司明東， 李新蕊， 李亞楠， 鄭玉光,2， 馬東來(lái),2*， 李 菁*

(1.河北中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，河北 石家莊 050200；2.河北省中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050091)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，其味甘、性溫，有“補(bǔ)氣固表之圣藥”之稱[2-3]。黃芪富含皂苷、多糖、黃酮、氨基酸、亞油酸等多種活性成分，其中黃芪皂苷和黃酮類是主要藥理有效成分群，有多種藥理作用[4-6]。

黃芪屬于藥食同源的中藥材，隨著黃芪有效成分的深入研究，其在臨床和保健品市場(chǎng)需求量急劇增加[7]，但黃芪市場(chǎng)質(zhì)量參差不齊，質(zhì)量堪憂，如何規(guī)范黃芪質(zhì)量等級(jí)評(píng)價(jià)，促進(jìn)行業(yè)發(fā)展成為中藥行業(yè)研究熱點(diǎn)。中藥飲片的等級(jí)劃分能夠有效起到中藥材優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)效果，傳統(tǒng)“辨狀論質(zhì)”僅通過(guò)藥材的外觀、顏色、霉變情況、蟲(chóng)蛀、色澤等進(jìn)行等級(jí)評(píng)價(jià)，如《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》[8]。除藥材本身性狀特征外，其內(nèi)在有效成分也是評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。

本課題組已經(jīng)利用中藥質(zhì)量常數(shù)評(píng)價(jià)方法完成了種子類藥材酸棗仁的等級(jí)劃分[9]。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)市場(chǎng)或飲片企業(yè)收集的28批黃芪藥材的直徑、厚度和質(zhì)量進(jìn)行測(cè)量，并利用高效液相色譜檢測(cè)黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，通過(guò)中藥質(zhì)量常數(shù)法建立黃芪藥材等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)采用偏最小二乘判別法和主成分分析法等化學(xué)計(jì)量方法進(jìn)行驗(yàn)證并篩選出重要特征因子。通過(guò)對(duì)黃芪藥材等級(jí)劃分研究，有利于規(guī)范黃芪藥材市場(chǎng)，實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)，使黃芪藥材產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；ME204E型電子天平(十萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorius公司)；KQ-250DE型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 試劑與藥物 黃芪甲苷(批號(hào)C14J9Q65734)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號(hào)R11O9F71937)對(duì)照品均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，純度均大于98.0%。乙腈、甲酸為色譜純，均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；水為自制超純水。

28批藥材購(gòu)于安國(guó)、亳州中藥材市場(chǎng)和飲片企業(yè)，編號(hào)S1～S24、X1～X4(其中X1～X4為斜切)，具體信息見(jiàn)表1，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院鄭玉光老師鑒定為正品，標(biāo)本保存于河北中醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)標(biāo)本室。

表1 藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分含量測(cè)定

2.1.1 黃芪甲苷 參考文獻(xiàn)[1]，色譜條件為T(mén)hermo Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈-水(32∶68)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；漂移管溫度90 ℃；載氣體積流量2.9 L/min；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 黃芪甲苷HPLC色譜圖

精密移取204 μg/mL對(duì)照品溶液適量，甲醇稀釋至為25、50、75、125、150 μg/mL，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定3次。以黃芪甲苷峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得方程為Y=2 955.5X-839.09(r=0.999 9)。

取藥材(S1)粉末約4.0 g，精密稱定，加甲醇適量，索氏提取法提取4 h后濃縮提取液，加水10 mL，用正丁醇萃取40 mL，共4次，有機(jī)層用氨試液40 mL洗滌，共2次，有機(jī)層干燥后蒸干，殘?jiān)? mL水溶解，取上清液，過(guò)D101型大孔吸附樹(shù)脂柱(內(nèi)徑1.5 cm，柱高12 cm)，依次用50 mL純水、30 mL 40%乙醇、80 mL 70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液蒸干，甲醇溶解并定容于5 mL量瓶中，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。精密吸取20 μL注入液相色譜儀，測(cè)定黃芪甲苷含量。

2.1.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷 參考文獻(xiàn)[1]，色譜條件為T(mén)hermo Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.2%甲酸(B)，梯度洗脫(0～20 min，20%～40% A；20～30 min，40%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計(jì)，應(yīng)不低于3 000。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷HPLC色譜圖

精密移取199 μg/mL對(duì)照品溶液適量，甲醇稀釋至25、50、75、125、150 μg/mL，按上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定3次。以毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得回歸方程為Y=7 696.4X+1 799.7(r=0.999 7)。

取藥材(S1)粉末約1.0 g，精密稱定，精密加入50 mL甲醇，稱定質(zhì)量，水浴回流4 h，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，減壓蒸干后甲醇溶解并定容于5 mL量瓶中，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。精密10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量。

2.2 形態(tài)參數(shù)測(cè)定 按照隨機(jī)原則從藥材中隨機(jī)抽取樣本，每批300片，分為3組，測(cè)定其直徑、厚度、質(zhì)量，并計(jì)算平均半徑(r)、厚度(h)、質(zhì)量(m)。

在游戲中，設(shè)計(jì)了多種游戲場(chǎng)景來(lái)考核學(xué)生的學(xué)習(xí)效果，例如：有任務(wù)場(chǎng)景、闖關(guān)場(chǎng)景、限時(shí)場(chǎng)景等。玩家在游戲中，可以自由選擇進(jìn)入某一場(chǎng)景。通過(guò)在游戲中回答問(wèn)題，獲得或失去一定分?jǐn)?shù)。在游戲的過(guò)程中，如果玩家的分?jǐn)?shù)低于指定的分值時(shí)，游戲即判斷玩家失敗。在游戲中為了提高學(xué)習(xí)效率，對(duì)于玩家回答錯(cuò)誤的問(wèn)題，會(huì)繼續(xù)出現(xiàn)在游戲中，而對(duì)于玩家回答正確的問(wèn)題，則會(huì)被游戲屏蔽，而不再出現(xiàn)。以下圖2是一次玩家回答問(wèn)題的圖示：

2.4 百分質(zhì)量常數(shù) 將最大質(zhì)量常數(shù)設(shè)成100%，其余飲片的百分質(zhì)量常數(shù)計(jì)算公式為百分質(zhì)量常數(shù)=(Ax/Amax)×100%，其中Ax為每批藥材質(zhì)量常數(shù)，Amax為藥材最大質(zhì)量常數(shù)。參考文獻(xiàn)[9,11]，以百分質(zhì)量常數(shù)>80%的藥材為一等飲片，50%～80%為二等飲片，其余為三等飲片。

3 結(jié)果

3.1 指標(biāo)成分含量

3.1.1 黃芪甲苷 在2015年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，黃芪甲苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于0.040%。在本實(shí)驗(yàn)28批藥材中，該成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.035 6%～0.110 8%，差異較大，以S21最高，S10、S12、S15不符合藥典要求，見(jiàn)表2。

表2 28批藥材指標(biāo)成分含量、形態(tài)參數(shù)、質(zhì)量常數(shù)測(cè)定結(jié)果

3.1.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷 2015年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于0.020%。在28批藥材中，該成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.020 0%～0.103 4%，均符合藥典規(guī)定，但差異較大，以S5最高，S7最低，見(jiàn)表2。

3.2 黃芪形態(tài)參數(shù) 表2、圖3顯示，28批藥材平均直徑為1.122～2.394 cm，差異較大，以X2最大，S14最??；平均厚度為0.331～0.438 cm，差異較小，以X1最厚，S13最薄；平均質(zhì)量為0.184～0.848 g，差異較大，以X1最重，S15最輕。

圖3 28批藥材形態(tài)

3.4 化學(xué)計(jì)量學(xué) 在質(zhì)量常數(shù)方法基礎(chǔ)上，采用SIMCA 13.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)[13-14]，以藥材直徑、厚度、質(zhì)量及黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量為原變量，對(duì)28批藥材數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

圖4顯示，初始特征值大于1的2個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率為92.37%，其中第一主成分為82.39%，第二主成分為9.98%，不同等級(jí)能較好地區(qū)分開(kāi)。

圖4 藥材PCA分析圖

圖5顯示，藥材被很好地分為3個(gè)部分，與圖4一致，累積解釋能力參數(shù)R2X、R2Y分別為0.986、0.874，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2為0.833，表示模型穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)能力較好。在0.95的置信區(qū)間內(nèi)，選取VIP值>1.0的成分作為差異性指標(biāo)，進(jìn)一步對(duì)3個(gè)等級(jí)藥材數(shù)據(jù)的差異性進(jìn)行整體分析，結(jié)果見(jiàn)表3，可知毛蕊異黃酮葡萄糖、平均直徑的VIP值均大于1。

表3 各指標(biāo)VIP值

圖5 藥材OPLS-DA分析圖

上述結(jié)果表明，藥材劃分等級(jí)指標(biāo)在化學(xué)成分和品質(zhì)上具有一定差異性，也驗(yàn)證了百分質(zhì)量常數(shù)劃分黃芪等級(jí)的可行性，具體見(jiàn)表4。

表4 28批藥材實(shí)驗(yàn)前后等級(jí)劃分比較

4 討論

傳統(tǒng)評(píng)價(jià)觀點(diǎn)認(rèn)為“黃芪以外皮發(fā)白，內(nèi)心發(fā)黃者為佳”，本研究從安國(guó)和亳州中藥材市場(chǎng)、飲片企業(yè)收集的28批黃芪樣品均符合傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)“外皮發(fā)白，內(nèi)心發(fā)黃”，但由于其內(nèi)在黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖含量較低，20批一等品(市場(chǎng)劃分等級(jí))中有7批樣品按百分照質(zhì)量常數(shù)分級(jí)中被列為二等，這可能與黃芪在種植過(guò)程中過(guò)度“管理”、生長(zhǎng)年限、產(chǎn)地加工切制前浸泡過(guò)久等有關(guān)，野生品和栽培品種也存在一定差異，因而傳統(tǒng)藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)僅以黃芪外觀的粗細(xì)大小來(lái)判斷其等級(jí)是不夠科學(xué)的。本研究所用中藥質(zhì)量常數(shù)等級(jí)評(píng)價(jià)方法是在傳統(tǒng)等級(jí)劃分基礎(chǔ)上，結(jié)合指標(biāo)成分含量對(duì)藥材進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià)，利用黃芪藥材的直徑、厚度、質(zhì)量、黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量5個(gè)指標(biāo)建立其百分質(zhì)量常數(shù)等級(jí)劃分，其中各批次樣品間的百分質(zhì)量常數(shù)在19.55%～100%，能夠較好分出黃芪藥材等級(jí)。最終的分級(jí)結(jié)果顯示28批黃芪樣品中一、二等藥材的平均直徑差異不大，三等藥材較一等藥材直徑小了近1倍，整體上分級(jí)結(jié)果也體現(xiàn)了直徑大者(生長(zhǎng)年限較長(zhǎng))為佳的觀點(diǎn)，提示該方法選取合理，即能夠克服主觀因素，又能更加科學(xué)地體現(xiàn)飲片質(zhì)量。

為了更科學(xué)評(píng)價(jià)黃芪藥材等級(jí)劃分，本實(shí)驗(yàn)在百分質(zhì)量常數(shù)法基礎(chǔ)上，利用PCA分析和OPLS-DA分析以上述5個(gè)指標(biāo)為原變量，28批黃芪藥材較好地分為3個(gè)等級(jí)。同時(shí)運(yùn)用OPLS-DA分析表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、平均直徑和平均質(zhì)量可作為黃芩樣品等級(jí)劃分的標(biāo)記。因此，通過(guò)外觀特征與有效成分相結(jié)合的黃芪等級(jí)評(píng)價(jià)方法，能夠有效地杜絕不法商販把黃芪萃取之后，再烘烤曬干后售賣，保證市場(chǎng)黃芪優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)，進(jìn)一步說(shuō)明質(zhì)量常數(shù)法研究黃芪藥材或飲片等級(jí)劃分的科學(xué)性與客觀性，保證等級(jí)劃分的過(guò)程全程量化，使等級(jí)劃分更易操作與應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)中藥等級(jí)劃分的科學(xué)傳承。

綜上所述，黃芪藥材的中藥質(zhì)量常數(shù)分級(jí)結(jié)果與傳統(tǒng)分級(jí)方式雖然存在一些差異，但該分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)即涵蓋了傳統(tǒng)中藥材或飲片評(píng)價(jià)因素外在形態(tài)，又結(jié)合了現(xiàn)代評(píng)價(jià)因素質(zhì)控指標(biāo)，可以更加全面、科學(xué)地體現(xiàn)藥材質(zhì)量。黃芪藥材或飲片進(jìn)行中藥質(zhì)量常數(shù)等級(jí)劃分，對(duì)于有效控制該藥材質(zhì)量具有重要的實(shí)用價(jià)值，為黃芪市場(chǎng)提供更科學(xué)的評(píng)價(jià)手段。