蔣林含，譚曉霞，李俊，蘇松，李亞玲

1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川瀘州 646000；2西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川瀘州 646000；3西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)科，四川瀘州 646000；4西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州 646000

肝癌發(fā)病率日益增長(zhǎng)，在全球其死亡率居惡性腫瘤第3位[1-2]。在我國(guó)，肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在腫瘤譜中居第4位，死亡率居第3位[3]。2016年，美國(guó)啟動(dòng)“Cancer Moonshot”計(jì)劃，旨在促進(jìn)對(duì)肝癌等腫瘤的預(yù)防、早期診斷、治療及治愈的理解，并基于大量腫瘤分析與數(shù)據(jù)共享發(fā)展，促進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的應(yīng)用[4]。過(guò)去50年，大量的肝癌模型采用細(xì)胞系或基于細(xì)胞系的異種移植，這些模型極大促進(jìn)了對(duì)肝癌發(fā)生機(jī)制的理解及藥物治療的發(fā)展，但細(xì)胞系模型腫瘤與臨床患者腫瘤組織的腫瘤異質(zhì)性及微環(huán)境有所不同，因此，亟待開(kāi)發(fā)新的腫瘤研究技術(shù)與工具來(lái)解決該困境。人源腫瘤異種移植(patient-derived xenograft，PDX)模型是將手術(shù)中獲得的患者腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠上，依靠小鼠提供環(huán)境生長(zhǎng)的異種移植模型。PDX模型保留了原發(fā)腫瘤結(jié)構(gòu)及細(xì)胞與基質(zhì)的相對(duì)比例，增加了動(dòng)物模型與患者的一致性，并保留了不同患者的腫瘤特性，有效反映了患者腫瘤間與腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性[5]。因此，PDX模型可高度再現(xiàn)人肝癌的生物學(xué)特性，為治療提供策略，并可對(duì)藥物進(jìn)行臨床前篩選與評(píng)估，是解決上述困境及實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的重要途徑[6]。本文總結(jié)了構(gòu)建肝癌PDX模型的常用小鼠品系、標(biāo)本制備及移植方式，介紹了4種新型肝癌PDX模型：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的PDX模型、組合模型、肝臟疾病介導(dǎo)的PDX模型及人源化小鼠PDX模型，回顧了肝癌PDX模型在基礎(chǔ)研究與臨床前研究方面的最新進(jìn)展，并對(duì)PDX模型的前景進(jìn)行了展望，以期為肝癌PDX模型的進(jìn)一步優(yōu)化及應(yīng)用提供參考。

1 肝癌PDX模型的構(gòu)建

1.1 常用小鼠品系 為避免小鼠對(duì)人體腫瘤的排斥反應(yīng)，肝癌PDX模型的構(gòu)建一般選用免疫缺陷小鼠，包括多種品系。目前主要有C57BL/6-nu(裸鼠)、CB17-scid[嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)]小鼠、NOD-scid[非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NODSCID)]小鼠、NOD/LtSz-scid Il2rg–/–(NSG)及NOD/Shi-scid Il2rg–/–(NOG)小鼠等，詳見(jiàn)表1。

表1 肝癌PDX模型常用小鼠品系Tab.1 Mouse strains commonly used for PDX models of liver cancer

1.2 肝癌標(biāo)本制備 肝癌組織標(biāo)本可從手術(shù)或穿刺活檢中獲取[7]。剔除肝癌組織內(nèi)的纖維組織及壞死部分，用剪刀剪碎腫瘤組織至1～3 mm3，以套管針接種移植或以18號(hào)針頭吸取0.2 ml腫瘤組織碎片接種移植[8]。腫瘤移植成功與否主要取決于肝癌的侵襲性及全程操作的無(wú)菌性。可將腫塊浸潤(rùn)基質(zhì)膠或?qū)⒔M織碎片與基質(zhì)膠以1:1混合后再種植，可提高腫瘤的種植及生長(zhǎng)效率[9]。

1.3 肝癌移植方式 通過(guò)原位或異位移植將肝癌組織種植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)以建立PDX模型(表2)。

表2 不同肝癌移植方式的特征Tab.2 Methodology to establish PDX models of liver cancer

2 新型肝癌PDX模型

傳統(tǒng)肝癌PDX模型無(wú)法研究腫瘤微環(huán)境與免疫系統(tǒng)的相互作用，耗時(shí)長(zhǎng)且成本高，阻礙了肝癌的基礎(chǔ)研究及個(gè)性化治療，開(kāi)發(fā)更準(zhǔn)確、完善的PDX模型有利于更好地了解肝癌的生物學(xué)特性并推進(jìn)治療的發(fā)展，主要的新型肝癌PDX模型見(jiàn)表3。

表3 新型肝癌PDX模型的特征Tab.3 Characteristics of the novel PDX models of liver cancer

2.1 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的PDX模型 將原發(fā)腫瘤細(xì)胞重新編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，移植到小鼠體內(nèi)，建立誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的PDX模型。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可以在移植前進(jìn)行腫瘤細(xì)胞基因操作，如表達(dá)熒光素酶或熒光蛋白用以追蹤或引入特定的遺傳修飾，從而研究其對(duì)腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的影響[14]。腫瘤的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞也具有腫瘤早期階段的特點(diǎn)，為研究肝癌早期生長(zhǎng)特點(diǎn)及生物標(biāo)志物提供了線索[15]。

2.2 組合模型 原代細(xì)胞系、類(lèi)器官(patientderived organoids，PDO)模型與PDX模型的組合可從多個(gè)途徑探索肝癌的個(gè)性化治療。在對(duì)新鮮腫瘤組織進(jìn)行基因測(cè)序的同時(shí)，建立患者的PDO與PDX模型，并對(duì)腫瘤進(jìn)行多點(diǎn)采樣，可更好地進(jìn)行個(gè)性化治療，還原腫瘤的分子表型、異質(zhì)性并進(jìn)行耐藥性評(píng)估[16]。肝癌原代細(xì)胞系、PDO與PDX組合模型有望在時(shí)間、經(jīng)濟(jì)成本及藥物篩選能力等方面取得平衡。

2.3 肝臟疾病介導(dǎo)的PDX模型 多數(shù)肝癌是在肝損傷背景下發(fā)展而來(lái)的。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見(jiàn)的肝癌類(lèi)型，約占肝癌患者總數(shù)的90%，其中超過(guò)90%的HCC發(fā)生在慢性肝病的背景下。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是HCC發(fā)生的最主要危險(xiǎn)因素，約占50%，其他疾病包括丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)、丁型肝炎病毒(hepatitis D virus，HDV)、酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)及非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)[1]。為了更好地模擬人類(lèi)腫瘤模型，可以將誘導(dǎo)的病毒性肝炎(HBV、HCV)、肝硬化、脂肪性肝病、ALD、NASH、膽汁淤積等模型與肝癌PDX模型結(jié)合。目前已有研究者將HCV相關(guān)性肝癌患者的肝癌組織植入NSG小鼠，建立HCV相關(guān)的HCCPDX模型，雖然移植瘤傳代后無(wú)法檢測(cè)HCV的RNA，但能顯示出與原發(fā)腫瘤非常相似的表型與分子構(gòu)成，分析其腫瘤特異性基因表達(dá)的改變有助于進(jìn)一步改善治療策略[17]。慢性肝臟疾病介導(dǎo)的PDX模型更好地模擬了腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境，是未來(lái)PDX模型發(fā)展的潛在方向。

2.4 人源化小鼠PDX模型 動(dòng)物模型在臨床前抗腫瘤藥物評(píng)價(jià)中發(fā)揮著重要作用，但經(jīng)典的PDX模型采用免疫缺陷小鼠，無(wú)法模擬完整的免疫反應(yīng)，在免疫療法的轉(zhuǎn)化研究中存在著嚴(yán)重的局限性；且由于種屬差異，人與小鼠之間的抗腫瘤藥物作用靶點(diǎn)分子可能不同，小鼠細(xì)胞上不存在相應(yīng)靶點(diǎn)或不能被藥物識(shí)別，故需應(yīng)用人源化小鼠PDX模型以促進(jìn)腫瘤研究及免疫療法的臨床前評(píng)估。人源化小鼠包括人源化免疫系統(tǒng)小鼠及靶點(diǎn)基因人源化小鼠。前者通過(guò)將人類(lèi)造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)及從胎兒臍帶血或其他組織分離出的前體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受亞致死劑量照射的新生小鼠的骨髓中，使其發(fā)育為功能性免疫系統(tǒng)；后者采用基因工程手段對(duì)小鼠的免疫檢查點(diǎn)基因進(jìn)行人源化改造，從而表達(dá)人類(lèi)的靶點(diǎn)分子基因[5]。已有研究者使用人源化小鼠建立了HCC的PDX模型，以研究該環(huán)境下腫瘤變化、免疫反應(yīng)及免疫治療的作用，為肝癌免疫療法的臨床前研究提供了平臺(tái)[18]。人源化小鼠在動(dòng)物模型、免疫腫瘤學(xué)及個(gè)性化治療等方面均是一個(gè)重要的突破，將在未來(lái)的腫瘤研究中被廣泛應(yīng)用[19]。

3 肝癌PDX模型的應(yīng)用研究

3.1 基礎(chǔ)研究

3.1.1 腫瘤生物學(xué)研究 PDX模型是研究肝癌的重要?jiǎng)游锬Ｐ?，但其是否能用于人?lèi)肝癌研究一直是關(guān)注的重點(diǎn)。肝癌PDX模型在連續(xù)傳代后，組織學(xué)分析顯示移植腫瘤仍保留原發(fā)腫瘤組分，且在連續(xù)移植模型中也能檢測(cè)到腫瘤罕見(jiàn)間充質(zhì)成分，說(shuō)明肝癌PDX模型保留了原發(fā)腫瘤的正常結(jié)構(gòu)及功能，可用于原發(fā)腫瘤的組織學(xué)、遺傳學(xué)、生物學(xué)特征及轉(zhuǎn)移行為方面的研究[20]。有研究對(duì)乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病等移植腫瘤進(jìn)行各項(xiàng)生物學(xué)檢測(cè)，也同樣證實(shí)移植腫瘤保持了原代的生物學(xué)特性[21-22]。PDX模型為腫瘤研究提供了穩(wěn)定而準(zhǔn)確的動(dòng)物模型。

3.1.2 腫瘤發(fā)生研究 PDX模型可用于研究參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的細(xì)胞成分。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)假說(shuō)表明，腫瘤細(xì)胞具有內(nèi)在可變性，早期的腫瘤克隆產(chǎn)生了具有遺傳異質(zhì)性的亞克隆后代，由于應(yīng)對(duì)環(huán)境選擇的能力不同，其中一部分快速生長(zhǎng)而其他部分萎縮，腫瘤克隆僅由部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞維持[23]。同樣，當(dāng)腫瘤移植到小鼠體內(nèi)，腫瘤中一部分特定的亞群比其他亞群更易形成腫瘤[24]。這種腫瘤內(nèi)及腫瘤間的可變性會(huì)影響治療效果，而肝癌PDX模型保留了肝癌患者腫瘤最原始的基因克隆結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀基因組學(xué)、組織學(xué)水平及共享信號(hào)通路方面與患者相似[25]，可作為研究腫瘤異質(zhì)性及其發(fā)生發(fā)展的臨床前模型。

3.1.3 腫瘤轉(zhuǎn)移研究 晚期腫瘤患者大多會(huì)出現(xiàn)多發(fā)轉(zhuǎn)移，且可能具有不同程度的抗藥性。有研究者用黑色素瘤[26]及肺癌[27]建立了轉(zhuǎn)移性腫瘤的PDX模型進(jìn)行耐藥性研究并進(jìn)一步證明了其臨床預(yù)測(cè)作用。PDX模型也可用于轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞亞群及分子，如乳腺癌PDX模型可分離出足量的轉(zhuǎn)移起始細(xì)胞(metastasis-initiating cells，MICs)及循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)，用于研究其對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響[28]。肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，遠(yuǎn)期療效并不理想，肝癌轉(zhuǎn)移PDX模型對(duì)研究其機(jī)制及改善預(yù)后具有重要意義。

3.2 臨床前研究 PDX模型在臨床前研究中的作用主要是確定治療靶點(diǎn)并指導(dǎo)臨床治療。此外，EurOPDX、美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(National Cancer Institute，NCI)患者模型存儲(chǔ)庫(kù)、異種移植公共存儲(chǔ)庫(kù)(the public repository of Xenografts，PRoXe)等大規(guī)模PDX模型平臺(tái)的創(chuàng)立，將進(jìn)一步促進(jìn)PDX在藥物研發(fā)及生物標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用[5]；美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室(the Jackson Laboratory)已在其網(wǎng)站上公布了450多種PDX的遺傳信息及組織病理學(xué)信息，并將PDX小鼠用于商業(yè)化使用。我國(guó)亦有計(jì)劃建立自己的PDX模型中心并已建立了肝癌PDX模型數(shù)據(jù)庫(kù)[29-30]。

3.2.1 腫瘤標(biāo)志物研究 肝癌PDX模型有助于識(shí)別特定的腫瘤標(biāo)志物，用于診斷、評(píng)估預(yù)后及靶向治療。PDX保留了HCC中優(yōu)先表達(dá)的分子標(biāo)志物，可用于監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)；亦保留了與原發(fā)腫瘤基因表達(dá)及單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)圖譜的一致性，可用于預(yù)測(cè)藥物的療效；通過(guò)轉(zhuǎn)錄組與基因組分析，可驗(yàn)證腫瘤臨床前研究中的分子標(biāo)志物，并能用于研究肝癌患者的耐藥機(jī)制、藥物篩選及個(gè)性化用藥[25]。利用PDX模型也可評(píng)估肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物在HCC預(yù)后中的價(jià)值[31]。

3.2.2 藥物評(píng)估研究 藥物治療是延長(zhǎng)肝癌患者生存期及治愈肝癌的重要方式，但新藥在成功完成臨床試驗(yàn)后用于臨床的比例只有5%，且在完成前期試驗(yàn)后無(wú)法進(jìn)入后期開(kāi)發(fā)的情況也十分普遍，即許多在臨床前研究中作用顯著的藥物未能證實(shí)對(duì)患者具有足夠的功效。PDX模型可保持患者的腫瘤異質(zhì)性并預(yù)測(cè)治療效果，用于評(píng)估治療藥物的效果，從而正確指導(dǎo)臨床治療[32]。

在肝癌PDX模型中，靶向重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-1(FGFR1)多激酶抑制劑樂(lè)伐替尼(lenvatinib)在高表達(dá)FGFR1的小鼠中顯示出比索拉非尼(sorafenib)更好的治療效果[33]，而樂(lè)伐替尼被批準(zhǔn)為晚期肝癌患者的一線治療方案，證實(shí)了PDX模型的臨床價(jià)值[34]。將PDX模型用于體外高通量篩選抗腫瘤藥物，證實(shí)了氧化磷酸化抑制劑可用于治療具有高水平人類(lèi)婆羅雙樹(shù)樣基因4(SALL4)的肝腫瘤[35]。免疫療法方面，glypican 3(GPC3)-CAR T細(xì)胞抑制了PDX模型中HCC的生長(zhǎng)，在細(xì)胞系基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)了CAR T細(xì)胞療法的有效性[36]。通過(guò)建立肝癌PDX模型觀察貝伐珠單抗(bevacizumab)、雷帕霉素(rapamycin)的療效，發(fā)現(xiàn)貝伐珠單抗與雷帕霉素聯(lián)合用藥比單一用藥的效果更佳[37]。我國(guó)學(xué)者利用肝癌患者術(shù)后腫瘤組織建立肝癌PDX模型，同時(shí)對(duì)行肝右葉部分切除術(shù)、膽囊切除術(shù)后接受索拉非尼單藥治療的患者進(jìn)行臨床觀察，發(fā)現(xiàn)患者于術(shù)后6個(gè)月出現(xiàn)肝癌復(fù)發(fā)，且伴腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這與建立的肝癌PDX模型藥效學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果相似，很好地反映了藥物在個(gè)體化患者中的作用，有望為肝癌患者個(gè)體化治療帶來(lái)新的突破[38]。

4 總結(jié)與展望

肝癌PDX模型保留了患者原發(fā)腫瘤的基本特征，以體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并支持體外實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)，架起了肝癌基礎(chǔ)研究與臨床研究之間的橋梁，在臨床前評(píng)估、指導(dǎo)治療及預(yù)后預(yù)測(cè)等方面均具有重要意義。但是，肝癌PDX模型也具有一定局限性，包括腫瘤患者來(lái)源的間質(zhì)被小鼠間質(zhì)細(xì)胞替代、成瘤時(shí)間長(zhǎng)、成本投入大、缺乏免疫系統(tǒng)等。肝臟疾病介導(dǎo)的PDX模型進(jìn)一步縮小了腫瘤微環(huán)境的差異，人源化PDX模型更準(zhǔn)確地描述了人肝癌的生理學(xué)特性，但這些新型肝癌PDX模型不僅需要克服現(xiàn)有技術(shù)局限，而且成本高昂，制作耗時(shí)，并不利于肝癌個(gè)性化治療的發(fā)展。為減少建立模型所需的時(shí)間及經(jīng)濟(jì)成本，有必要進(jìn)一步改進(jìn)并優(yōu)化當(dāng)前的建模技術(shù)，以更好地模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境與腫瘤的相互作用，建立更優(yōu)化的藥物篩選途徑，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療與精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的目標(biāo)。