袁波，宋丹丹，吳燕，俞鶯，譚城

1無(wú)錫市第五人民醫(yī)院皮膚性病科，江蘇無(wú)錫 214011；2江南大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚性病科，江蘇無(wú)錫 214000；3江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，江蘇鎮(zhèn)江 212013；4江蘇省中醫(yī)院皮膚科，南京 210029

尋常型銀屑病是一種易復(fù)發(fā)的慢性免疫炎癥性皮膚病，臨床主要表現(xiàn)為紅色丘疹、斑塊，可發(fā)生于全身，最常見于四肢伸側(cè)和骶尾部，具有家族遺傳傾向，常伴發(fā)代謝綜合征[1]，其確切病因目前尚未明確，可能與遺傳、免疫因素有關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖是最易促發(fā)或加重銀屑病的因素之一，二者在基因水平上存在關(guān)聯(lián)[3]。脂肪因子chemerin是肥胖相關(guān)炎癥的生物標(biāo)志物，屬于多功能性蛋白質(zhì)，在免疫細(xì)胞趨化、脂肪細(xì)胞代謝及血糖穩(wěn)態(tài)過程中起著重要作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，chemerin在銀屑病患者血清中異常表達(dá)[5]。尋常型銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖分化異常，而Sprouty1與肌肉干細(xì)胞的增殖、分化有關(guān)，可能是角質(zhì)形成細(xì)胞的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子[6]。目前關(guān)于銀屑病患者血清中chemerin的研究較多，但其皮損組織中chemerin、Sprouty1的相關(guān)研究較少。本研究旨在分析尋常型銀屑病患者皮損組織中chemerin、Sprouty1的表達(dá)與銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(psoriasis area and severity index，PASI)的相關(guān)性，以期為尋常型銀屑病的發(fā)病機(jī)制和治療研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年2月－2020年11月于無(wú)錫市第五人民醫(yī)院和江南大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚性病科門診接受治療的68例尋常型銀屑病患者作為實(shí)驗(yàn)組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國(guó)銀屑病診療指南(2018完整版)》[7]的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡22～61歲；(3)自愿參與本研究；(4)近1個(gè)月未使用免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)心、腦、肝、腎等器官功能嚴(yán)重障礙者；(2)合并其他皮膚疾病者；(3)合并類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、系統(tǒng)性硬化、肌炎、強(qiáng)直性脊柱炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)等其他免疫性疾病者。以同期在兩院體檢的68名健康者作為對(duì)照組。本研究符合《赫爾辛基宣言》相關(guān)準(zhǔn)則，通過無(wú)錫市第五人民醫(yī)院和江南大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(JNDXFSYYLL 2018-006)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 免疫組化試劑盒購(gòu)自上海莼試生物技術(shù)有限公司；二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒購(gòu)自上?；蚩萍加邢薰?；Trizol試劑購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；chemerin抗體、Sprouty1抗體、內(nèi)參3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒、Western blotting檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。XHC-SV1型顯微鏡購(gòu)自北京東方華測(cè)科學(xué)技術(shù)中心；LWD300-38LFT型無(wú)窮遠(yuǎn)倒置熒光顯微鏡購(gòu)自西安測(cè)維光電技術(shù)有限公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自北京友儀四方科技發(fā)展有限公司。

1.2.2 標(biāo)本采集與處理 采集尋常型銀屑病患者軀干或四肢的皮損組織及健康者的正常皮膚組織各1.0 cm×0.5 cm×1.5 cm，分成3份，1份采用10%多聚甲醛溶液固定，脫水、石蠟包埋、切片(厚4 μm)，行免疫組化檢測(cè)，余2份分別于–80 ℃液氮中保存，行Western blotting和RT-PCR檢測(cè)。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)皮膚組織中c h e m e r i n、Sprouty1蛋白的表達(dá)情況 將切片脫蠟水化，室溫下滴加3% H2O2溶液，避光孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min×3次，分別滴加chemerin抗體(1:200)、Sprouty1抗體(1:100)，4 ℃孵育16 h；加入生物素標(biāo)記的二抗(1:100)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次；滴加辣根標(biāo)記液，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次；DAB顯色40 s，蘇木精復(fù)染2 min，95%乙醇置換去水，中性樹膠封片，鏡檢，拍照觀察chemerin、Sprouty1的表達(dá)情況。

1.2.4 Western blotting檢測(cè)皮膚組織中chemerin、Sprouty1蛋白相對(duì)表達(dá)量 提取皮損組織和正常皮膚組織蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，用10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH為8.3)洗滌，分別加入兔抗chemerin(1:100)、Sprouty1(1:100)、GAPDH(1:100)一抗過夜，Tris-HCL緩沖液洗滌；加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)二抗(1:200)，2 h后洗膜，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)底物顯影后，利用分子成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)皮膚組織中chemerin、Sprouty1 mRNA相對(duì)表達(dá)量 將凍存組織研磨后用Trizol試劑提取總R N A，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度、純度及完整性。參照RT-PCR試劑盒說明書步驟擴(kuò)增cDNA，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后60 ℃延伸5 min，4 ℃保存。每個(gè)樣品的Ct值以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行校正，采用2–ΔΔCt法計(jì)算chemerin、Sprouty1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列來自Sanger數(shù)據(jù)庫(kù)，由上海賽百勝基因技術(shù)有限公司合成。Chemerin引物：正義5'-CCCGGCTTCAGGATTTAC-3'，反義3'-GCTGGACCATGACTGAGTTG-5'；Sprouty1引物：正義5'-ATGGATCCCCAAGGTCAACA-3'，反義3'-CGAGGAGCAGGTCTTCCCAC-5'；β-actin引物：正義5'-AAGTATGACAACAGCCTCAAG-3'，反義3'-TCCACGATACCAAAGTTGTC-5'。

1.3 病情評(píng)估 采用PASI[8]對(duì)患者病情進(jìn)行評(píng)估。由同一專家分別對(duì)患者的紅斑(E)、鱗屑(D)、浸潤(rùn)(I)程度和皮疹面積進(jìn)行記錄，并計(jì)算PASI值。PASI評(píng)分(h)=0.1×(Eh+Dh+Ih)評(píng)分×A；PASI評(píng)分(u)=0.2×(Eu+Du+Iu)評(píng)分×A；PASI評(píng)分(t)=0.3×(Et+Dt+It)評(píng)分×A；PASI評(píng)分(i)=0.4×(Ei+Di+Ii)評(píng)分×A；PASI總分=PASI評(píng)分(h)+PASI評(píng)分(u)+PASI評(píng)分(t)+PASI評(píng)分(i)。其中h、u、t、i分別代表頭部、上肢、軀干、下肢，A表示皮損面積。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)分析法進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較 實(shí)驗(yàn)組男39例，女29例，年齡25～61歲；對(duì)照組男35例，女33例，年齡22～57歲。兩組性別、年齡、體重指數(shù)等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 兩組尋常型銀屑病患者一般資料比較Tab.1 Comparison of general information between psoriasis vulgaris patients of the two groups

2.2 尋常型銀屑病患者的臨床表現(xiàn) 68例尋常型銀屑病患者中，37例(54.4%，37/68)皮損發(fā)生在上肢，其中19例(51.4%，19/37)累及頭皮；余31例(45.6%，31/68)皮損發(fā)生在下肢，其中24例(77.4%，24/31)累及背部，皮損大小不一，以紅色斑塊、結(jié)節(jié)為主，上層覆蓋厚層銀白色鱗屑。

2.3 兩組皮膚組織中chemerin、Sprouty1蛋白表達(dá)情況 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，兩組皮膚組織中均有chemerin、Sprouty1蛋白表達(dá)。Chemerin蛋白在實(shí)驗(yàn)組皮損脂肪組織中呈高表達(dá)，在對(duì)照組皮下脂肪組織中少量表達(dá)；Sprouty1蛋白在實(shí)驗(yàn)組皮損顆粒層細(xì)胞的細(xì)胞膜中少量表達(dá)，在對(duì)照組表皮全層細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中呈高表達(dá)(圖1)。

圖1 兩組皮膚組織中chemerin、Sprouty1蛋白表達(dá)情況(免疫組化×200)Fig.1 Expressions of chemerin and Sprouty1 proteins in skin tissues of the two groups (Immunohistochemistry ×200)

2.4 兩組皮膚組織中chemerin、Sprouty1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 RT-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組皮膚組織中chemerin mRNA (1.478±0.14vs. 0.858±0.08，P<0.001)和蛋白(1.138±0.12vs.0.789±0.06，P<0.001)相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，Sprouty1 mRNA(0.837±0.04vs. 1.346±0.09，P<0.001)和蛋白(0.646±0.05vs. 1.212±0.12，P<0.001)相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(圖2)。

圖2 兩組皮膚組織中chemerin、Sprouty1蛋白表達(dá)情況(Western blotting)Fig.2 Expressions of chemerin and Sprouty1 proteins in skin tissues of the two groups (Western blotting)

2.5 皮損組織中chemerin、Sprouty1蛋白相對(duì)表達(dá)量與PASI評(píng)分的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，68例尋常型銀屑病患者皮損組織中chemerin蛋白相對(duì)表達(dá)量與PASI評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.536，P<0.05)，Sprouty1蛋白相對(duì)表達(dá)量與PASI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=–0.619，P<0.05，圖3)。

圖3 尋常型銀屑病患者皮損組織中chemerin、Sprouty1蛋白相對(duì)表達(dá)量與PASI評(píng)分的相關(guān)性Fig.3 Correlation of the relative expression of chemerin and Sprouty1 protein in skin lesions to PASI score

3 討 論

尋常型銀屑病是銀屑病最常見的類型之一，易伴發(fā)多種代謝性疾病，可能與患者的不良生活方式及疾病本身的多種因素有關(guān)。尋常型銀屑病與代謝性疾病存在共同的危險(xiǎn)因素和發(fā)病機(jī)制，其中肥胖是代謝綜合征發(fā)生的源頭，多項(xiàng)研究顯示，尋常型銀屑病患者的肥胖率高于普通人群，且PASI評(píng)分與體重指數(shù)呈正相關(guān)，而肥胖常伴隨著脂肪的堆積，可增加炎性脂肪細(xì)胞因子的分泌，引起胰島素抵抗及相關(guān)并發(fā)癥[9]。

Chemerin是脂肪因子家族的新成員，在人脂肪組織中呈高表達(dá)，具有趨化白細(xì)胞的功能，可募集表達(dá)chemerin受體的炎性細(xì)胞，參與代謝綜合征及相關(guān)疾病的病理生理過程[10]。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖人群血清chemerin水平與白細(xì)胞介素-6(IL-6)等炎性因子關(guān)系密切，且可影響與銀屑病發(fā)病相關(guān)的樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等固有免疫效應(yīng)細(xì)胞，被認(rèn)為是銀屑病早期病變的標(biāo)志物[11]。楊雪松等[12]分析了尋常型銀屑病患者血清chemerin水平與PASI評(píng)分的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)PASI評(píng)分與血清chemerin水平存在正相關(guān)關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，銀屑病患者皮損組織與健康對(duì)照皮膚組織中均有chemerin的表達(dá)，但銀屑病患者皮損組織中chemerin蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，且chemerin蛋白相對(duì)表達(dá)量與PASI評(píng)分呈正相關(guān)，與余澤瑩等[13]的研究結(jié)果相似，提示chemerin蛋白可能參與了尋常型銀屑病發(fā)病機(jī)制中的免疫應(yīng)答及表皮異常增殖。

研究顯示，銀屑病是由角質(zhì)形成細(xì)胞與浸潤(rùn)免疫細(xì)胞之間的相互作用引起的，但影響角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的因素及其與銀屑病發(fā)病機(jī)制的關(guān)系仍不明確[14]。Sprouty1蛋白是MAPK信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，可負(fù)性調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動(dòng)和存活[15]。Weng等[16]發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者皮損處MAPK活性明顯升高，被激活的MAPK發(fā)生磷酸化，可在表皮中促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，從而參與銀屑病的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，銀屑病患者皮損組織與健康對(duì)照皮膚組織中均有Sprouty1的表達(dá)，但銀屑病患者皮損組織中Sprouty1蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，且Sprouty1蛋白相對(duì)表達(dá)量與PASI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，與李錦意等[17]的研究結(jié)果基本一致，提示Sprouty1蛋白在角質(zhì)形成細(xì)胞與銀屑病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，尋常型銀屑病皮損組織中chemerin、Sprouty1蛋白異常表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量與PASI評(píng)分存在相關(guān)性，該結(jié)果為開展尋常型銀屑病的通路和靶向治療研究提供了理論基礎(chǔ)，但后續(xù)仍需進(jìn)一步探究chemerin及Sprouty1蛋白在銀屑病皮損組織中發(fā)揮調(diào)控作用的具體機(jī)制，以期為銀屑病的治療提供新的方向。