎮(zhèn)月林村(H5)、南陽市淅川縣上集鎮(zhèn)朝陽社區(qū)范蠡公園(H7)和南陽市西峽縣米坪鎮(zhèn)大莊村(H10)無顯著性差異(P>0.05)。南陽市方城縣二郎廟鎮(zhèn)五神廟村(H3)對(duì)SMMC-7721細(xì)胞抑制效果最好，細(xì)胞抑制率為81.115%。

表5 不同產(chǎn)地黑果菝葜乙酸乙酯部位對(duì)SMMC-7721細(xì)胞抑制率的影響

3.4 黑果菝葜乙酸乙酯部位抗肝癌SMMC-7721譜效關(guān)系分析

3.4.1 偏最小二乘回歸方程的建立 以不同產(chǎn)地黑果菝葜乙酸乙酯部位指紋圖譜各共有峰的峰面積為自變量X，細(xì)胞抑制率為因變量Y，導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件，進(jìn)行偏最小二乘回歸分析，得回歸方程為Y=0.001 4X1+0.001 6X2-0.005 0X3+0.003 7X4+0.002 4X5+0.002 1X6-0.000 3X7+0.000 5X8-0.000 2X9+0.001 1X10+0.000 8X11+0.002 5X12+0.001 5X13-0.000 7X14+0.003 2X15+0.003 0X16+0.000 9X17，偏最小二乘回歸模型回歸系數(shù)見圖3，峰1、2、4、5、6、8、10、11、12、13、15、16、17回歸系數(shù)為正值，其貢獻(xiàn)大小順序?yàn)?絕對(duì)值)4>15>16>12>5>6>2>13>1>10>17>11>8，其余峰的回歸系數(shù)為負(fù)值。

圖3 黑果菝葜抗腫瘤譜效關(guān)系偏最小二乘回歸系數(shù)

3.4.2 變量重要性分析 變量投影重要性(VIP值)分析結(jié)果見圖4，表明S1、S3、S5,S6、S7的VIP值大于1，排序?yàn)镾7>S1>S6>S3>S5，其中，S1、S5、S6與藥效成正相關(guān)，當(dāng)含量增加時(shí)，會(huì)明顯提高細(xì)胞抑制率；模型診斷參數(shù)R2X=0.934，R2Y=0.987，Q2=0.817，表明該回歸模型具有較強(qiáng)的擬合解釋能力和模型預(yù)測(cè)能力。

圖4 各共有峰對(duì)黑果菝葜抗腫瘤活性的變量重要性分析

4 討論

本研究前期對(duì)色譜柱、流動(dòng)相的比例、柱溫以及檢測(cè)波長(zhǎng)等色譜條件進(jìn)行了探索。比較不同廠家的C18色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)能有效的分離化學(xué)成分，且峰形較好。當(dāng)采用乙腈-水體系時(shí)，得到的色譜峰數(shù)量較多且分離度較好。在其他色譜條件相同的情況下，分別設(shè)定柱溫25、30、35、40 ℃，發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高，各色譜峰的保留時(shí)間不斷前移，當(dāng)柱溫為30 ℃時(shí)，色譜峰分離效果好。液相色譜檢測(cè)波長(zhǎng)主要參照白藜蘆醇的范圍，并參考文獻(xiàn)知其為多酚類化合物，波長(zhǎng)330～350 nm[14]，由此并對(duì)樣品進(jìn)行190～400 nm全波長(zhǎng)掃描，考察了在238、290、303、330 nm波長(zhǎng)處的色譜峰，圖譜在330 nm處出峰較多，且峰形較好。

文一惠等[15]發(fā)現(xiàn)金剛藤可抑制SMMC-7721 細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等，但是由于俗名為“金剛藤”的原植物達(dá)14種之多，甚至為不同的科屬，且未明確指出所研究的金剛藤的基源。但從報(bào)道推測(cè)應(yīng)為百合科菝葜屬植物，這一結(jié)果表明菝葜屬植物在抗肝癌方面可能有著一定療效。本研究發(fā)現(xiàn)南陽市方城縣二郎廟鎮(zhèn)五神廟村(H3)樣品對(duì)SMMC-7721細(xì)胞抑制效果最好?！爸T藥所生，皆有境界”中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論歷來注重“環(huán)境因子”對(duì)藥材品質(zhì)的影響，氣候和環(huán)境的多樣性和復(fù)雜性，為藥用植物的多樣性奠定了生態(tài)環(huán)境的基礎(chǔ)。因此可推測(cè)，造成這一現(xiàn)象的主要原因有可能是其生長(zhǎng)的“微環(huán)境”導(dǎo)致了不同產(chǎn)地黑果菝葜化學(xué)成分組成與含量的差異是造成其抗肝癌作用強(qiáng)弱的主要原因。

由于有關(guān)黑果菝葜化學(xué)成分的研究報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)前期也采用LC-MS技術(shù)對(duì)落新婦苷、木犀草苷、黃杞苷、槲皮素、槲皮苷和柚皮素等菝葜屬報(bào)道的常用成分進(jìn)行了比對(duì)指認(rèn)，但僅明確了白藜蘆醇這一成分為黑果菝葜抗肝癌SMMC-7721的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此以此成分作為黑果菝葜的測(cè)定指標(biāo)，對(duì)于評(píng)價(jià)該藥用植物的品質(zhì)具有一定參考意義。本研究建立了黑果菝葜乙酸乙酯部位體外抗腫瘤活性譜效學(xué)模型，得出3個(gè)特征峰與抑制肝癌SMMC-7721作用關(guān)聯(lián)性較大，未來針對(duì)這些特征峰進(jìn)行系統(tǒng)研究與成分解析，以期有助于深入挖掘黑果菝葜抗肝癌SMMC-7721作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，為同類藥材的抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考，為黑果菝葜臨床用藥提供依據(jù)。